TLR9识别受体激动剂的效果CpG Oligodeoxynucleotides军曹鱼的肠道免疫反应(Rachycentron canadum)

文摘

胞嘧啶,鸟嘌呤,oligodeoxynucleotide (CpG ODN)图案的细菌DNA通过toll样受体识别9 (TLR9识别)和先天免疫的有力催化剂。然而,TLR9识别之间的交互和CpG ODN水生物种还没有被研究的很透彻了。因此,军曹鱼TLR9识别同种型B (RCTLR9B)克隆及其表达和诱导肠。RCTLR9B cDNA由包含三个区域的3113个基点编码1009个氨基酸,富亮氨酸重复,跨膜域和人数/ interleukin-1受体(行动)域。腹腔内注射的CpG ODN 2395 A和B调节RCTLR9 MyD88也诱导Mx的表情,CC趋化因子和白介素il - 1β。军曹鱼腹腔内注射CpG ODN 1668年和2395年存活率增加后的挑战发光细菌damselae无性系种群。piscicida。此外,制定CpG ODN formalin-killed细菌(FKB)和氢氧化铝凝胶RCTLR9的表达明显增加(50倍)和B(30倍)亚型10 dpi (CpG ODN 1668)和MyD88(折叠21日)6点第一项(CpG ODN 2395)。随后,il - 1β增加6 1668年第一集团。没有观察到的组织病理学损伤和炎症反应注射军曹鱼。总之,这些结果促进CpG ODNs作为辅助增加抗细菌性疾病和疫苗的功效在军曹鱼。

1。介绍

硬骨鱼类的先天免疫中扮演一个重要的角色在最初抵御入侵的病原体(1]。胃肠道(GI)束通常被认为是至关重要的一个器官不仅对营养物质的消化和吸收,而且免疫(2]。胃肠道是一个重要的屏障,保护鱼从feed-borne病原体3- - - - - -5]。鱼的后段肠道免疫活性,装甲和各种免疫细胞类型,包括B细胞、巨噬细胞、粒细胞、T细胞,在当地扮演重要角色的免疫反应过程中免疫和炎症(6- - - - - -8]。此外,鱼类肠道上皮细胞不断暴露于病原体和参与胃肠道的先天免疫。这些细胞其为病原体识别的分子模式(pamp)通过toll样受体(通常)和诱导免疫反应在肠道内腔9]。

通常是跨膜蛋白识别守恒的致病结构和激活免疫效应分子(10)形成一个天然免疫与适应性免疫之间的联系(11]。的主要免疫功能通常是(1)诱导pro /抗炎的表情,表示细胞趋化因子与适应性免疫系统;(2)启动抗菌效果或途径;和(3)维护共生体和粘膜内稳态12]。toll样受体9 (TLR9识别)扮演的角色先天免疫反应的细菌和DNA合成含有unmethylated CpG图案已经研究的很透彻(13]。人类的TLR9识别基因可以拼接成不同亚型在转录产生5 TLR9识别亚型(TLR9A, B, C, D, E)。这些TLR9识别亚型各免疫器官和细胞差异表达,如脾、外周血单核细胞(PBMC)和淋巴结,属性差的促炎细胞因子和细胞毒性t淋巴球分化(14- - - - - -16]。在硬骨鱼,只有海鲷和黄花鱼TLR9识别B亚型已确定,但TLR9识别B亚型的功能尚不清楚10,17]。

胞嘧啶phosphate-guanine (CpG) oligodeoxynucleotides (ODNs) DNA片段的高频CpG图案模拟细菌DNA的免疫刺激性活动(18,19]。CpG ODNs,与大多数传统佐剂,能够刺激免疫动物体液免疫和细胞免疫反应(20.]。TLR9识别的交互与CpG主题启动一连串的事件导致T辅助(Th)分泌的一种细胞因子和趋化因子。作品的趋化因子和interferon-gamma-inducible protein-10 (IP-10)的早期指标Th1型免疫反应(21,22]。在哺乳动物中,腹腔内CpG ODNs管理是有效刺激肠道TLR9识别和趋化因子的表达由于低白介素(IL) -10年的水平在人类新生儿和猪大肠23,24]。在硬骨鱼,政府的CpG ODNs被发现增加TLR9识别表达式在大西洋鲑鱼25),海鲷(26),和大比目鱼27]。然而,我们最好的知识,免疫反应参与腹腔内刺激肠道免疫的CpG ODNs军曹鱼还没有被调查。

军曹鱼行业一直遭受各种传染性疾病联系在一起发光细菌damselae(p . damselae无性系种群。piscicida(28- - - - - -31日],具有很高的绑定和入侵鱼类肠道上皮细胞的能力(32,33]。因此,CpG的免疫刺激性影响ODNs可以提高军曹鱼的肠道免疫,提高抗感染所致p . damselae无性系种群。piscicida。本研究的目标是(1)克隆RCTLR9B;(2)分析的表达式RCTLR9A RCTLR9B, MyD88, Mx, IgM,趋化因子CC和il - 1β为了应对CpG ODNs的刺激;(3)评估腹腔内的保护效率管理CpG ODNs反对p . damselae无性系种群。piscicida感染;和(4)评估腹腔内注射的CpG adjuvanticity CpG ODNs制定formalin-killed细菌(FKB)和氢氧化铝凝胶(明矾)。

2。材料和方法

2.1。克隆的军曹鱼TLR9识别同种型B

2.1.1。部分克隆军曹鱼TLR9识别同种型B

部分序列的军曹鱼TLR9B得到使用的引物(TLR9F1和TLR9R1)设计基于TLR9识别其他鱼类物种的序列(Acanthopagrus数值EU256332数量,Dentex tumifronsEU256335数量,Larimichthys稚鱼EU655704,Larimichthys稚鱼B EU655705数量,黄aurata许多AY751797,黄aurataB号AY751796)使用Vector-NTI(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) [34]。PCR进行了使用军曹鱼cDNA从肝脏作为模板在下列条件下:一个周期在95°C 2分钟后跟35周期95°C的30年代,54°C 30年代,72°C, 1分钟;在72°C和最后一个扩展5分钟。PCR产物测序,用于实时PCR引物设计。

2.1.2。快速放大的cDNA结束(比赛)

获得的全长cDNA序列RCTLR9同种型B (RCTLR9B) 5′和3′竞赛实施使用智能互补脱氧核糖核酸扩增工具包(美国Clontech)。TLR9B-RacF1和TLR9B-RacR1, RCTLR9基因引物设计的部分RCTLR9B cDNA序列(JX073035.1)。降落pcr进行3′,5′种族使用TLR9B-Rac F1 /芬欧蓝公司芬欧汇川集团和TLR9B-RacR1 /引物(表1),在下列情况下:一个周期的初始变性在94°C 2分钟后跟5周期94°C / 30年代和72°C / 3分钟;未来5周期94°C / 30年代,70°C / 30年代和72°C / 3分钟;未来25周期94°C / 30年代,68°C / 30年代和72°C / 3分钟;和一个周期在72°C / 5分钟。嵌套PCR 5′和3′竞赛使用TLR9B-NGSP1执行/ NUP为3′5′和TLR9B-NGSP2 / NUP嵌套引物(表1)。嵌套PCR, 1L初级RACE-PCR产品是用作模板与下列条件:最初的94°C / 2分钟一个周期,然后30周期的94°C / 30年代,68°C / 30年代和72°C / 3分钟之后,一个周期72°C / 5分钟。PCR产物测序,分析利用Vector-NTI计划和执行BLASTx NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)数据库基因库。

2.1.3。TLR9识别cDNA序列分析

RCTLR9B组装使用向量的全长cdna NTI程序。推导的氨基酸序列,分子量(kDa),π,和蛋白质ExPASy蛋白质组进行的分析工具(http://www.expasy.org/tools/)。蛋白质域预测使用智能软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)。同源序列搜索使用爆炸程序可以在NCBI网站与数据库默认设置的基因库。多重序列比对创建使用CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw2/)。

2.2。CpG ODNs

CpG ODNs买来Bioneer(韩国)。ODNs phosphorothioate修改整个序列。CpG ODNs序列如下:b CpG 1668 T *C * G* T *C * G* T * T * T * T * G * T *C * G* T * T * T * T * G * C * T * G,丙类CpG 2395 T *C * G* T *C * G* T * T * T * T *C* G* G *C * G*C * G*C * G* C *C * G和2137年与phosphorothioate修改反向控制(CpG),T *G * C* T *G * C* T * T * T * T * G * T *G * C* T * T * T * T * G * T *G * C* T * T (phosphorothioate修改标有* CG和GCs以粗体显示)。

CpG ODNs是悬浮在磷酸缓冲盐(PBS, pH值7.2)和存储在−20°C到使用。

2.3。实验设计和鱼抽样

军曹鱼鱼(约20克体重)从当地农场采购,他们保持在回流曝气坦克驯化一个星期。在适应环境,他们与商业饮食喂养和适当的水质(200 L水位、温度28°C,和盐度30 ppt)是维护。鱼被随机分为四组,每个罐满十鱼(25克)。鱼腹腔内(i.p)注射0.5毫升PBS对照组和0.5毫升PBS包含10g unmethylated CpG ODN 1668、2395和2137年,分别。在每个时间间隔(1、3、6和10天后刺激),两条鱼被取样,后肠的一部分是卫生地解剖,沉浸在PBS (pH值7.2)。在肠内的粘液和消化饲料被完全移除,样本立即沉浸在试剂盒试剂(美国表达载体)。肠的总RNA隔离进行了根据制造商的指示与小修改。RNA颗粒溶解在核糖核酸酶游离水(试剂盒)和保存在−80°C到使用。

2.4。腹腔内行政保护效率CpG ODNs对军曹鱼的细菌挑战

军曹鱼鱼(20 - 25克)被分成五组(每个)和适应了三天。在适应环境、鱼每天与商业饲料喂食。三天后,军曹鱼腹腔内注射(i.p)和0.5毫升的PBS和0.5毫升PBS包含10g CpG ODNs 1668、2395和2137。48 h后,军曹鱼挑战腹腔内(i.p)生活p . damselae无性系种群。piscicida细菌(CFU /毫升)。此后,水质被强有力的曝气和适当维护通过监测恒定水温、盐度(28°C和30 ppt)。挑战后的行为和死亡率每天在个人组进行记录。

2.5。CpG ODNs Adjuvanticity

2.5.1。细菌抗原的制备

细菌从冻结的股票准备使用下列条件:p . damselae无性系种群。piscicida(BCRC 9714)是培养在5毫升脑心浸液肉汤(BHI)含2%氯化钠在一夜之间28°C / 1毫升肉汤的股票被转移到100毫升肉汤和生长,直到O。D达到1.0(600海里)。细菌被离心收获(6000×g)在4°C 5分钟。PBS的颗粒被洗两次(pH值7.2)和细菌悬液是通过添加福尔马林灭活的最终浓度3%和孵化一夜之间在4°C。灭活细菌的解决方案是在6000×g离心10分钟,彻底洗3次去除福尔马林残留。证实了FKB电镀100的失活L解决方案的BHI + 2%氯化钠盘子和孵化一夜之间在28°C。

2.5.2。制定CpG ODNs FKB和明矾

每个剂量(100包含10 L)的疫苗g (CpG ODNs(1668、2395、或2137)控制在10L PBS制定45L 2%的明矾(Alhydrogel Invivogen)和45L FKB。配方是在室温下混合在大约30瓶rpm 30分钟,直到使用储存在4°C。

2.5.3。免疫和抽样

军曹鱼都是采购从本地渔场在屏东,环境适应台湾,如前所述。驯化后,二十个鱼每箱库存分成四个不同的组。第一组免疫腹腔内与100年(i.p)L PBS。第二组是与100年接种包含10 L /鱼类疫苗克/ 10L 1668年CpG ODNs + 45L FKB。第三个(FKB +铝+ CpG ODN 2395)和第四组(FKB +铝+ 2137)和45免疫L 2%的明矾指定为FKB +铝+ CpG ODN 1668。所有公式都注入了100年的总量L /鱼。注射后,每天观察鱼的行为,维持最优条件。基因表达研究后肠对总RNA取样隔离,注射后3、6、10天(dpi)节中描述2。3。

2.5.4。组织病理学

两条鱼从每组牺牲在3、6和10 dpi,分别进行组织病理学检查。组织样本后肠的一部分固定在10%中性缓冲福尔马林光学显微镜的标准程序。样本处理,石蜡包埋(Tissue-Tek TEC),切成4 - 5米部分使用标准的切片机(徕卡RM2235)被苏木精和伊红染色之前(Tissue-Tek DRS)。彩色幻灯片(奥林巴斯)检查炎症的迹象,固有层的膨胀,坏死的上皮细胞使用双盲设计。幻灯片是记录,以避免观测偏差之前被送到病理学家进行进一步的检查。

炎症的迹象是得分从0到3(0 =正常,1 =轻微,2 =温和,和3 =严重)(35]。固有层的扩张,上皮细胞坏死、萎缩,存款,浆膜坏死,粘膜下坏死,肥大,和增生也评估基于组织病理学变化(−)没有组织病理学,(+)温和的组织病理学,(+ +)温和的组织病理学和(+ + +)严重的组织病理学。

2.6。互补脱氧核糖核酸合成和定量基因表达

质量的总RNA进行了分析使用260/280 nm紫外线分光光度计。合成第一链cDNA通过逆转录酶2克总RNA逆转录酶使用亲(美国强光油灯)oligo-dT底漆。所有的cDNA样本存储在−20°C到使用。互补脱氧核糖核酸合成的基因污染和质量是由设计决定采用pcr扩增引物在intron-exon军曹鱼的侧翼区域和3′UTR区域β-actin3 (HM754627)。A和B的表达水平TLR9识别(KC180322和JX073035), MyD88 (KF018033), il - 1β(AY641829), Mx (AY834185), IgM (JX025102)和CC-chemokine (JF975593)分析基因特定的引物(表1)。7500年ABI实时PCR进行实时检测系统(美国应用生物系统公司)。放大了的总量的10L,包含5L SYBR绿色我实时PCR掌握混合(Kapa生物系统公司),10.2 L的cDNA、每个引物L和3.6L DEPC水。实时PCR程序95°C 1分钟紧随其后40 95°C的周期15年代,60年代60°C。离解和融化曲线放大产品的执行结束时每个PCR证实只有一个PCR产品放大和检测。放大后,进行了数据采集和分析使用序列检测软件(SDS 2.1版。应用生物系统公司)。的方法被选为计算方法(36]。循环阈值之间的差异(Ct)的价值目标基因和参考基因(β肌动蛋白)称为ΔCT计算。ΔΔCT =(ΔCT目标基因或PBS-injected集团为目标基因在每个时间点)−(ΔCT最初的控制)。

2.7。统计分析

数据分析使用SPSS16 (SPSS Inc .,芝加哥IL)。使用描述性统计数据分布决定。分析了治疗手段的差异使用方差分析和比较使用事后多重比较使用邓肯的多个测试范围。一个值< 0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。克隆的军曹鱼TLR9识别同种型B

的全部长度RCTLR9B (KF963251) 3113个基点编码1009个氨基酸残基。RCTLR9B蛋白质同源Rachycentron canadum同种型(AGD79973),Larimichthys稚鱼同种型(ACF60624),Epinephelus coioides同种型(ACV04893),Dentex tumifrons(ABY79218)为89%,66%,65%,和64%,分别。一个信号肽位于1至29氨基酸序列被确定的位置。此外,12亮氨酸重复(远程雷达),LRRTYP(典型),LRRCT(远程雷达c端),和244氨基酸Toll-interleukin-1受体(行动)域RCTLR9B被观察到。CXXC主题参与配位体绑定被确认在远程雷达主题区域209 - 223氨基酸部分包含两个守恒的图案由六个氨基酸残基(图1起诉,一盒)。三部分的行动领域被认为是重要的信号和受体定位在RCTLR9A守恒,斑马鱼和小鼠TLR9识别(图1)。

3.2。青少年和成人肠道的免疫基因表达

信使rna表达TLR9识别同种型A和B, MyD88, il - 1β,IgM、趋化因子和Mx在青少年和成人军曹鱼(图检查2)。IgM的表达式和趋化因子基因在成人明显()高于那些在少年。il - 1的水平β更高的青少年相比,在成人。TLR9识别A和B亚型的表达,MyD88, Mx没有显著不同的青少年和成年人。

3.3。免疫基因的表达在小肠CpG ODNs的刺激

3.3.1。TLR 9

1668年CpG ODN注射后,RCTLR9A成绩单显著增加(3 dpi)后,在6 dpi下降到最低水平,随后增加dpi(图10点3(一个))。CpG ODN 2395注射后,表达时触底后大幅3 dpi和达到6 dpi。在不同ODNs CpG ODN 2395导致RCTLR9A mRNA的最高褶皱变化相比与CpG ODN 1668和CpG ODN 2137。

3.3.2。TLR 9 B

所示的表达无显著差异是CpG ODN ODN治疗组1668 dpi(图3 (b))。表达式在6 dpi达到顶峰,后来减少到最低。然而,RCTLR9B CpG ODN 2395刺激的水平被发现明显高于6 dpi。

3.3.3。MyD88表达式

与CpG ODN注射后1668年,MyD88转录水平增加1 dpi和达到峰值后3 dpi然后减少到最低6 dpi和10 dpi略有增加。显著差异被发现在3和6 dpi(图3 (c))。MyD88转录水平与CpG ODN注射后2395后不断增加3 dpi, dpi 6点达到高峰,然后急剧dpi 10点触底。

3.3.4。Mx表达式

CpG ODNs 1668 B类不引起高褶皱Mx表达式在肠(图上的变化4(一))。然而,刺激CpG ODNs 2395诱导显著高表达1 dpi和3 dpi表达减少,后来它显著增加高6 dpi和dpi 10点减少到最低。

3.3.5。IgM表达式

1668年CpG ODN刺激后,IgM转录达到1 dpi然后减少3 dpi和dpi(图10时达到最低水平4 (b)),而IgM转录水平与CpG ODN刺激后增加2395 dpi和达到最高水平3 dpi和大幅减少6 dpi。

3.3.6。CC趋化因子表达

CpG ODN 1668导致显著增加的趋化因子CC和达到3 dpi然后表达减少注射后6 dpi(图4 (c))。趋化因子水平的成绩单后注入CpG ODN 2395 dpi三点触底,达到最高的水平在6 dpi然后10 dpi下降。

3.3.7。il - 1β表达式

il - 1的表达谱β在肠CpG ODNs 1668导致不断增加3 dpi和达到峰值后6 dpi;后来在10 dpi(图表达减少4 (d))。然而CpG ODN 2395刺激显示表达式触底后3 dpi和峰值明显高于6点10 dpi dpi和减少到最低。

3.4。保护效率的CpG ODNs军曹鱼对细菌的挑战

实验以确定是否进行CpG ODN注入军曹鱼可以防止细菌的挑战。结果显示,CpG ODN 1668和2395可以保护军曹鱼当挑战发光细菌damselae无性系种群。piscicida(图5)。鱼单独注射PBs和注射CpG ODN 2137开始死后3天,5天的挑战。鱼注射PBS显示,90%死亡率10天内。在中央人民政府ODN注射组,2137年死亡率CpG ODN中观察到的最高水平。存活率是1668年从CpG ODN获得最高(90%),其次是CpG ODN 2395 (70%)。

3.5。CpG ODNs Adjuvanticity

3.5.1。TLR 9 A和B同种型表达式

A和B两RCTLR9表情增加1 dpi(8 ~ 9和折叠)和3 dpi后下降。1668 p注入FKB +铝+ CpG(数字6(一)和6 (b))。此后,A和B两种亚型增加6 dpi(42 ~ 38和折叠)。表达式的同种型增加10点dpi(51 ~折叠),相比之下,同种型B减少(~ 33折叠)在同一时间。RCTLR 9 a和B的表达后管理与FKB +铝+ CpG 2395显著增加,直到6 dpi(26 ~ 27和折叠),然后10 dpi下降。控制治疗FKB +铝+ 2137,表达RCTLR9B显著增加(~ 5折),直到6点dpi然后下降10 dpi。

3.5.2。MyD88表达式

图6 (c)显示管理后的表达Myd88波动都于1668年FKB +铝+ CpG FKB +铝+ CpG 2395人。MyD88减少dpi的1到3的表达dpi和显著增加6两CpG-ODN 1668和CpG-ODN 2395 dpi(~ 10和22个折叠)然后下降,达到最低水平在10 dpi(~ 1折)。在对照组FKB +铝+ 2137,MyD88显示波动的表达式。表达式3 dpi下降,增加了6 dpi, dpi 10点触底。FKB +铝+ 2395年的CpG集团显示最高的褶皱变化较其他治疗。

3.5.3。il - 1β表达式

il - 1β低表达在所有三个治疗(FKB +铝+ CpG 1668;FKB +铝+ CpG 2395;和FKB +铝+ 2137治疗)的褶皱变化。il - 1的表达谱β在FKB +明矾+ 1668和FKB CpG + + CpG 3 dpi后2395年成为显著低。对照组的表达谱高于治疗组在大多数的观察时间(图6 (d))。只有在6 dpi,治疗组显示表达的增加。2137年控制集团,IL - 1的表达谱β显示波动没有显著差异。

3.6。组织学观察

总值正常形态的肠壁军曹鱼使用光学显微镜检查(LM)苏木精和伊红染色(H和E)组。没有发现炎症细胞在固有层军曹鱼的肠道。此外,鱼从对照组显示肠道上皮细胞组成的单层柱状上皮细胞和杯状细胞丰富了明显完好无损交界复合物(数字7和8)。没有观察到在肠道内腔细胞碎片。连续黏液层明显的顶端表面细胞。没有损坏的迹象、水肿或炎症观察。

4所示。讨论

RCTLR9B跨膜域,显示其本地化的膜。军曹鱼的CLUSTALW对齐(RCTLR9B和RCTLR9A),斑马鱼和小鼠TLR9识别显示高根据氨基酸序列同源性(图1)。提出了主题的cDNA序列结合的pamp TLR9识别(37]。我们的研究结果表明,RCTLR9B CXXC图案之间的209和223个氨基酸,暗示其约束力自然配体。在人类,已报告5亚型TLR9识别(TLR9A-E) [14]。这些TLR9识别亚型在各种细胞类型的微分本地化提高计算模型的功能意义的问题,结构,和生物相关性炎症期间特殊的同种型。TLR9识别A、C、D和E被证实是预测位于呃,但TLR9识别B,另一方面,位于线粒体(14]。在硬骨鱼,但只有两个TLR9识别亚型已确定在海鲷10和嘎声17]。然而,这些亚型的细胞定位在硬骨鱼还没有被研究过。

RCTLR9A和RCTLR9B都表达了类似的水平在健康青少年和成人军曹鱼。之间没有发现显著差异表达RCTLR9A RCTLRB或青少年和成年人。与先前的研究中,这是在协议的TRL9亚型被发现的肠道健康黄aurata(10]。然而,在少年嘎声TLR9B的表达显著高于TLR9A [17]。此外,MyD88的表达式和Mx少年和成人之间没有显著差异。相似的表情观察肠道健康的伦敦(38]。IgM的mRNA表达和趋化因子CC明显高于成人军曹鱼相比,青少年军曹鱼。科学家和趋化因子CC的基底表达式中发现猪空肠,盲肠和结肠治疗前的CpG ODNs [24]。IgM和趋化因子的表达越高CC成人可能表明更由于增加了暴露于病原体激活免疫力。

由于胃肠道病原体的主要门户网站的入口(32,33),这将是有意义的调查免疫相关基因的表达,以应对政府CpG ODNs军曹鱼的肠道。军曹鱼的肠道上皮细胞系不可用;因此我们腹腔内注入各种CpG ODNs鱼和收购肠道组织在不同的时间点。结果表明,腹腔内刺激CpG ODNs影响了先天免疫相关基因的表达在军曹鱼肠。immunity-related基因的表达在小肠被发现依赖CpG ODNs的类型和时间,也就是说,一天后注入(dpi)。鱼注射CpG ODN 2395显著增加表达式RCTLR9A和RCTLR9B dpi 6点,这是反映在显著调节表达MyD88相比与鱼注射CpG ODN 1668。人类上皮细胞系,HT-29发现自发表达TLR9识别信使rna和蛋白质,和刺激CpG ODNs和细菌DNA诱导促炎细胞因子的表达,包括il - 1β和引发39,40]。在目前的研究中,il - 1的表达β保持不变在1和3 dpi,达到6 dpi, dpi 10点回到基线。被耽搁的il - 1β反应可能是由于以下原因:(1)激活TLR9识别的CpG ODNs并不总是导致立即upregulation炎症细胞因子和(2)TLR9识别receptor-ligand交互导致肠道内稳态的存在导致的延迟反应炎症细胞因子(41]。进一步的调查之间的关系需要阐明TLR9识别后,引起炎症反应刺激CpG ODNs军曹鱼的肠道。

CpG ODNs的刺激,活化的T辅助细胞免疫活性的草案到肠道粘膜,影响免疫细胞中分泌的趋化因子,如巨噬细胞、NK细胞,激活T细胞,确定后续Th1 / Th2免疫反应(42,43]。腹腔内注射的CpG ODN 1668年和2395年显著增加的mRNA表达趋化因子CC在军曹鱼肠3 dpi和6 dpi,分别,这可能是由于免疫细胞的接触Th1型属性注入CpG ODNs后肠道粘膜。在小猪管理CpG ODN D19,巨噬细胞和树突细胞的比例,以及CC趋化因子的表达,在肠道组织显著升高(24]。

CpG ODN 1668被认为是一个潜在的免疫刺激剂大西洋鲑鱼,鲤鱼,和日本的比目鱼44- - - - - -46]。在这项研究中,非CpG CpG ODN ODN 1668和CpG ODN 2395 (C类CpG ODN)也显示保护作用和显著提高军曹鱼的存活率和生活的挑战p . damselae无性系种群。piscicida。类似的结果发现,橄榄比目鱼注射CpG ODN 1668年和2395年存活率最高m . avidus和获得性迟发性大肠分别感染(47,48]。在老鼠模型中,政府仅CpG ODNs已经证明增加抵抗李氏杆菌病(49),幽门螺杆菌感染(50]。口服的CpG ODNs保护(90%)新生鼠隐孢子虫以及肠道感染(23,51]。很难准确地分析细胞因子水平之间的联系和存活率水生物种,因为只有非常有限的文献信息是可用的。在目前的研究中,趋化因子CC和il - 1的表达β在军曹鱼注射CpG ODNs显著增加。是否显著提高生存率在军曹鱼注射CpG ODN 1668年和2395年是由于调节细胞因子的表达需要证实了在未来的研究中。然而,据报道,过度激活免疫系统的大量生产的促炎细胞因子可能导致有害microcirculatory障碍、组织损伤、休克,甚至死亡在严重的情况下(52]。此外,不同类型的CpG ODNs可以引起不同的免疫反应,例如,调节基因的形象。CpG ODN 2395 c级轿车CpG ODNs,介于a级和b级车CpG ODNs免疫刺激性的活动(53]。的5′端CpG图案的c级轿车ODN必要诱导干扰素(IFN)α生产(54]。在这一地区的CpG ODNs,所需的序列似乎类似于b CpG ODNs, 5′的tcg非常关键免疫刺激性影响(55]。

CpG的影响ODNs适应性免疫的军曹鱼也是本研究探讨。制定CpG ODNs作为佐剂来增强疫苗的免疫原性被广泛研究老鼠,兔子,和牛56- - - - - -59]。FKB的结合、明矾和CpG ODNs(1668或2395)显著增强RCTLR9A的表达式和RCTLR9B控制ODN相比,2137年。据推测,CpG ODNs发起核内体的信号转导TLR9识别所在(60- - - - - -62年]。值得注意的是表达的增加TLR9识别(~ 50倍)军曹鱼注射CpG ODN 1688年制定与明矾和FKB显著高于军曹鱼注射CpG ODN 1688(~ 3折)。这表明,明矾和细菌抗原(FKB)刺激免疫反应移植TLR9识别的表达,这可能促进CpG ODNs的摄入。CpG ODNs和明矾协同合作,提高immune-potentiating和抗原节约效果的抗猪流感病毒的疫苗(63年),观察到当CpG ODNs或明矾是单独使用。RCTLR9A表达式(~ 5折)的增加和RCTLR9B军曹鱼注射控制ODN 213制定明矾和FKB可能归因于明矾和FKB的免疫刺激性影响。此外,ODNs phosphorothioate骨干没有CpG图案已被证明是非刺激TLR9-dependent或独立激活64年,65年]。表达的增加6点MyD88 dpi暗示TLR9识别Myd88-dependent信号通路的激活CpG ODNs,因为这是未见的军曹鱼注射控制ODN 2137。il - 1的表达β6点,促炎细胞因子显著调节dpi CpG ODNs军曹鱼注射,但不是控制ODN,明矾和FKB。在日本深陷泥潭,疫苗研究il - 1的转录β在接种疫苗和nonvaccinated组显著增加1 dpi表明处理和注射过程中接种疫苗可能诱发炎症反应暂时(66年]。虽然il - 1β一直显示移植在许多哺乳动物感染过程中,il - 1的表达吗β后远端肠道感染虹鳟鱼保持不变答:salmonicida(67年]。此外,il - 1的表达β可能会影响到的抗原存在于大西洋鳕鱼的后肠68年]。

鱼类疫苗与明矾盐制定普遍接受由于他们的安全和满意的免疫刺激性影响(69年]。在橄榄深陷泥潭,剂量为500克明矾单独每只鱼感应非常轻微的炎症没有异常的组织病理学变化(70年]。当剂量增加到1600g /鱼,严重的炎症和死亡率被观察到。在目前的研究中,只有45岁克明矾是用于我们的疫苗。此外,添加10g CpG ODNs疫苗配方没有造成不希望的副作用,比如固有层扩张,上皮细胞坏死,在注射部位出现的表示的组织学观察。

5。结论

军曹鱼的TLR9B基因克隆和配体结合区域CXXC图案被发现在军曹鱼TLR9B蛋白质。由于TLR9识别细胞受体CpG ODNs, CpG ODNs在肠道的免疫刺激性影响调查各种CpG ODNs军曹鱼鱼的腹腔内注射。结果显示,RCTLR9和促炎趋化因子基因表达的调节,并依赖于使用的CpG ODNs类型。中央人民政府ODNs注入军曹鱼也挑战生活后存活率显著增加p . damselae无性系种群。Piscicida。最后,adjuvanticity CpG ODNs制定了CpG ODNs军曹鱼作为疫苗的佐剂。军曹鱼的表情TLR9识别、MyD88和il - 1β显著升高军曹鱼注射CpG ODNs明矾和FKB制定。没有压倒性的炎症反应和组织损伤的迹象在注射部位出现的。应用CpG ODNs可以用来增加疫苗的抗病性和有效性在军曹鱼。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢陈斯通博士和Hso-Chi Chaung在兽医和动物疫苗技术研究所,温顿博士程在水产养殖部门,NPUST,和郭Jiin-Ju Tungkang生物技术研究中心博士,屏东,台湾,在这项研究的支持和讨论。他们感谢国际合作和发展基金(ICDF)、台湾、奖学金发放研究博士学位。

引用

1. l .高c .他x刘et al .,“鲶鱼的先天免疫相关基因,”国际分子科学杂志》上,13卷,不。11日,第14202 - 14172页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j·h·w·m·Rombout l . Abelli耶,g . Scapigliati诉目睹了,“硬骨鱼类的肠道免疫,”鱼类和贝类免疫学没有,卷。31日。5,616 - 626年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. r . a . Dalmo k Ingebrigtsen, j . Bogwald“非特异性防御机制在鱼类,特别指的是网状内皮系统(RES)”鱼类疾病杂志,20卷,不。4、241 - 273年,1997页。视图:谷歌学术搜索
4. c . m .媒体和Ø。Evensen”,硬骨鱼的免疫系统的形态,“鱼类和贝类免疫学,9卷,不。4、309 - 318年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. j·h·w·m·Rombout a . j . Taverne-Thiele和m . i Villena鲤鱼的内脏相关淋巴组织(GALT) (鲤属carpiol .):采用免疫分析,“发展和比较免疫学,17卷,不。1,55 - 66、1993页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. j . Van厕所,“菊苣果聚糖促进畜牧学的性能和福祉牲畜和伴侣动物,”营养学杂志》,卷137,不。11日,2007年。视图:谷歌学术搜索
7. 耶,l . Guerra f .据et al .,“肠道T细胞Dicentrarchus labrax(l):基因表达与功能研究”,鱼类和贝类免疫学,30卷,不。2、609 - 617年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. d·b·Iliev Skjæveland,和j·b·Jørgensen”CpG寡核苷酸结合TLR9识别在大西洋鲑鱼和RRM-Containing蛋白(大西洋鲑),“BMC免疫学,14卷,不。1,第十二条,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. j·h·w·m·Rombout a . a . van den Berg c·t·g·a . van den Berg·威特和大肠埃格伯特免疫鲤鱼的第二个肠段的重要性。三世。系统和/或粘膜免疫反应与可溶性或颗粒抗原免疫后,“鱼的生物学》杂志上,35卷,不。2、179 - 186年,1989页。视图:谷歌学术搜索
10. r .法国b . Cardazzo j . Antonello m . Castagnaro t . Patarnello和l . Bargelloni”全长序列和表达分析乌颊鱼鲷科鱼类的toll样受体9 (黄auratal .),“基因,卷378,不。1 - 2,42-51,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. y帕提,“toll样受体在硬骨鱼:从功能基因组学,”发展和比较免疫学,35卷,不。12日,第1272 - 1263页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. e .开罗”细菌与肠粘膜细胞的相互作用:toll样受体和NOD2,”肠道,54卷,不。8,1182 - 1193年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 美国Uematsu和s .彰”toll样受体和先天免疫。”分子医学杂志,卷84,不。9日,第725 - 712页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. k . j .麦凯维j .顿,p . a .黑森“TLR9识别亚型特异性表达的炎症,自身免疫杂志,36卷,不。1,第86 - 76页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. m . Gursel d . Verthelyi Gursel, k . j . Ishii和d . m . Klinman“微分和竞争人类免疫细胞的激活不同的CpG oligodeoxynucleotide类,“《白细胞生物学,卷71,不。5,813 - 820年,2002页。视图:谷歌学术搜索
16. t . k .毛Z.-X。丽安,c . Selmi et al .,“改变单核细胞反应定义TLR配体在原发性胆汁性肝硬化患者,”肝脏病学,42卷,不。4、802 - 808年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. C.-L。姚明,p .香港、Z.-Y。王et al .,“克隆和表达分析两个可变剪接的toll样受体在大黄鱼9 A和B亚型,稚鱼”,鱼类和贝类免疫学,25卷,不。5,648 - 656年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. a . m . Krieg”CpG图案在细菌的DNA和他们的免疫效果,”年度回顾的免疫学,20卷,第760 - 709页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. d . m . Klinman d·库里Gursel, d . Verthelyi,“使用CpG oligodeoxynucleotides作为免疫佐剂,”免疫学检查卷,199年,第216 - 201页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. z全部,g, t .善和z .丰镇发电厂CpG oligodinucleotides诱导体液和细胞反应在小猪猪链球菌的败血症疫苗在活的有机体内”,国际免疫药理学》第六卷,没有。3、342 - 350年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. j . Vollmer r . Weeratna p·帕耶特et al .,”表征的三个CpG oligodeoxynucleotide类不同免疫刺激性活动,“欧洲免疫学杂志,34卷,不。1,第262 - 251页,2004。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. g .哈特曼r·d·Weeratna z . k .半刚石et al .,“描述CpG phosphorothioate oligodeoxynucleotide激活灵长类动物的免疫反应在体外和在活的有机体内”,免疫学杂志,卷164,不。3、1617 - 1624年,2000页。视图:谷歌学术搜索
23. s . Lacroix-Lamande n . Rochereau r . Mancassola m .障碍,a . Clauzon f·劳伦特,“新生儿肠道免疫反应CpG oligodeoxynucleotide刺激,”《公共科学图书馆•综合》,4卷,不。12篇文章ID e8291 2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 程,c .徐l . Zhang j . Li t·曹和m .张“管理CpG oligodeoxynucleotide诱发mRNA的表达科学家和CC趋化因子在仔猪的肠道粘膜和PBMCs,”国际免疫药理学,10卷,不。5,611 - 618年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. Skjæveland, d . b . Iliev j .邹t . Jørgensen和j·b·Jørgensen”会上调干扰素- TLR9识别相同器官γ在大西洋鲑鱼(大西洋鲑),“发展和比较免疫学,32卷,不。6,603 - 607年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. 答:单面山,萨利纳斯,m。埃斯特万,j . Meseguer“Unmethylated CpG图案模仿细菌DNA触发本地和系统性先天免疫参数在乌颊鱼鲷科鱼类immune-relevant基因的表达,”鱼类和贝类免疫学,25卷,不。5,617 - 624年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. c。刘,y太阳,中州。胡,l .太阳,“识别和分析的CpG主题保护大菱(Scophthalmus马克西姆斯)对细菌挑战和提高诱发特定免疫力,”疫苗,28卷,不。25日,第4161 - 4153页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. c . f . Chang, j·h·杨和s . l . Chang”饮食的应用程序$\beta$1、3 - 1、6-glucan增强抵抗军曹鱼(Rachycentron canadum)对发光细菌damselae无性系种群。piscicida和链球菌iniae感染。”台湾渔业研究杂志》上,14卷,第87 - 75页,2006年。视图:谷歌学术搜索
29. c·洛佩兹,p . r . Rajan j . H.-Y。林,T.-Y。郭,H.-L。杨:“疾病暴发seafarmed军曹鱼(Rachycentron canadum)与弧菌Spp。发光细菌damselaessp。piscicida,monogenean和myxosporean寄生虫。”《欧洲鱼类病理学家协会,22卷,不。3、206 - 211年,2002页。视图:谷歌学术搜索
30. P.-C。刘,j . I.-Y。林,K.-K。李,“毒性发光细菌damselae无性系种群。piscicida在培养军曹鱼Rachycentron canadum”,基础微生物学杂志,43卷,不。6,499 - 507年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. s . c .陈和c .许”的致病性和病理学研究发光细菌damselae无性系种群。piscicida在Rachycentron canadum”,台湾渔业协会杂志》上32卷,2005。视图:谷歌学术搜索
32. b . Magarinos j·l·Romalde m . Noya j·l·嚎叫和a . e . Toranzo“坚持和鱼的病原体入侵能力巴斯德菌piscicida”,《微生物学字母,卷138,不。1,29-34,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. m . v . Lopez-Doriga a·c·巴恩斯n . m . s .多斯桑托斯和a·e·埃利斯”入侵鱼类上皮细胞发光细菌damselaesuksp。piscicida:受体特异性的证据,胶囊和血清的影响。”微生物学,卷146,不。1、21 - 30,2000页。视图:谷歌学术搜索
34. g . Lu和e·n·本森山”向量NTI,平衡一体化的序列分析套件,”简报的生物信息学,5卷,不。4、378 - 388年,2004页。视图:谷歌学术搜索
35. s·r·m·琼斯·m·d·快,s . c·约翰逊和d . b . Groman“微分拒绝由粉红色和大麻哈鱼鲑鱼虱子:疾病后果和促炎基因的表达,”水生生物的疾病,卷75,不。3、229 - 238年,2007页。视图:谷歌学术搜索
36. k . j . Livak和t . d . Schmittgen相对基因表达数据的分析利用实时定量PCR和2-ΔΔCT方法,”方法,25卷,不。4、402 - 408年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. j·k·贝尔·g·e·d·马伦c . a . leifei一起a .玛·d·r·戴维斯和d·m·西格尔,”富亮氨酸重复和病原体识别toll样受体。”免疫学的趋势,24卷,不。10日,528 - 533年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. m·巴苏情郎,b . r . Sahoo n . k . Maiti和m . Samanta“感应toll样受体(TLR) 2, MyD88-dependent TLR-signaling配体刺激和细菌感染在印度主要的鲤鱼,mrigal (Cirrhinus mrigala),“分子生物学报告,39卷,不。5,6015 - 6028年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. l·安德森,m·w·马修森j . Rask-Madsen j . Brynskov彼得森和g”9 toll样受体的表达和应对细菌cpg oligodeoxynucleotides在人类肠道上皮细胞,”临床和实验免疫学,卷141,不。2、298 - 306年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. j·b·Ewaschuk j·l .支持者t·a·丘吉尔f . Obermeier d·o·克劳斯和k·l·马德森,“表面toll样受体的表达9是调节肠上皮细胞致病细菌的DNA,”感染和免疫,卷75,不。5,2572 - 2579年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. s . Rakoff-Nahoum j . Paglino f . Eslami-Varzaneh s Edberg和r . Medzhitov”承认共生的微生物区系肠道内稳态,需要通过toll样受体”细胞,卷118,不。2、229 - 241年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. d·d·托布k康伦,a·r·劳埃德·j·j·奥本海姆,和d·j·k”优惠CD4迁移激活⁺和CD8⁺MIP-1 T细胞的反应α和MIP-Iβ”,科学,卷260,不。5106年,第358 - 355页,1993年。视图:谷歌学术搜索
43. m . Uguccioni m . D 'Apuzzo m . Loetscher b . Dewald和m . Baggiolini”行动的趋化细胞因子MCP-1 MCP-2, MCP-3,咆哮,MIP-1α和MIP-1β对人类单核细胞。”欧洲免疫学杂志,25卷,不。1,第68 - 64页,1995。视图:谷歌学术搜索
44. A·c·卡灵顿和c . j . Secombes”回顾论文认定及其与水产养殖,“兽医免疫学和免疫病理,卷112,不。3 - 4、87 - 101年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. j·b·Jørgensen j .邹a·约翰森和c . j . Secombes免疫刺激性CpG oligodeoxynucleotides刺激il - 1的表达β和虹鳟鱼interferon-like细胞因子通过chloroquine-sensitive巨噬细胞机制,“鱼类和贝类免疫学,11卷,不。8,673 - 682年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. e·h·李和k·h·金橄榄比目鱼“CpG-ODN增加电阻(Paralichthys olivaceus)对Philasterides dicentrarchi(纤毛亚门:Scuticociliatia)感染。”鱼类和贝类免疫学,26卷,不。1,29-32,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. y . j .康和k·h·金CpG-ODNs属于不同的类对阻力的影响橄榄比目鱼(Paralichthys olivaceus)与病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和Miamiensis avidus(Ciliata;Scuticociliatia)感染,”水产养殖卷,324 - 325年39-43,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. c·h·李·h·d·宋,j·k·钟,h·h·李,和k·h·金CpG主题在合成ODN质数呼吸道的橄榄比目鱼Paralichthys olivaceus吞噬细胞,增加保护迟缓”,水生生物的疾病卷,56号1,43-48,2003页。视图:谷歌学术搜索
49. Ito, k . j . Ishii m . Gursel h . Shirotra a . Ihata和d . m . Klinman”CpG oligodeoxynucleotides提高新生儿抗感染李斯特菌。”免疫学杂志,卷174,不。2、777 - 782年,2005页。视图:谷歌学术搜索
50. Raghavan, j . Nystrom m·弗雷德里克松和a . m . Harandi j . Holmgren“口头管理CpG oligodeoxynucleotide诱发生产胃粘膜的科学家和CC趋化因子和抑制细菌殖民化幽门螺杆菌感染的小鼠模型,”感染和免疫,卷71,不。12日,第7022 - 7014页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. m .障碍,s . Lacroix-Lamande r . Mancassola et al .,“口服和腹腔内管理phosphorothioate oligodeoxynucleotides导致控制小球隐孢子虫的感染在新生儿的老鼠,”《传染病杂志》上的研究,卷193,不。10日,1400 - 1407年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. j·d·Zipris大肠Lien x谢,d·l·格林尼j . p . Mordes和a·a·罗西尼”TLR激活加强与BBDR Kilham鼠病毒感染诱发糖尿病老鼠,”免疫学杂志,卷174,不。1,第142 - 131页,2005。视图:谷歌学术搜索
53. 大肠Uhlmann和j . Vollmer“免疫刺激性寡核苷酸的发展,最新进展”目前看来在药物发现和开发》第六卷,没有。2、204 - 217年,2003页。视图:谷歌学术搜索
54. h . Tighe k . Takabayashi d·施瓦茨et al .,”结合的蛋白质免疫刺激性DNA结果在一个快速、持久和有效的诱导细胞介导体液免疫,”欧洲免疫学杂志,30卷,不。7,1939 - 1947年,2000页。视图:谷歌学术搜索
55. g . l . Morefield a . Sokolovska d .江h . Hogenesch j·p·罗宾逊,s . l .哼哼,“醇佐剂的作用在树突状细胞抗原内化在体外”,疫苗,23卷,不。13日,1588 - 1595年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
56. loannou x p, s·m·米斯b . Karvonen r·赫克l . a . Babiuk和s . Van Drunen Littel-Van窝Hurk,“CpG-containing oligodeoxynucleotides,结合传统佐剂增强免疫反应的大小和变化偏差疱疹病毒糖蛋白,”疫苗,21卷,不。1 - 2、127 - 137年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
57. loannou x p, p . Griebel r·赫克l . a . Babiuk和s . Van Drunen Littel-Van窝Hurk,“牛疱疹病毒的免疫原性和保护效果1糖蛋白D + emulsigen与CpG oligodeoxynucleotides增加了配方,”病毒学杂志,卷76,不。18日,第9010 - 9002页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
58. r·d·Weeratna m . j . McCluskie y,和h·l·戴维斯,“CpG DNA产生更强的免疫反应与毒性低于其他佐剂,”疫苗,18卷,不。17日,第1762 - 1755页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
59. loannou x p, s·m·戈麦斯r·赫克l . a . Babiuk和s . Van Drunen Littel-van窝Hurk,“安全性和有效性的CpG-containing oligodeoxynucleotides作为免疫佐剂的兔子,“疫苗,21卷,不。研究,4368 - 4372年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
60. 竹内h . Hemmi o . t . Kawai et al .,“toll样受体识别细菌的DNA。”自然,卷408,不。6813年,第745 - 740页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
61. h .黑客,h . Mischak t Miethke et al .,“CpG-DNA-specific抗原递呈细胞的激活需要压力激酶活性和由非特异性内吞作用和endosomal成熟之前,“EMBO杂志,17卷,不。21日,第6240 - 6230页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
62. A.-K。易和a . m . Krieg“前沿:快速诱导免疫刺激增殖作用蛋白激酶的CpG DNA,”免疫学杂志,卷161,不。9日,第4497 - 4493页,1998年。视图:谷歌学术搜索
63. m·龚j .周c·杨et al .,“昆虫cell-expressed血凝素与CpG oligodeoxynucleotides加明矾作为大流行性流感疫苗佐剂是一个潜在的候选人,”疫苗,30卷,不。52岁,7498 - 7505年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
64. t·l·罗伯茨,m . j .甜,d·a·休谟和k·j·斯泰西,”前沿:导致的CpG的TLR9-mediated识别和non-CpG phosphorothioate-modified寡核苷酸,”免疫学杂志,卷174,不。2、605 - 608年,2005页。视图:谷歌学术搜索
65. j . Vollmer r·d·Weeratna m . Jurk et al .,“Oligodeoxynucleotides缺乏CpG二核苷酸调解toll样受体9依赖辅助T 2型免疫刺激偏见,”免疫学,卷113,不。2、212 - 223年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
66. m . d .快,s . c·约翰逊和s r·m·琼斯”微分表达式的促炎细胞因子il - 1β1、肿瘤坏死因子α1,引发接种粉红色(雄鱼gorbuscha)和密友(雄鱼大麻哈鱼鲑鱼青少年。”鱼类和贝类免疫学,22卷,不。4、403 - 407年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
67. c·m·a . Caipang”在早期免疫反应相关基因的表达的远端部分肠道在大西洋鳕鱼,Gadus morhual与细菌抗原疫苗接种后,“水产养殖国际,21卷,不。3、591 - 603年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
68. 即穆德,s·沃兹沃思和c . j . Secombes“肠虹鳟鱼(细胞因子的表达雄鱼mykiss)在感染气单胞菌属salmonicida”,鱼类和贝类免疫学,23卷,不。4、747 - 759年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
69. r . Gudding a . Lillehaug p . j . Midtlyng f·布朗,鱼疫苗学:生物标准化的发展Karger卷。90年,1997年瑞士巴塞尔。
70. T.-N。Vinay, c。公园,H.-Y。金,S.-J。容格”,毒性和剂量测定quillaja皂素,氢氧化铝在橄榄比目鱼和角鲨烯(Paralichthys olivaceus),“兽医免疫学和免疫病理,卷158,不。1 - 2、73 - 85年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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