文摘

背景。以前,我们报道,IL-33充当保护调制器在葡聚糖硫酸酯钠- (DSS)诱导慢性结肠炎结肠固有层和通过抑制Th17细胞反应IL-33诱导B细胞(Bregs)监管和调节性T细胞亚群)肠系膜淋巴结(mln)小鼠DSS-induced急性结肠炎。此外,我们推测IL-33将推动Treg或Breg反应导致的衰减DSS-induced慢性结肠炎。所以,我们调查的角色IL-33 Bregs和MLN的亚群DSS-induced慢性结肠炎小鼠。方法。IL-33是由腹腔内注射小鼠DSS-induced慢性结肠炎。临床症状、结肠长度和组织学变化确定。细胞因子是由ELISA测定的生产。T细胞和B细胞子集通过流式细胞仪测定。信使rna的转录因子的表达是通过定量实时PCR来衡量的。结果。我们表明,IL-33治疗增加Breg和Treg反应MLN的小鼠DSS-induced慢性结肠炎。此外,IL-33治疗也能减少Th17细胞响应MLN的小鼠DSS-induced慢性结肠炎。结论。我们的数据提供了明确的证据表明,IL-33 DSS-induced慢性结肠炎具有保护作用,增加Breg密切相关,Treg反应MLN的老鼠以及抑制Th17细胞反应。

1。介绍

炎症性肠病(IBD),包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)是一种慢性炎症状态的事件,引发了异常的先天和适应性免疫对菌群在遗传主机1]。现有证据表明,CD的特点是Th1 / Th17响应(2- - - - - -5),而加州大学相关联的生产过剩th2型细胞因子如IL-5和IL-13 [6- - - - - -8]。葡聚糖硫酸酯钠- (DSS)诱导慢性结肠炎的特点是主要Th17 / Th1-mediated免疫反应和粘膜炎症相似重要免疫学方面的CD (9- - - - - -11]。

IL-33,也称为interleukin-1家庭成员11 (IL-1F11),被认定为小说il - 1家族的成员。IL-33合成为30 kDa前体蛋白可以通过caspase-1裂解成为18 kDa成熟蛋白(12]。IL-33表达在巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肠上皮细胞(13- - - - - -15]。通过heteromeric IL-33信号受体,由ST2L(或ST2)和IL-1R附属蛋白(IL-1RAcP) [16]。ST2主要表达在活化Th2细胞和亚群17]。

多项研究已经表明,IL-33诱导在IBD患者的肠黏膜和IL-33多态性与炎症性肠病(有关18- - - - - -21]。然而,IL-33在炎症性肠病的主要作用是复杂的,有待阐明。Th2-mediated加州大学及其动物模型,IL-33致病作用与2型免疫反应(22- - - - - -24]。然而,通过切换Th17 Th1 / th2型免疫反应,IL-33可以降低CD及其动物模型的发展,这主要是由Th17和Th1反应(25- - - - - -27]。上述观察结果表明IL-33参与炎症性肠病的发病机制。

我们曾表明,IL-33缓解DSS-induced慢性结肠炎结肠固有层(通过抑制Th17细胞反应28]。此外,我们之前的数据表明,IL-33治疗导致显著恶化的临床和病理学特点DSS-induced急性结肠炎提高Th2细胞反应但增加调节性T细胞和监管B细胞反应的肠系膜淋巴结(mln) [29日]。尽管取得了这些进步,尚不清楚IL-33扮演了一个角色在MLN DSS-induced慢性结肠炎的发展。我们推测IL-33将推动Treg或Breg反应导致的衰减DSS-induced慢性结肠炎。此外,DSS-induced急性结肠炎被称为UC模型,和DSS-induced慢性结肠炎一直视为Th1-type结肠炎动物模型类似CD;mln作为效应器组织在胃肠道炎症30.),所以我们试图阐明IL-33的角色在MLN DSS-induced慢性结肠炎的发展。

2。材料和方法

2.1。动物

特定的无菌雄性C57BL / 6小鼠年龄7周,体重20 - 22 g购自北京HFK生物科技有限公司(中国,北京)。老鼠维护和培育特定的无菌条件下(温度24 - 25°C,湿度70% - -75%,12 h光/ 12 h黑暗照明方案)。研究协议批准由中国医科大学动物保健和使用委员会。

2.2。鼠标IL-33重组蛋白的生产和评估的活动

rIL-33表达和净化,去除内毒素的的生物活性和评估rIL-33进行如前所述[28]。

2.3。慢性结肠炎引起的DSS的归纳和评价

诱导慢性结肠炎和rIL-33管理局进行了如前所述[28]。结肠炎的严重性评估疾病活动指数(DAI)使用基于减肥,大便隐血,便血;表中描述的分数1。牺牲在30天之后,冒号被移除和他们的长度测量。同时,MLN细胞提取通过流式细胞仪分析,定量实时PCR和ELISA。

表1
疾病活动指数图。
2.4。组织学评估结肠炎

结肠标本和4%多聚甲醛固定石蜡和嵌入式,和部分4μ米厚被苏木精和伊红染色法评价结肠组织学。结肠炎的程度是评估如前所述28]。

2.5。MLN细胞隔离和刺激

mln从个人收集的老鼠在无菌条件下在冰冷的PBS 10%胎牛血清的边后卫。然后,淋巴结温柔地中断了无菌注射器柱塞和尼龙细胞过滤器过滤(40μ米网;美国BD生物科学,圣何塞,CA)。收集细胞在1500转离心后在室温下为5分钟。

MLN细胞(5×105/)培养在96孔板(猎鹰;BD生物科学)和0.2毫升RPMI1640(补充了青霉素、链霉素的边后卫10%和1%)和刺激anti-CD3 (10μ圣地亚哥g / mL eBioscience美国CA)和anti-CD28 (1μg / mL, eBioscience)马伯48 h。

2.6。细胞因子分析,酶联免疫吸附试验(ELISA)

细胞因子浓度测定用鼠标免疫测定试剂盒(研发系统)根据制造商的指示。il - 6的水平,IL-23, il - 1β、IL-12p70和TNF -α测量在上层清液anti-CD3 / antiCD28马伯刺激。干扰素-的水平γ、IL-17A、il - 10、il - 4、IL-5 IL-13测量在上层清液有或没有anti-CD28 / anti-CD3马伯刺激。

2.7。确认mRNA表达的转录因子的定量实时PCR

定量实时PCR进行根据前面描述的方法(28]。简单地说,从细胞分离提取的总RNA MLN使用RNAiso +(豆类,大连,中国)。使用生成的第一链cDNA是PrimeScript™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(完美的实时,豆类)。PCR混合物准备利用SYBR®预混料交货Taq™(Tli RNaseH加上,豆类)和表中列出的引物之一2。

表2
qPCR引物序列。
2.8。流式细胞术分析

流式细胞术分析根据前面描述的方法(28]。短暂,细胞分离MLN (MLN细胞)孵化Fcγreceptor-blocking马伯(CD16/32;2.4 g2, BD生物科学)15分钟在4°C。表面抗原检测,细胞被标记的单克隆抗体Gr-1 (RB6-8C5 BD生物科学),F4/80 (BM8 BD生物科学),αβ细胞受体(BD BioLegend h57 - 597),γδ细胞受体(GL3 BioLegend) NK1.1 (PK136 BioLegend), CD4 (RM4-5 BD生物科学),CD44 (IM7 BD生物科学)、CD25 (PC61 BioLegend) B220 (RA3-6B2 BioLegend), CD19 (MB19-1 BioLegend) 30分钟在4°C。

细胞内细胞因子染色,细胞分离MLN (MLN细胞)与ionomycin刺激(1毫克/毫升;Sigma-Aldrich)和PMA (25 ng / mL;Sigma-Aldrich) 5 h 37°C,与brefeldin(10毫克/毫升;Sigma-Aldrich)后加1 h。然后,细胞被固定和permeabilized固定/透化作用工作20分钟解决方案在4°C与单克隆抗体对干扰素孵化——紧随其后γ(XMG1.2 BD生物科学),IL-17A (TC11-18H10.1 BD生物科学)和il - 10 (JES5-16E3 BD生物科学)。分析了细胞使用Cytofix / Cytoperm +工具包。

2.9。统计分析

统计学意义是由学生的计算 - - - - - -测试使用棱镜软件(GraphPad棱镜软件,拉霍亚,CA)。差异与 0.05被认为是具有统计学意义的价值观。

3所示。结果

3.1。在老鼠身上IL-33治疗变弱DSS-Induced慢性肠道炎症

直接评估IL-33结肠炎发展的角色,我们管理重组IL-33 ip DSS-administered老鼠中描述的材料和方法。如图1(一)IL-33-treated老鼠显示缓解的肠道炎症的身体减肥的衰减和戴明显降低分数而接受pbs老鼠。宏观检查,接受pbs小鼠的结肠明显短于IL-33-treated的老鼠在30天(图1 (b))。同时,组织学检查显示,隐窝破坏,溃疡和炎症细胞的浸润明显加剧的冒号接受pbs老鼠与IL-33-treated老鼠。冒号的组织学得分显著高于接受pbs老鼠比IL-33-treated老鼠(图1 (c))。这些数据表明一个至关重要的有益影响的IL-33 DSS-induced慢性结肠炎小鼠。

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图1
IL-33治疗变弱DSS-induced C57BL / 6小鼠慢性结肠炎。小鼠口服2% DSS在饮用水处理诱导结肠炎中描述的材料和方法。(一)体重和疾病活动指数每日观察。30天,(b)的宏观变化,结肠长度、和(c)组织学评分(原始的放大,×200)进行了分析。数据显示每组的平均数±标准差( )从代表三个独立的实验( , )。
3.2。IL-33 MLN改变免疫细胞的积累

没有显著差异,中性粒细胞的百分比和绝对数量(CD11b+F4/80−Gr-1+)和NK细胞(NK1.1+αβ细胞受体−)IL-33-treated MLN的老鼠和接受pbs老鼠。如图2巨噬细胞的百分比和绝对数量(CD11b+Gr-1−F4/80+)在MLN IL-33-treated慢性结肠炎组显著高于对照组。与对照组相比,NKT (NK1.1的绝对数量+αβ细胞受体+),γδT细胞在IL-33-treated MLN显著降低慢性结肠炎集团,而NKT (NK1.1的百分比+αβ细胞受体+),γδ两组T细胞没有表现出差异。我们还研究了T细胞的数量在MLN子集。CD4细胞的百分比+CD44+CD4细胞+T-MLN细胞的老鼠接受IL-33高于控制老鼠,但CD4的绝对数量+和CD4+CD44+T-MLN IL-33-treated老鼠的细胞减少和控制老鼠。

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(b)
(b)
图2
淋巴细胞的子集MLN IL-33和接受pbs的小鼠DSS-induced慢性结肠炎被流式细胞术分析。(一)中性粒细胞(CD11b的频率+Gr1一起+F4/80−)、巨噬细胞(CD11b+Gr1一起−F4/80+),CD4+T细胞CD4+CD44+T细胞(效应T细胞),γδT细胞(γδ细胞受体),NK细胞(NK1.1+),或者(NK1.1 NKT细胞+ αβ细胞受体+)在细胞分离后30天MLN DSS。(b)以上细胞的绝对数量在同一天。数据显示每组的平均数±标准差( )从代表三个独立的实验。统计上显著差异( , ,或 )。
3.3。MLN IL-33改变了细胞因子

如图3、测量MLN的文化上层清液中细胞因子的浓度没有任何刺激的il - 6水平的体现,il - 1β,IL-23大幅减少IL-33-treated慢性结肠炎组与对照组相比。此外,低水平的TNF -α和IL-12p70被检测到,虽然没有不可或缺的两组之间的差异(数据没有显示)。干扰素-水平γanti-CD3和anti-CD28马伯刺激和没有任何刺激明显降低慢性结肠炎IL-33-treated组与对照组相比。IL-17A水平与anti-CD3 anti-CD28马伯刺激明显降低IL-33-treated慢性结肠炎组与对照组相比,虽然类似的浓度IL-17A没有任何刺激这两组(图中观察到3)。il - 4水平和anti-CD3 IL-5 anti-CD28马伯刺激和没有任何刺激的显著增加IL-33-treated慢性结肠炎组与对照组相比(图3)。IL-13水平明显增加和anti-CD3 anti-CD28马伯刺激,和类似的结果观察到没有任何刺激的上层清液MLN的IL-33-treated慢性结肠炎组与对照组相比(图3)。

(一)
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(b)
(b)
图3
细胞因子生产的淋巴细胞分离MLN IL-33和接受pbs的小鼠DSS-induced结肠炎。(一)MLN细胞有或没有anti-CD3 anti-CD28马伯(CD3 / CD28)刺激。(b) MLN细胞没有任何刺激。数据显示每组的平均数±标准差( )获得代表三个独立的实验,被一个学生价值 - - - - - -测试( , ,或 )。
3.4。IL-33转变MLN Th细胞介导免疫反应的小鼠DSS-Induced慢性结肠炎

此外,我们发现干扰素-γ或IL-17A-producing CD4+T细胞的MLN IL-33-treated和治疗慢性结肠炎小鼠。有一个关键的下降百分比和绝对IL-17A-producing CD4的数量+T细胞IL-33-treated MLN的老鼠相比,模型小鼠后PMA / ionomycin刺激。干扰素-的百分比和绝对数字γ第CD4+T细胞在MLN显示这两个组之间无显著差异(图4)。此外,有一个显著的减少IL-17A的频率+干扰素-γ+double-producing CD4+T细胞IL-33-treated MLN的小鼠,接受pbs的老鼠相比,这些细胞的绝对数量的大幅减少(图4)。此外,与PBS治疗慢性结肠炎小鼠相比,这些老鼠IL-33处理显示,极大的减少了ROR——的表达γt mrna。这些结果表明,IL-33可能抑制Th17细胞反应的影响的MLN DSS-induced慢性结肠炎小鼠。

(一)
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图4
人口cytokine-producing MLN的T细胞IL-33——接受pbs小鼠DSS-induced结肠炎被流式细胞术分析。(一)频率和CD4的绝对数量+IL-17A+和CD4+IL-17A+干扰素-γ +T细胞的MLN IL-33——接受pbs小鼠DSS-induced慢性结肠炎。(b) cytokine-producing CD4的绝对数量+IL-17A+和CD4+IL-17A+干扰素-γ +MLN的T细胞,没有刺激。数据显示每组的平均数±标准差( )从代表三个独立的实验。统计上显著差异( , )。
3.5。IL-33提高调节性T细胞(Treg)和监管B细胞(Breg)反应在MLN DSS-Induced慢性结肠炎

亚群和Bregs可以保护小鼠免受DSS-induced肠道炎症(31日,32]。接下来,我们调查的影响IL-33 Treg和MLN Breg反应的小鼠DSS-induced慢性结肠炎。百分比和绝对CD25-expressing T细胞(CD4细胞的数量+CD25+)和CD25-expressing B细胞(B220+CD25+)T-LPLs高出大大MLN的IL-33-treated慢性结肠炎组比对照组(数字5(一个)和6(一))。此外,有一个大幅增加的百分比和绝对CD4的数量+il - 10+T细胞和CD19+il - 10+细胞IL-33-treated慢性老鼠而控制老鼠(数字5 (b)和6 (b))。il - 10水平与anti-CD3 anti-CD28马伯刺激和没有任何刺激显著增加在IL-33-treated慢性结肠炎组与对照组相比(图3(一个))。此外,与PBS治疗慢性结肠炎小鼠相比,这些老鼠IL-33处理显示,Foxp3 mrna的表达显著增加(图7)。这些结果提供的证据表明,IL-33扮演着一个重要的角色在移植Treg和Breg MLN的反应在我们的实验系统。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
IL-33 Treg MLN的反应增加小鼠DSS-induced慢性结肠炎。(一)频率和CD4的绝对数量+CD25+MLN的T细胞。(b)和cytokine-producing CD4的绝对数量的百分比+il - 10+MLN的T细胞在淋巴细胞,没有刺激。数据显示每组的平均数±标准差( )获得代表三个独立的实验,被一个学生价值 - - - - - -测试。( , ,或 )。
(一)
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(b)
(b)
图6
IL-33提升Breg反应MLN的小鼠DSS-induced慢性结肠炎。(一)频率和B220的绝对数量+CD25+MLN的细胞。(b)的百分比和绝对数字cytokine-producing CD19+il - 10+细胞MLN有或没有刺激。数据显示每组的平均数±标准差( )获得代表三个独立的实验,被一个学生价值 - - - - - -测试。( , ,或 )。

图7
MLN的mRNA转录因子的表达变化。数据显示每组的平均数±标准差( )获得代表三个独立的实验,被一个学生价值 - - - - - -测试( , )。

4所示。讨论

几年前,加州大学指定为Th2-mediated疾病根据生产IL-5和IL-13升高,而T细胞在CD生产过量的Th1-type细胞因子、干扰素等γ和il - 1233- - - - - -35]。然而,Th1 / Th2范式与发现Th17(修改36]。DSS-induced结肠炎模型被广泛使用,因为它的简单性和许多表型相似性与人类炎症性肠病(37]。DSS-induced急性结肠炎的特点是腹泻,粪便血腥,减肥,组织学炎症和溃疡的照片在加州大学(38]。此外,自适应Th2细胞介导的免疫应答中发挥必要的作用DSS-induced急性结肠炎的发病机制(39]。然而,高Th1细胞因子(白介素、干扰素γ、il - 1、TNF -α)和Th17细胞因子(IL-17)作品观察结肠的DSS-induced慢性结肠炎模型。不同的细胞因子在慢性阶段之间的DSS结肠炎被发现DSS-induced结肠炎急性和慢性阶段,这反映了DSS-induced急性结肠炎应该称为UC模型和DSS-induced慢性结肠炎应该视为Th1 / Th17-type结肠炎动物模型类似CD。

Th17通路被证明是非常重要的在人类炎症性肠病的发病机制40]。此外,最近的研究表明,Th17细胞还负责DSS-induced慢性结肠炎的发展(9,11]。有几项研究报道,IL-33抑制Th17响应在自身免疫性疾病41- - - - - -43]。我们的研究结果还表明,Th17细胞的百分比和绝对数量在IL-33-treated MLN明显降低小鼠比接受pbs老鼠。此外,我们发现ROR——的水平γt,定向Th17细胞的分化(44),较低的MLN IL-33-treated老鼠比接受pbs老鼠。IL-23促进肠道Th17细胞积累和增强IL-17A的出现+干扰素-γ+人口的T细胞通过直接信号成T细胞(45]。因此,IL-33治疗减少IL-23生产DSS-treated MLN的老鼠,这表明IL-33抑制Th17反应取决于IL-23信号。然而,我们没有发现IL-33抑制Th17响应MLN的小鼠DSS-induced急性结肠炎(29日]。最合理的解释我们的观察是,Th17水平响应DSS-induced结肠炎急性期的很低,但在慢性阶段。

亚群扮演着一个关键的角色在炎症性肠病的发病机制,以及在其他自身免疫性疾病(46- - - - - -49]。亚群调节免疫反应,依赖于il - 10和转录因子的表达Foxp3 [50]。il - 10可能发挥重要作用的抑制功能亚群(51]。最近的一项研究表明,IL-33可以通过CD11c通过刺激分泌- 2诱导亚群+DC在体外和体内52]。段等人报道,IL-33治疗保护小鼠免受TNBS-induced促进Foxp3结肠炎+Treg响应(27]。类似地,我们发现IL-33可以引起CD4细胞+il - 10+亚群MLN的小鼠DSS-induced急性结肠炎(29日]。按照以上的观察,我们的数据表明,il - 10的表达水平,绝对的CD4细胞的数量和比例+CD25+和CD4+il - 10+亚群在MLN的老鼠DSS-induced慢性结肠炎,IL-33组明显高于在PBS组。

多年来,一种新型的子集叫Bregs B细胞,发挥独特的免疫调节功能,调节炎症和自身免疫,最近出现(53,54]。类似于亚群,通过细胞因子的生产Bregs发挥监管职能,如il - 10和TGF -β,表达抑制分子抑制致病性T细胞和诱导亚(53,55]。据报道,MLN B细胞保护小鼠免受结肠炎CD4引起的+CD45RB嗨T细胞(56]。和B细胞子集出现慢性炎症环境下,产生il - 10,抑制肠道炎症的进展(57]。据报道,Breg功能障碍引起的肠道炎症SAMP1 / Yit (SAMP1)小鼠公认为人类CD的模型(58,59]。从监管和il - 10生产B10细胞调节DSS-induced肠道损伤(60]。这些发现表明,IL-10-producing MLN Bregs诱导的慢性肠道炎症环境中,可以抑制肠道炎症。沟口健二et al。57)报道,引起Breg IL-33可以负责保护的WT小鼠结肠炎和Breg过继转移(IL-33)到老鼠IL-10KO也可以阻止自发的炎症性肠病的发展。同样的,我们之前的研究表明,IL-33能诱导小鼠Bregs DSS-induced急性结肠炎(29日]。与此一致的是,在这项研究中,我们发现IL-33诱发Bregs (CD19+CD25+)和IL-10-producing Bregs (CD19+il - 10+MLN的小鼠DSS-induced慢性结肠炎。此外,我们发现Breg反应水平提升IL-33较高的比急性期慢性结肠炎的阶段。慢性肠道炎症条件生成一个IL-10-producing监管B细胞(子集57]。所以,Breg反应水平提升IL-33较高的比急性期慢性结肠炎的阶段。更高层次的Breg反应可能的原因之一IL-33可以抑制DSS-induced慢性结肠炎。

γδT细胞,T淋巴细胞的一个小子集,发挥保护作用在急性DSS结肠炎但参与慢性结肠炎的恶化61年,62年),这表明γδT细胞可能是一个有前途的目标治疗炎症性肠病。Treg可以抑制干扰素的生产γ通过抗原内存γδT细胞(63年]。在目前的研究中,绝对数字和百分比γδT细胞在MLN IL-33组显著低于在PBS组。可能的表达差别的另一个原因对这些干扰素-γ。

巨噬细胞分为M1和M2类型对不同刺激当地的微环境(64年]。巨噬细胞发展成的促炎M1表型反应干扰素-γ引起的,而抗炎M2型2型细胞因子il - 4和IL-13 [65年]。M1巨噬细胞有助于DSS-induced结肠炎的发病机制主要是通过分泌促炎细胞因子,导致组织损伤。相比之下,M2巨噬细胞有助于解决DSS-induced结肠炎主要由表达低水平的促炎细胞因子(66年]。最近的研究表明,IL-33-induced M2-type巨噬细胞变弱的发展TNBS-induced结肠炎(67年]。在目前的研究中,il - 1β和il - 6,这主要是由M1-type巨噬细胞,减少IL-33-treated MLN的老鼠,但生产自发M2-type巨噬细胞il - 10的增加;此外,巨噬细胞的百分比和绝对数量的MLN IL-33组明显高于PBS。所以,巨噬细胞诱导IL-33在我们实验系统可能M2型。

由于人类IBD的高复杂性,很难定义IL-33作为治疗目标。事实上,IL-33似乎增强肠道炎症急性期的DSS结肠炎和可能在UC患者由Th2型和先天免疫反应。相反,IL-33 Th1-driven模型的影响,比如在TNBS结肠炎或DSS-induced慢性结肠炎,可能导致减少肠道炎症介导的细胞因子和细胞介导免疫反应的调节。IL-33可能有助于平衡Th1-based过度免疫反应,如CD,但不是加州大学是由th2型免疫反应。

5。结论

总之,我们的数据表明,IL-33治疗显著改善DSS-induced慢性结肠炎的发展减少Th17细胞反应和增加监管B细胞和调节性T细胞反应。我们代表强有力的证据表明IL-33管理光盘可以提供另一种治疗方法。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者Kristien范美女在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Jun-feng朱和徐应了同样的工作。

确认

这项工作是由中国自然科学基金会(没有。辽宁省31570160)、博士创业基金会(没有。201601090),授予教育部的辽宁省(没有。LQN201711),几百的主要科技成果转化项目沈阳(没有。z17 - 5 - 078),大型设备共享服务项目的辽宁省科学技术厅(没有。kjhx2017028)。这项工作也支持的工程实验室的分子模拟和设计药物分子的辽宁,辽宁大学博士启动基金。