B组链球菌引发一个健壮的干扰素-γ反应CD4⁺T细胞在一个在体外和在活的有机体内模型

文摘

B组链球菌第三(GBS)血清型引起危及生命的感染。细胞因子对疾病的控制已成为重要的球员,尤其是干扰素-γ。虽然提出了这种细胞因子的潜在来源,没有特定细胞系被描述为一个主要贡献者。在这项研究中,CD4细胞⁺T细胞激活配置文件,以应对GBS进行评估在活的有机体内,体外,和在体外方法。总脾细胞容易产生一个1型干扰素释放促炎反应-γ肿瘤坏死因子-α通过趋化因子,il - 6和积极招募T细胞像CXCL9 CXCL10, CCL3。CD4细胞的反应⁺T细胞分化成Th1细胞产生大量的干扰素-γ肿瘤坏死因子-α,2。在体外研究利用树突细胞和CD4⁺T细胞cocultures感染野生型GBS或nonencapsulated变异表明,GBS荚膜多糖的主要细菌毒力因素之一,不同调节表面CD69的表达和干扰素-γ生产。总的来说,CD4⁺T细胞是干扰素的重要生产商γ从而会影响GBS感染过程中通过平衡细胞因子的表达。

1。介绍

B组链球菌(GBS)或链球菌agalactiae是危及生命的感染在新生儿的主要原因(1,2]。GBS也影响孕妇、老人以及免疫功能低下的患者(3]。类型III GBS经常参与新生儿感染和在GBS脑膜炎是最常见的类型1,2]。

细胞因子是重要的控制GBS疾病,虽然夸张的反应可能是危险的(4,5]。而il - 10、il - 12和地震是有益的6- - - - - -9),肿瘤坏死因子-α有助于GBS-induced脓毒症(7,10]。干扰素-γ似乎很有希望控制GBS疾病;il - 12和地震起到治疗作用通过刺激免疫细胞产生干扰素-γ(6,8,9),干扰素-γ生产在新生儿受损,这可能部分解释他们对GBS感染(8,11,12),和干扰素-γ抑制GBS生存在人类内皮细胞(13]。提出了虽然NK和NKT细胞分泌干扰素-γ为了应对GBS (14,15),没有特定细胞系已明确确定的主要来源。

激活CD4⁺T细胞可以分化成T辅助(Th)细胞类型取决于他们接收到的信号。Th1细胞容易产生干扰素-γ在激活。GBS-infected树突状细胞(dc)产生大量的促炎细胞因子如TNF -α、il - 6和il - 12 (16)可以激活T细胞。此外,GBS-activated DCs发布招聘T细胞趋化因子,如CXCL9和CXCL10 [16]。尽管这些证据支持干扰素-γ生产的T细胞(17,18),CD4的参与⁺T细胞在GBS-induced疾病是未知的。

GBS拥有厚厚的sialylated多糖胶囊(CPS) (19]。它被称为GBS生存的最重要的因素在主机和干扰先天防御机制(4,20.,21]。封装GBS非常内化的DCs但存活细胞比其nonencapsulated同行。细菌内化和CPS的存在也与调制GBS-infected DCs(发布的一些细胞因子和趋化因子16,22,23]。

这里假设是,GBS驱动器CD4细胞⁺T细胞分化成干扰素-γ第Th1细胞,CPS可以修改此响应。CD4细胞的作用⁺T细胞的免疫反应对GBS类型III是调查使用在活的有机体内,体外,在体外方法小鼠模型。nonencapsulated GBS突变是包括解剖这个毒力因子的作用在T细胞活化。

2。材料和方法

2.1。菌株

COH-1,高度封装类型III GBS分离广泛描述(16,22,24),其同基因的nonencapsulated(ΔcpsE)突变体16,22]。GBS菌株培养如前所述[22]。

2.2。抗体

Anti-mouse抗体(除非另有注明BioLegend)用于流式细胞仪分析如下:FITC-conjugated anti-CD3 a2(17)和anti-CD4 (GK1.5;BD Pharmingen);PE-conjugated anti-CD4 (GK1.5) anti-CD19 (6 d5), anti-CD69 (H1.2F3;BD Pharmingen), anti-IFN -γ(XMG1.2;eBioscience), anti-TNF -α(MP6-XT22;eBioscience)和anti-IL-2 (JES6-5H4;eBioscience);PE-Cy7-conjugated anti - nk - 1.1 (PK136)和anti-CD44 (IM7;BD Pharmingen);APC-conjugated anti-IFN -γ(XMG1.2) anti-TNF -α(MP6-XT22)和anti-IL-7Rα(A7R34)和BV421-conjugated anti-CD62L (MEL-14)。

2.3。老鼠和实验感染

有没有女C57BL / 6小鼠(查尔斯河实验室)是用于所有实验。蒙特利尔大学的动物福利委员会随访工作的方针、政策。当天实验,0.5毫升细菌悬液(10⁶,10⁷,或10⁸CFU)或无菌汽车解决方案是管理腹腔内(i.p)。死亡率和临床体征监控(25]。血液样本(5μL)收集在不同的时间后感染。菌血症(CFU /毫升)是由镀样品血琼脂上使用一个自动螺旋铁甲工(螺旋生物技术)。

2.4。代骨骨髓来源脾脏CD4的DCs和隔离⁺T细胞

从天真的老鼠DCs生成如前所述16]。细胞纯度在86 - 90%和通过流式细胞仪分析细胞之前报道(16]。没有CD4的净化⁺T细胞,脾脏(从天真或被感染的老鼠)是收获,灌注与RPMI完全培养基(Gibco),并通过无菌细钢丝网轻轻按下。后红细胞裂解(eBioscience),总脾细胞悬浮在2毫米EDTA-PBS解决方案,并使用Lympholyte-M密度梯度分离(Cedarlane实验室)。低密度细胞在间期被magnetic-activated纯化细胞排序(MACS)消极的选择(Miltenyi研究)。丰富的CD4⁺通过流式细胞仪分析T细胞纯度> 96%使用CD3, CD4细胞抗体(数据未显示)。对所有实验,细胞被孵化在37°C, 5%的公司₂。

2.5。在活的有机体内感染模型

生存曲线和感染剂量的选择,老鼠(10)腹腔注射⁶,10⁷,或10⁸CFU(应变COH-1)和临床体征监测。基于获得的数据(图1(一)),小鼠腹腔注射10⁶CFU。幸存的动物临床迹象显示了10⁶CFU首次感染后2周。菌血症期间监测72 h后原发感染或刺激后24小时。脾脏的动物与临床症状和阳性菌血症是收获96 h后原发感染后48 h或提高(每组×5个人实验)。五个小时前脾收集,老鼠注射ip有200μ克Brefeldin (eBioscience)、蛋白质运输抑制剂。控制(mock-infected)动物也是同样的待遇。Brefeldin一直在整个净化步骤。选择的时间点是基于审前分析(数据未显示)。纯化CD4⁺T细胞是由细胞内流式细胞术分析细胞因子的生产(IC-FACS)。总分析了脾细胞表面标记的内存multiparametric流式细胞仪。CD3细胞被封闭⁺CD4⁺double-positive细胞,其次是控制CD62L⁻(效应(内存)T细胞)和CD62L⁺(中央记忆T细胞)。分析表面标记,五分之一IL-7Rα⁺,被用来进一步识别记忆细胞(IL-7Rα⁺这两个子集(内)26,27]。

2.6。体外脾细胞总量的分析

我小白鼠注射。p与10⁷CFU(应变COH-1) (每组×3个人实验)。脾脏是收获后6 h感染。脾细胞(5×10⁶细胞/毫升)镀在完全培养基没有抗生素和孵化48和72 h。最初的4 h孵化后,抑菌剂氯霉素(12μg / mL, Sigma-Aldrich)添加到控制细菌负荷之前报道(16]。总控制(mock-infected)动物的脾细胞也是同样的待遇。伴刀豆球蛋白A (ConA, 0.1μg / mL, Sigma-Aldrich)担任积极控制。上层清液在不同时间点细胞因子分析是收获。在选定的实验中,Brefeldin (3μg / mL)添加了过去5 h(孵化)和总脾细胞和CD4⁺T细胞(MACS-isolated文化wells)分析IC-FACS共48 h后孵化。文化条件选择基于预审(数据没有显示)。

2.7。在体外DC-T细胞Coculture模型

DCs在48-well镀的平底盘子(10⁵细胞/;1 h)前1 h感染COH-1或ΔcpsE菌株(MOI: 1)。与100年1 h治疗后μg / mL庆大霉素和5μg / mL青霉素g (Sigma-Aldrich)杀死细胞外细菌如前所述[16),DCs洗。刚分离CD4⁺从天真的老鼠增加了T细胞(5:1 T细胞/直流比率;8 - 24小时)。Cocultures孵化中单独或ConA (0.1μg / mL)担任正面和负面的控制,分别。流式细胞仪分析细胞收获的表面标记表达式。对T细胞细胞因子表达,48 h后孵化,盘子离心机和补充新鲜培养基含有10 ng / mL的鼠标rIL-2 (Miltenyi研究)。在为期3天的休息时间,T细胞是收获,洗,播种到96 -乘文化板块涂有5μ克/毫升anti-mouse-CD3马伯(BD Pharmingen) (10⁵细胞/;48 h)。浮在表面的收获了ELISA检测。单一细胞培养(DCs或T细胞)作为控制。

2.8。细胞因子和趋化因子量化ELISA

水平的il - 6、il - 10,干扰素-γ肿瘤坏死因子-α在细胞培养中,CXCL9 CCL3和CXCL10浮在表面的测量通过使用pair-matched抗体夹心ELISA(研发系统或eBioscience)。样品稀释给OD数据在一个标准曲线的线性部分被用来量化每个细胞因子的水平。结果至少包括三个独立的ELISA测量。

2.9。流式细胞仪分析

对于multiparametric IC-FACS,总脾细胞治疗FcR-blocking试剂(FcγIII / II Rc Ab;BD Pharmingen) 15分钟在冰上。为CD19细胞被染色,nk - 1.1, CD3,和/或CD69冰(30分钟),固定,permeabilized (eBioscience)。在细胞内染色干扰素-γ或肿瘤坏死因子-α(45分钟,室温),流式细胞仪进行使用FACSCanto II仪器(BD生物科学)。荧光- 1 (FMO)控制染色进行了适当的分析和闸门的靶细胞。IC-FACS MACS-purified CD4⁺T细胞从在活的有机体内或体外实验中,细胞被染色细胞干扰素-γ肿瘤坏死因子-α,如上所述和分析- 2 FACSCalibur仪器(BD生物科学)。multiparametric流式细胞仪分析内存的回应,脾细胞被封锁和surface-stained CD3, CD4, CD44、CD62L, IL-7Rα在冰(45分钟)。流式细胞仪进行使用FACSCanto II乐器。细胞在体外cocultures surface-stained CD4和CD69冰(30分钟)。流式细胞仪进行使用量子细胞实验室™SC MPL多平台加载器工具(贝克曼库尔特)。

2.10。统计分析

生存曲线受感染的老鼠使用kaplan meier情节和生成log-rank (Mantel-Cox)测试允许对比组。菌血症水平而使用Mann-Whitney测试。细胞因子数据(表示为意味着±SEM)和流式细胞仪数据分析使用学生未配对的意义以及。所有使用σ情节分析系统(Systat软件)。一个被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。GBS-Infected老鼠是剂量依赖性的生存

经过18 h,感染10⁷或10⁸CFU COH-1应变导致的死亡率(75%和69%),分别(图1(一))。死亡率将一直持续到24小时后感染82%和94% (),分别和保持直到60 h后感染实验时终止。小鼠感染10⁶CFU容易死亡率显著低于其他组的老鼠。18小时后感染,观察死亡率仅为6%,明显低于其他组()。死亡率继续增加在24和36 h感染后但仍明显低于小鼠感染高剂量()。事实上,老鼠感染10⁷或10⁸CFU体现强烈的临床症状早在8 h后感染,而10⁶CFU通常导致那么严重的迹象开始12 h后感染。

菌血症引起COH-1感染与生存曲线(图是相一致的1 (b))。小鼠感染10⁷或10⁸CFU显示高菌血症18 h后感染和平均达到2.6×10⁸和1.3×10⁹分别CFU /毫升。相比之下,老鼠感染10⁶CFU显示显著降低菌血症和平均达到5.7×10⁵CFU /毫升。高死亡率阻碍后续的菌血症小鼠感染了高剂量。然而,在小鼠感染10⁶菌落、菌血症慢慢减少,平均达到7.2×10⁴CFU /毫升72 h后感染。

3.2。脾细胞产生促炎细胞因子i型封装GBS感染的反应

调查前T细胞活化,脾免疫环境特征。总从小鼠脾细胞感染COH-1应变被孵化体外48和72 h(图2)。大量的干扰素-γ肿瘤坏死因子-α,发现了il - 6 (),建议1型炎性反应。il - 10也调节感染脾脏,暗示自我平衡的作用。重要的T细胞趋化因子招聘也发现:CXCL9 CXCL10, CCL3 ()。值得注意的是,CXCL9和CXCL10主要发布在应对干扰素-γ激活(28),因此在协议与观察到的高水平的干扰素γ由GBS-infected脾细胞。之间没有显著差异观察48和72 h文化,除了CXCL9在最大生产推迟到72 h的孵化。

3.3。激活CD4⁺T细胞导致干扰素-γ生产期间封装GBS感染

与脾的当前理解环境,激活T细胞细胞因子生产的贡献了。一个multiparametric IC-FACS干扰素-分析γ生产从体外总脾细胞文化。CD3⁺T细胞明显导致了干扰素-γ反应在受感染小鼠的脾脏(图3(一个);)。NKT细胞(NK1.1⁺CD3⁺)产生非常低水平的干扰素-γ(数据没有显示)。NK细胞(NK1.1⁺)是主要贡献者干扰素-γ生产中CD3⁻人口(数据未显示)。正如所料,B细胞(CD19⁺)没有产生大量的细胞因子(数据没有显示)。激活CD3⁺T细胞也贡献了大约一半的生产TNF -α脾细胞(图3 (c);)。控制老鼠相比,受感染动物的脾细胞显示显著增加表面表达CD69早期激活的标志。高CD69的表达CD3中也观察到⁺人口(图3 (b);)。

CD4⁺T细胞是隔绝体外总脾细胞文化和分析IC-FACS专门评估他们的角色(图4)。激活CD4⁺T细胞导致干扰素的生产γ和肿瘤坏死因子-α。低水平的细胞内也观察到(图- 24)。在活的有机体内实验证实这些结果;CD4⁺T细胞直接从受感染小鼠的脾脏分离96 h原发感染后表明,他们对干扰素的生产作出贡献γ和肿瘤坏死因子-α。细胞内的水平- 2在原发感染(图很难检测到5、黑色直方图)。CD4⁺T细胞分离后48 h干扰素,提高显示一个增强的贡献γ肿瘤坏死因子-α和生产(图- 25深灰色的直方图)。这是符合记忆CD4的一代⁺T细胞(IL-7Rα⁺)观察到当时IL-7R增加α⁺细胞在中央内存子集(CD62L⁺)(数据6(一)和6 (b),红色人口和柱状图)。减少IL-7Rα⁺在效应细胞(内存)的子集(CD62L⁻)可能反映了从脾周围组织细胞迁移(数据6(一)和6 (b)人口和直方图、蓝)。

3.4。GBS的CPS调节CD4细胞因子释放⁺T细胞

GBS是一个很好的细菌,CPS对CD4细胞的影响⁺T细胞激活是评估通过比较COH-1 nonencapsulated突变,ΔcpsE,在一个在体外DC-T细胞coculture系统。自从nonencapsulated GBS突变体迅速清除从循环20.),在活的有机体内比较是不可能的。Coculture上层清液被ELISA对CD4检测⁺T细胞来源的细胞因子。没有明显的细胞因子的生产在单一细胞培养(DCs或T细胞)作为控制(数据未显示)。COH-1-activated cocultures表现出极高水平的干扰素-γ(~ 45000 pg / mL)和显著水平的TNF -α(~ 1500 pg / mL)。ΔcpsE激活cocultures显示显著减少干扰素-γ生产(图7;),以及降低TNF -α生产,尽管这种差异没有统计学意义()。整体而言,这些结果表明,nonencapsulated GBS-pulsed DCs诱导细胞因子的生产减少了CD4⁺T细胞相比,封装GBS-pulsed DCs。

3.5。GBS的CPS影响表面活化的CD4细胞CD69的表达⁺T细胞

除了细胞因子的生产,表面分子的表达对适当的T细胞激活至关重要。CPS的CD4细胞CD69的表达上激活⁺T细胞是调查。在COH-1-activated cocultures, CD4细胞CD69的表达⁺ΔT细胞明显低于cpsE激活cocultures 8 h后孵化(图8;)。CD69表达仍低COH-1-activated cocultures在24小时(),尽管表达的差异和水平不太明显。48小时后,观察CD69表达菌株之间没有显著差异(数据没有显示)。

4所示。讨论

尽管GBS和先天免疫细胞之间的相互作用越来越多地记录,适应性免疫细胞的激活配置文件从来没有被调查。这是第一个研究评估CD4细胞⁺利用T细胞对GBS的免疫应答在活的有机体内,体外,在体外分析。

虽然细胞因子对宿主防御发展做出贡献,他们也可以加剧GBS-induced病态。最初的体外分析细胞因子的生产由封装GBS-infected小鼠脾细胞总发现干扰素-的存在γ肿瘤坏死因子-α、il - 6和il - 10。干扰素的生产,γ肿瘤坏死因子-α,il - 6表明1型促炎反应正在开发感染后不久,而il - 10的生产可以与免疫调节有关。有趣的是,肿瘤坏死因子-α和il - 6例行报告为介质的GBS脓毒症(7,10]。这个结果也可能突出il - 10的自我平衡的作用。事实上,il - 10所示降低TNF -α因此保护新生儿来自发展中GBS的小鼠脓毒症(7]。

众所周知,DCs、单核细胞和巨噬细胞分泌TNF -α,il - 6和il - 10对GBS (16,17,29日- - - - - -31日]。然而,干扰素的来源γ仍然不确定。早期作品报告干扰素-γ生产使用GBS-infected总脾细胞或混合单核细胞,没有识别细胞来源(8- - - - - -10,17]。本研究定义T细胞在干扰素的作用γ生产。体外和在活的有机体内分析表明,CD4⁺T细胞是干扰素的重要生产商γ和肿瘤坏死因子-α在GBS感染。激活CD4⁺T细胞也产生低,但仍相当水平的2,表明Th1反应的发展。CD4⁺T细胞产生相同的细胞因子的模式更有效地提高感染后,可能由于内存响应(32]。NK细胞干扰素-的一个重要贡献γ反应也证明在活的有机体内按照之前的在体外研究脾细胞从严重联合免疫缺陷小鼠15]。干扰素-γ生产在GBS感染NKT细胞非常有限,甚至在更早的时间点(未发表的观察),尽管纯化GBS糖脂可以激活NKT细胞(14]。

早期由先天免疫细胞趋化因子释放吸引T细胞感染的网站。体外总脾细胞趋化因子生产的分析表明,T细胞通过CCL3正在积极招募,CXCL9, CXCL10。有趣的是,CXCL9和CXCL10 CXCR3配体,诱导干扰素-γ。CXCR3迅速调节幼稚T细胞活化后,仍然优先高度表达Th1细胞(28]。不同的脾细胞类型,如DCs、可能产生这些趋化因子,以应对GBS (16]。尽管upregulationCxcl10基因表达在小鼠腹腔巨噬细胞(31日),GBS无法诱导CXCL10或CXCL9由这些细胞(分泌33]。尽管如此,巨噬细胞和DCs似乎有助于CCL3生产(31日,33,34]。

作为厚CPS GBS拥有,其最重要的毒力因子,调节CD4 CPS的潜力⁺T细胞激活了。类似于体外和在活的有机体内结果,DCs脉冲在体外与封装GBS诱导高水平的IFN -的释放γ和肿瘤坏死因子-α由CD4⁺T细胞。干扰素的生产γ与nonencapsulated GBS显著下降。肿瘤坏死因子-生产α也减少了。令人惊奇的是,失去胶囊不触发或增加干扰素反应过大γ生产的T细胞,对其他封装病原体(35- - - - - -37]。然而,研究GBS-activated DCs显示类似的趋势;封装GBS感染DCs生产的细胞因子诱导相似或强于nonencapsulated GBS-infected同行(16,34]。唯一的例外是il - 10,产量显著高于在DCs感染nonencapsulated突变(16]。提出了两个相互关联的假设来解释这些观察:(a) il - 10的生产增加了DCs降低其他细胞因子的生产;或(b)更有效的杀死nonencapsulated突变降低细胞因子生产的DCs (16,22]。此外,据报道,CPS的存在调节DCs GBS吸收[使用的内吞作用的途径22]。自从进入路线影响呈现给CD4抗原表位的体验⁺T细胞,随后的免疫反应可能会受到影响(38]。因此,在我们DC-T细胞coculture系统,直流调制的nonencapsulated应变可能导致低水平的干扰素-γ生产CD4⁺T细胞。

与细胞因子的生产,表面的表达CD69更高(早期的时间点)或类似的CD4(晚时间点)⁺T细胞与nonencapsulated cocultured mutant-pulsed DCs与封装GBS-infected cocultures。然而,这可能只是不同动力学CD69的表达有关。事实上,试图解释调制CD4细胞CD69的表达⁺T细胞是非常困难的,由于有限的信息标志。事实上,描述它的配体刚刚开始(39]。CD69已知最早的标记诱导激活T细胞和作为信号传输受体免疫调节活动(40]。可用的一些研究对T细胞CD69的表达在链球菌感染,Harimaya等人证明了upregulation CD69的CD3存在剂量依赖的相关性⁺从外周血淋巴细胞感染T细胞链球菌引起的肺炎。然而,作者未能关联CD69表达和干扰素-γ生产这些靶细胞(41]。最近,在一个肺炎链球菌感染的小鼠模型,CD4细胞⁺T细胞表现出显著的upregulation CD69的脾脏。这个反应是mhc ii无限制,作者认为这增加T细胞CD69的表达可能是由于二级因素像其他细胞释放的细胞因子42]。可能多克隆(间接)激活的T细胞不能排除在我们的系统,虽然GBS未能直接激活T细胞无抗原递呈细胞(数据未显示),类似的报告肺炎链球菌(37,42]。最后,有人建议CD69具有免疫调节作用,防止侵染诱导免疫病理(43]。增强CD69的表达可能导致降低干扰素-γ生产CD4⁺T细胞(44]。

5。结论

毫无疑问,干扰素,γ生产CD4⁺T细胞在GBS感染对宿主防御至关重要(8),但也可能导致疾病的病理,建议在肺炎球菌败血症的小鼠模型42]。虽然该研究首次IFN -特点γ生产CD4⁺T细胞,干扰素的调节机制,明确的理解γ生产在GBS感染需要进一步的研究。例如,作为生存优势GBS (CPS授予16,22),持久性GBS的抗原递呈细胞可能影响他们的激活,因此接下来的T细胞免疫反应,包括改变干扰素-γ在感染的早期和CD69表达平衡。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突的研究。

作者的贡献

Damian克拉克和科琳Letendre贡献同样这项工作。

确认

这项工作是由加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC没有。马列拉普- 342150 - 2013)和加拿大卫生研究院的研究(CIHR)和加拿大创新基金会(CFI)通过赠款雅克锡伯杜(CIHR没有。93592)。科琳Letendre的接受者硕士NSERC颁发的奖项。Marie-Pier Lecours和保罗的接受者是Lemire博士颁发的奖项NSERC和溺爱de说是Quebec-Nature等技术,分别。

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