新见解IL-10-Deficient小鼠的免疫变化过程中自发的肠道粘膜的炎症

文摘

细胞因子il - 10是一个监管的过程中起着重要作用的体内平衡肠道和这个事实,il - 10所示^−−/老鼠发展自发结肠炎。在这项研究中,il - 10^−−/在结肠炎小鼠免疫变化分析的发展。我们发现调节性T细胞的频率降低和更高的频率激活T细胞在结肠内的宏观疾病的迹象。IL-17和干扰素的生产γ在结肠更高。结肠炎发展高潮的减少调节性T细胞在小肠。B1细胞和分泌IgA生产频率升高。尽管有这些变化,16-week-old il - 10^−−/老鼠可以通过连续喂养呈现宽容协议。我们的研究提供了详细的分析的变化先于结肠炎,它也表明,口服宽容可以用来设计新颖的替代疗法的疾病。

1。介绍

小肠是最大的接触面之间的身体和外部环境(1]。大多数接触外国抗原材料发生在肠道粘膜。据报道,130 - 190克的蛋白质在小肠吸收日常(2)和胃肠道港口大约10¹⁴超过1000种主要在结肠微生物(3]。所有这些抗原接触发挥重要作用在免疫系统的发展。成年小鼠饲养从断奶到节食只含有氨基酸作为氮源有大幅减少内脏相关的淋巴组织和免疫球蛋白/ IgA生产的免疫表型类似幼鼠(4]。无菌鼠显示类似的免疫改变(5]。在生理条件下,持续暴露在这些天然抗原通过肠道粘膜导致当地和系统性免疫活动,如分泌免疫球蛋白(sIgA)生产和口服耐受诱导6]。

口服耐受通常被定义为特定的细胞和/或抑制体液免疫反应的抗原以前给出的路线(口语7]。发展的几种机制提出了口头宽容,从删除抗原T细胞免疫偏差和抑制调节性T细胞(6]。小鼠模型和人体组织的研究表明,炎症性肠病(IBD)是一个崩溃的结果正常粘膜耐受性腔的抗原。慢性炎性肠道疾病被认为是由遗传和环境因素交互包括改变肠道抗原的T细胞反应(8,9]。宽容原地微生物群似乎被打破在IBD患者提供证据表明,炎症反应性无处不在的抗原从微生物群与IBD的起始和/或延续10]。

一些小鼠结肠炎模型强调了免疫系统的异常重要的作用,尤其是那些影响T细胞,可能在疾病发病机理。这些模型包括老鼠携带HLA B27的转基因β2-microglobulin,老鼠的基因编码- 2、il - 10α或βT细胞受体缺失链(8]。在同一条线上,研究使用T cell-restored免疫缺陷小鼠CD4提供了证据⁺T细胞中发挥关键作用的诱导和调节肠道炎症。细胞转移CD45RB^高CD4⁺正常小鼠的T细胞捐献者为C。b -重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠的发展导致了一场严重的炎症反应在冒号(11]。这种疾病是可以预防的cotransfer CD45RB^低子集和白介素il - 10是一个重要的中介这个调节性T细胞产生的人口(12]。

il - 10是由调节性T细胞和其他细胞类型包括上皮细胞、激活巨噬细胞、树突细胞和B1细胞。细胞因子il - 10是一个关键的免疫抑制,直接作用于抗原递呈细胞(APC)可以抑制il - 12的分泌,调节分子mhc ii的表达以及costimulatory CD80和CD86等(13]。这种调节行动APC间接抑制T细胞的活化作用。一些研究还表明,il - 10的有力costimulant B细胞分化和免疫球蛋白分泌14]。细胞因子的重要性在塑造粘膜免疫反应已经证明的自发出现肠道炎症IL-10-deficient (il - 10^−−/)鼠标15]。

在常规情况下,il - 10^−−/慢性小肠结肠炎小鼠开发2 - 3个月的年龄,没有新生儿疾病的证据。这种疾病的特征是减肥,脾肿大,轻度到中度贫血。如果保持在特定的无菌(SPF)条件下,小鼠建立一个有限形式的结肠炎(16]。典型的炎症病变发现不连续、透壁的影响通常降低胃肠道,与小肠的影响较小。其他病理变化包括上皮增生、粘液素耗竭,隐窝脓肿,溃疡,肠壁增厚。炎性浸润由淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞(15]。结肠炎的il - 10的发展^−−/似乎由CD4细胞⁺T细胞和一个不受控制的Th1反应(17]。此外,大量的炎症介质如il - 1的生产过剩β、白介素、肿瘤坏死因子(TNF)α,发现在小鼠结肠炎的文化18]。

尽管小肠结肠炎在il - 10的事实^−−/老鼠显示特征典型的克罗恩氏病,包括地下室增生,肉芽肿的少见,纤维化,没有裂缝和管状器官,这个实验模型与克罗恩病透壁的和不连续的炎症。这不仅会影响结肠炎症还小肠(19]。事实上,人类的克罗恩病可能影响消化道但最常涉及的任何部分小肠(20.]。

本研究旨在描述形态和免疫学改变肠道粘膜的il - 10^−−/6、10或16周的年龄,覆盖一段从出现症状到小肠结肠炎。我们分析了炎性疾病的每个阶段的特点以及公认的免疫调节机制可能涉及的变化。因为大多数的基因缺陷动物用作IBD出生没有结肠炎实验模型[迹象21,22),他们构成一个机会来研究疾病前的免疫学变化。

2。材料和方法

2.1。动物

野生型(WT)和IL-10-deficient (il - 10^−−/)老鼠129 sv /电动汽车背景获得Donna-Marie McCafferty的实验室(卡尔加里大学,卡尔加里,加拿大)。所有小鼠饲养和安置在我们的设施在大学联邦德·米纳斯吉拉斯,巴西。老鼠在microisolators热压处理过的标准食物和水,直到断奶。断奶后,所有老鼠都保持在传统设施(打开笼子里)。动物研究6、10和16周的年龄和年龄野生型老鼠129 sv /电动车被用作控制。所有程序都是通过动物研究当地伦理委员会(协议没有。170/2008,CETEA-UFMG、巴西)。

2.2。结肠炎的宏观和微观评估

结肠切除、结肠炎症使用之前定义的scoringsystem评估,其中包括临床结肠炎的特性,如粘连的存在与否,狭窄和腹泻(腹泻定义为松散、水样粪便),和肠道壁厚(以毫米)。结肠癌在福尔马林固定和样品处理进行微观分析。Hematoxylin-eosin-stained部分是盲目地得分基于半定量的评分系统前面描述的(23在以下特性分级:正常粘膜结构的破坏程度(0:正常;1、2和3:轻度,中度,和广泛的破坏,职责),存在和程度的细胞浸润(0:正常;1、2和3:轻微、中等、透壁的浸润,职责),肌肉增厚的程度(0:正常;1、2和3:轻微、中等和广泛增厚,职责),隐窝脓肿存在与否(0:缺席;1:存在)和杯状细胞耗竭的存在与否(0:缺席;1:存在)。分数为每个特性总结11的最大可能得分。

2.3。肠道组织准备和细胞因子测定

肠分为十二指肠、空肠近端、远端空肠、回肠、结肠和放置在缓冲溶液(1毫升/ 0.1 g)。组织碎片是均质和离心10分钟600 g在4°C。上层清液收集细胞因子测定。盘子被涂上一层纯化单克隆抗体与细胞因子活性IL-17A, il - 6, TGF -β和干扰素-γ(BD-Pharmingen)一夜之间在4°C。的,第二天,洗井,添加了上层清液,板是孵化一夜之间在4°C。在第三天,生物素化的单克隆抗体对细胞因子增加了和盘子被孵化在室温下2小时。颜色反应在室温下了100μ信用证的orthophenylenediamine(1毫克/毫升),0.04%的H₂O₂在柠檬酸钠缓冲衬底。反应被添加20μL / 2 N H₂所以₄。吸光度测量在492 nm ELISA读者(BIO-RAD)。

2.4。细胞制备和流式细胞术分析

上皮内淋巴细胞(IELs)被孤立的一个修改版本的方法描述了戴维斯和帕洛特24]。短暂,整个长度的小和大肠解剖,纵向剖开,用PBS洗净,切成小块。组织碎片被放置在培养皿和水洗三次钙和magnesium-free hbs含2%胎牛血清的边后卫。之后,组织碎片被转移到培养瓶和孵化在哈佛商学院的37°C包含1毫米DL-dithiothreitol (DTT-Sigma) 30分钟,两次。上层清液过滤70μm细胞过滤器和IEL分数一直在冰上。为固有层(LP)细胞分离、组织碎片被孵化与100 U /毫升的胶原酶II(σ)60分钟37°C瓶。上层清液经过70人μm细胞过滤器然后ressuspended媒介。细胞悬浮在44% Percoll解决方案,分层Percoll解决方案的67%,在600 g离心20分钟在4°C。收集IELs Percoll梯度之间的接口。细胞IEL和LP隔间被贴上FITC-conjugated anti-mouse CD4, CD5和CD25 PE-conjugated anti-mouse CD25、Thy1.2, CD44,识别γδ细胞受体),αβ和Foxp3 Cy5-conjugated anti-mouse CD69、CD19和生物素anti-mouse圈(BD Pharmingen)。从脾细胞,派尔集合淋巴结补丁、腹膜和骨髓都贴上FITC-conjugated anti-mouse CD5和Cy5-conjugated anti-mouse CD19。细胞分析FACSCan (Becton & Dickinson)和数据分析FlowJo (TreeStar)。至少30000事件是计算每个样本。

2.5。分析ELISA的搞笑同形像

特定水平的卵清蛋白(Ova)和总免疫球蛋白ELISA测定。简而言之,96 -孔板(Nunc)被涂上一层2μ卵子或0.1 g /好μg山羊anti-mouse UNLB抗体,一夜之间在涂层缓冲pH值9.8。与200年井洗和阻塞μL PBS含有0.25%酪蛋白的1 h在室温下。血清被添加到板和孵化1 h在室温下,洗盘子,然后peroxidase-streptavidin山羊anti-mouse或鼠抗体(南方生物技术)1:15000年补充道,和盘子被孵化1 h在37°C。颜色反应在室温下了100μ信用证的orthophenylenediamine(1毫克/毫升)(σ),0.04%的H₂O₂在柠檬酸钠缓冲衬底。反应被添加20μL / 2 N H₂所以₄。吸光度测量在492 nm的ELISA标(Bio-Rad)。

2.6。口服耐受诱导

口服耐受卵子是引起胃内的政府(填喂法)的一剂20毫克卵子(σ)0.2毫升生理盐水(0.15 M氯化钠),7天前主要免疫。对照组收到0.2毫升的生理盐水。另外,老鼠收到4毫克/毫升溶液的卵子在水中的专属喝液体。一只老鼠的平均摄入量自愿在24小时大约5毫升;因此,动物被认为摄取卵子20毫克/天。对照组收到过滤后的自来水。口服治疗肠外免疫前7天停止。老鼠积极敏感的腹腔内注射0.2包含10毫升的盐水μ克卵子吸附在1毫克的氢氧化铝。十四天后,动物收到相同剂量的卵子在PBS。

2.7。统计分析

结果表示为平均值±标准平均误差(SEM)。Kolmogorov-Smirnov测试,证实了正态分布的样本。组间差异的重要性是由学生的决定t以及或方差分析(方差分析)(图基的期末测验)。意味着被认为是统计上的不同。

3所示。结果

3.1。结肠炎的评估过程中肠道炎症

宏观观察和结肠粘膜组织学评分在6 - 10 -或16-week-old il - 10^−−/老鼠和与野生型老鼠。il - 10^−−/老鼠显示正常结肠组织出现在6周的年龄没有宏观疾病(数据的迹象1 (b),2(一个),2 (b))。10周的年龄,il - 10^−−/老鼠了轻度结肠炎(图1 (c))的严重程度,到达了一个高原年龄(图16周1 (d))。宏观的分数没有增加疾病自成立后10 -或16-week-old il - 10^−−/小鼠显示出类似的分数(图2(一个))。

(一)

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(c)

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(f)

(g)

(h)

图1

^−−/ ^−−/ ^−−/ ^−−/ ^−−/ ^−−/ ^−−/ 固有层 il - 10的肠组织病理学变化老鼠。(一)组织学的近端结肠代表野生型小鼠(129 sv / Ev) (40 x)。之间没有细胞浸润腺体被发现。(b)近端结肠6周大的il - 10老鼠(40 x)。黏膜和黏膜下层是类似于野生型老鼠的。(c)近端结肠10周大的il - 10老鼠(40 x)。多病灶的入渗的白细胞的黏膜和黏膜下层。(d)近端结肠16-week-old il - 10老鼠(40 x)。影响肌肉层的透壁的炎症可以观察到。(e)近端空肠野生型小鼠(100 x)的代表。6周大il - 10 (f)近端空肠老鼠(100 x)。(g)近端空肠10周大的il - 10老鼠(100 x)。(h)近端空肠16-week-old il - 10老鼠显示肠炎和细胞的渗透(星号)(100 x)。组织与苏木精和伊红染色。

(一)

(b)

(c)

(d)

图2

^−−/ ^−−/ ^−−/ ^−−/ ^−−/ αβ γδ 炎症的il - 10和IEL概要文件。(一)宏观il - 10的分数老鼠在6、10或16周的年龄和控制与野生型老鼠。(b)微观il - 10的分数老鼠在6、10或16周的年龄和控制与野生型小鼠结肠组织的组织学分析得到的。(c)绒毛/地下室比十二指肠、空肠近端、远端空肠和回肠的il - 10老鼠在6岁或16周。酒吧代表均值±5老鼠每组的扫描电镜。星号代表不同年龄匹配WT组在同一肠段(*或* *)。(d)流式细胞术分析频率IEL隔绝16-week-old il - 10和控制老鼠与荧光抗体染色细胞受体,识别和Thy1.2。分析了细胞内总淋巴细胞门。酒吧代表3老鼠每组的均值±SEM。显著差异(* *)是由星号表示。n。d意味着非检测。

3.2。小肠形态学和IEL在IL-10-Deficient老鼠

关于小肠炎症变化的影响,先前的一项研究描述了il - 10^−−/老鼠可以开发肠炎在常规条件下(15]。小肠的组织学分析显示炎症信号只在近端空肠16-week-old il - 10^−−/老鼠(图1 (h))。他们已经改变了绒毛/地下室比率(图2 (c)由于绒毛缩短)。值得注意的,6周大的老鼠绒毛/地下室比类似于年长的老鼠(图2 (c)),但这是由于更高的隐窝的大小。Intraephithelial淋巴细胞(IELs)参与维护肠道上皮细胞的完整性(25]。频率的识别αβ和细胞γδ在16-week-old il - 10 IEL数量进行了分析^−−/老鼠。我们使用IELs Thy1.2作为标记来区分激活。尽管类似频率的识别αβ和细胞γδIELs,减少Thy1.2的百分比⁺细胞受体γδ⁺在il - 10 IEL数量^−−/老鼠,而没有改变被发现在Thy1.2的频率⁺细胞受体αβ⁺IELs(图2 (d))。

3.3。IL-10-Deficient小鼠降低频率的调节性T细胞在小肠

在协议与其他的研究中,我们发现CD4的频率的增加⁺CD44⁺在IL-10-deficient小鼠结肠6和16周的年龄,但是nonaltered频率小肠(图3(一个))。没有差别的频率在T细胞CD69表达激活早期标志⁺小型和大型肠段的6 -或16-week-old il - 10^−−/小鼠与野生型同行相比。值得注意的是,激活CD69的频率⁺T淋巴细胞数量随年龄增加野生型和il - 10^−−/老鼠只有在大肠(图3 (b))。CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞是减少的固有层il - 10的大肠^−−/老鼠,不管他们的年龄(图3 (c))。CD4⁺CD25⁺腿上⁺人口减少淋巴细胞的il - 10的小肠和大肠^−−/在16周的年龄。然而,CD4的频率⁺CD25⁺腿上⁺增强T细胞是随着年龄的增长在野生型小鼠的小肠和大肠(图3 (d))。

(一)

(b)

(c)

(d)

图3

固有层 ^−−/ 固有层 ^−−/ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ 在T淋巴细胞概要文件小和il - 10的大肠小鼠的肠道炎症。T细胞从小型和大肠获得6 -或16-week-old il - 10老鼠。年龄129 sv /电动汽车(WT)小鼠作为控制。频率的CD4CD44(一)、CD4细胞CD69CD4(b)CD25Foxp3(c)和CD4细胞CD25腿上(d)T细胞CD4的大门T细胞通过流式细胞术进行评估。酒吧代表4老鼠每组的均值±SEM。显著差异(*,* *或* * *)是由星号表示。

3.4。细胞因子分泌的变化IL-10-Deficient小鼠的小肠和大肠

细胞因子il - 10^−−/老鼠是在结肠中提取特征(18]。但是,没有信息的影响缺乏il - 10在小肠。IL-17A生产增强结肠的流行IL-10-deficient老鼠和十二指肠的减少只10周大的il - 10^−−/老鼠(图4(一))。我们发现改变il - 6在il - 10的远端空肠^−−/小鼠10和16周的年龄。水平的il - 6在16-week-old il - 10的结肠^−−/老鼠(图4 (b))。另一方面,生产的抗炎细胞因子TGF -β在il - 10^−−/增加小鼠结肠在近端空肠10周的年龄和年龄(图16周4 (c))。16-week-old il - 10^−−/小鼠水平的提高干扰素-γ在冒号(图4 (d))。

(一)

(b)

(c)

(d)

图4

^−−/ β γ 生产过程中肠粘膜细胞因子的肠道炎症。肠子从il - 106、10或16周的年龄被分为十二指肠、空肠近端、远端空肠、回肠和均质提取缓冲。年龄129 sv /电动汽车(WT)小鼠作为控制。提取上清液对细胞因子测定收集。IL-17A (a), il - 6 (b), TGF -(c)和干扰素-通过ELISA (d)测量。老鼠每组。星号表示组间差异在同一肠段(*,* *或* * *)。

3.5。频率B1的腹膜和肠道固有层淋巴细胞增加IL-10-Deficient小鼠结肠炎

由于il - 10的有力costimulant B细胞分化,免疫球蛋白分泌和代B1细胞(14),我们的下一步是调查的影响il - 10 B淋巴细胞数量不足和免疫球蛋白生产。没有显著的变化的频率在脾脏B淋巴细胞(SP),腹膜(PT),派尔集合淋巴结补丁(PP)和肠道固有层(LP),但这些细胞的频率减少骨髓(BM)(图所示5(一个))。有趣的是,B1的频率在腹膜淋巴细胞,派尔集合淋巴结补丁固有层小和大肠增强il - 10^−−/老鼠的年龄在16周(图5 (b))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

图5

固有层 ^−−/ ⁺ ⁺ ⁺ ⁺ ^−−/ B细胞和免疫球蛋白在小肠结肠炎的发展同形像。从脾(SP)细胞,骨髓(BM),腹膜(PT),集合淋巴结补丁(PP),或(LP)小或大肠16-week-old il - 10老鼠。CD19的频率B细胞(a)或CD19CD5(b)封闭在淋巴细胞或CD19人口,通过流式细胞仪,分别进行了评估。酒吧代表4老鼠每组的均值±SEM。星号表示组间差异()。血清从4 - 6 - 10,或者16-week-old il - 10老鼠收集和总IgM (c)、免疫球蛋白g (d), IgA (e), IgE (f)由ELISA测定。美大:任意单位。酒吧代表均值±5老鼠每组的扫描电镜。显著差异(*,* *或* * *)是由星号表示。

3.6。血清免疫球蛋白水平改变疾病过程中在IL-10-Deficient老鼠

我们调查是否生产不同类型的免疫球蛋白在IL-10-deficient老鼠因为断奶和改变的过程中肠道炎症。没有差别的血清免疫球蛋白水平,IgM, IgA IL-10-deficient老鼠在4周的年龄(数字5 (c)- - - - - -5 (e))。然而,在6周的年龄,IL-10-deficient小鼠增强IgM水平和降低水平的免疫球蛋白水平相比,发现老鼠在4周的年龄。在这个年龄(数字IgA的水平持平5 (c)- - - - - -5 (e))。在10周的年纪,il - 10^−−/小鼠血清免疫球蛋白浓度升高了。血清IgA增强il - 10^−−/老鼠从4到10周的年龄和在小鼠(图16个星期再次上升5 (e))。的IgE水平在所有年龄段分析(图中是相似的5 (f))。

3.7。IL-10-Deficient建立小鼠肠道炎症可以呈现宽容只有连续喂养

最后,我们测试了il - 10的影响缺乏和结肠炎发展的两个主要发生在肠道黏膜免疫活动:分泌IgA (sIgA)生产和口服耐受诱导。在粪便sIgA浓度测量。类似于什么已经被描述在文献中,il - 10^−−/小鼠水平增强sIgA时建立炎症(10周的年龄),但没有发现差异在小鼠结肠炎的发病4或6周的年龄。有趣的是,老鼠的年龄在16周明显炎症再次sIgA(图中没有显示更改6(一))。为口服耐受诱导试验,小鼠喂20毫克卵子胃内的政府(填喂法)或给定一个卵子的解决方案作为一天唯一的液体源(连续喂养)。他们是腹腔内用相同的抗原佐剂免疫之后7天。anti-Ova IgE水平减少野生型(129 sv / Ev)和il - 10^−−/老鼠接受卵子之前连续喂养或填喂法免疫接种组相比(图6 (b))。然而,只有IL-10-deficient老鼠不断美联储卵子可以呈现宽容anti-Ova IgG1生产(图6 (c))。

(一)

(b)

(c)

图6

^−−/ ^−−/ μ 分泌IgA和口头宽容。肠道粪便4 - 6 - 10,或者16-week-old il - 10老鼠收集和总sIgA (a)通过ELISA测定。16-week-old il - 10或野生型老鼠卵子通过填喂法或连续的喂养。七天后小鼠致敏的腹腔内(i.p)注射0.2毫升生理盐水(0.9%氯化钠)解决方案包含10g卵子(σ,圣路易斯,密苏里州)吸附在1毫克氢氧化铝。十四天后,动物收到相同剂量的卵子在PBS。控制动物收到0.2毫升无菌生理盐水。Anti-Ova IgE和IgG1抗体ELISA测定。美大:任意单位。酒吧代表均值±5老鼠每组的扫描电镜。星号代表不同群体(*或* * *)。

4所示。讨论

肠道炎症的小鼠模型中发挥了关键作用的理解管理的机制,在肠道炎症反应,并在设计新的治疗策略对人类克罗恩病和溃疡性结肠炎。实验模型的IBD通常涉及上皮完整性缺陷/渗透率或在监管元素免疫系统的8]。一些病理和免疫变化这些模型之间是明显不同的。例如,化学模型由葡聚糖硫酸酯钠(DSS)显示炎症特征类似于溃疡性结肠炎,而il - 10^−−/炎症与克罗恩病有透壁的结肠粘膜的炎症。事实上,我们发现,il - 10^−−/老鼠有一个生产过剩的干扰素-γ和IL-17(图4),而在DSS-induced模型结肠炎发生的il - 6、TNF -α,正γ在不改变IL-17生产(数据未显示)。值得注意的是,我们观察到的频率减少调节性T细胞在小鼠DSS-induced结肠炎(数据未显示)同样被发现在il - 10^−−/老鼠(图3)。然而,在DSS-induced结肠炎,最早的组织学变化先于临床结肠炎隐窝上皮细胞的损失。炎症后才成为重要的侵蚀的外观。另一方面,IL-10-deficient老鼠,炎症之前建立临床检测疾病和发生自发。因此,il - 10的模型^−−/老鼠提供了一个机会来研究病理生理学和免疫学变化之前和伴随疾病的发展。

在本研究中我们使用IL-10-deficient老鼠129 sv /电动车的遗传背景。尽管宏观疾病可以在3个月大的时候发现IL-10-deficient老鼠,肠道病变的严重程度不同遗传背景的老鼠。他们是129年最严重的sv /电动汽车和BALB / c株,129年中级程度的x C57BL / 6 j小鼠混合,在C57BL / 6 j和最严重的压力。因此,129 sv /电动车应变敏感性被认为是最高的一个与同质结肠炎发展疾病的临床表现在易感动物(19]。因为在防晒系数条件下这些老鼠表现出只小病变近端结肠的粘膜16),我们选择用老鼠进行我们的研究保持在传统条件下,导致小肠结肠炎的全面发展。

在6周的年龄,刚刚断奶,没有组织学炎症的迹象中观察到这些老鼠的大肠。另一方面,IL-10-deficient老鼠在10周的年龄显示已经建立了小肠结肠炎浸润的白细胞在肠道黏膜和黏膜下层区域。严重疾病的进展,因为他们年龄,16-week-old老鼠显示结肠透壁的炎症。参数如il - 10的小肠结肠炎的发病和严重程度^−−/根据动物设施,老鼠老鼠不同。Rederivation IL-10-deficient老鼠从传统SPF环境到无菌隔离器消除结肠炎开发,显然证明微生物群的影响建立疾病(16]。此外,IL-10-deficient影响小鼠的肠外繁殖股票相同但保持在两个不同的设施在组织病理学评分显著差异在同一年龄。这些差异是由饮食和其原料的来源和水处理(热压处理过的),因为健康监测的两个殖民地代表相同的SPF状态(26]。伯格和同事小多病灶的浸润,报道固有层质询il - 10的结肠^−−/老鼠而12个il - 10^−−/老鼠多病灶的病变和大肠上皮增生在所有地区19]。因此,在老鼠住在我们的动物设施,小肠结肠炎的发病被推迟但进展得更快。

在这项研究中,我们评估不仅大肠炎性变化,而且IL-10-deficient小肠的老鼠。尽管没有可见小肠炎症在6周的年龄,绒毛/地下室比率减少,这种改变是观察直到成年的年龄(16周)。改变绒毛/地下室形态已经报道的免疫介导的肠道疾病,包括腹腔疾病,克罗恩病和溃疡性结肠炎。这种类型的变化是由于加速上皮营业额和引发的凋亡细胞因子释放自己从浸润炎症细胞和肠上皮细胞(27]。这可能会导致我们在16-week-old发现il - 10的炎症性肠炎^−−/老鼠。

小肠粘膜港口特定人口的淋巴细胞上皮内淋巴细胞(IELs)命名。IELs在粘膜表面的第一行与上皮细胞,交织在一起,TCR IELs的主要亚种群αβ⁺和细胞γδ⁺,都是描述为参与抑制细胞毒性T细胞(CTL)。上皮内淋巴细胞室可能提供了一个对抗传染性病原体的第一道防线攻击身体的表面,并且还提供了一个先天和后天免疫之间的联系(25,28]。细胞受体γδ⁺IELs也相关的免疫调节作用,如维护上皮组织的完整性(25),口服耐受诱导(29日),和结肠炎调制(30.]。管理可诱发急性结肠炎2,4,6-trinitrobenzene磺酸(TNBS)或DSS、保护作用γδT细胞已经证明(30.]。最近我们组显示的频率γδ⁺IELs在老年小鼠和减少,这aging-associated改变相似之处减少对口服耐受诱导(31日]。在这项研究中,我们观察到细胞的频率αβ⁺和细胞γδ⁺T淋巴细胞在IEL隔间没有变化(数据未显示),但有一个减少激活细胞的频率γδ⁺Thy1.2⁺细胞IL-10-deficient建立小鼠炎症。因为细胞γδ⁺IELs参与管理活动在肠道粘膜,减少可以代表一个实例与疾病发展有关的免疫调节失败IL-10-deficient老鼠。

古典研究报道,IL-10-deficient小鼠的小肠结肠炎与不受控制的生产通过激活巨噬细胞和CD4细胞因子⁺Th1-like T细胞(19]。过度的一代干扰素-γ第T细胞(Th1)由抗原递呈细胞产生的il - 12描述负责疾病的起始(32]。然而,后来的研究表明,IL-23,但不是白介素,驱动器il - 10的肠道炎症^−−/老鼠。IL-23的关键目标是记忆T细胞,产生的促炎介质IL-17和il - 6 (33]。我们发现干扰素的水平γ高架在16-week-old但不是年轻的il - 10的结肠^−−/老鼠。此外,6周大il - 10^−−/小鼠的结肠粘膜IL-17A水平上升。这些结果是一致的发现IL-17A是启动肠道炎症的细胞因子il - 10^−−/老鼠一个增强的干扰素的生产——紧随其后γ。Th17细胞可以通过IL-17皈依Th1细胞诱导il - 12和IL-23生产在结肠粘膜树突状细胞(34]。最近,劳斯和同事显示cotransfer的Th1 / Th17 CD4混合⁺T细胞的il - 10^−−/与Th1 CD4结肠炎⁺从CD4 T细胞⁺CD45^高全身的破布^−−/小鼠结肠炎成破布^−−/老鼠改善消耗性疾病。因此,似乎Th17细胞与Th1细胞,主要分泌的干扰素γ更严重的结肠炎(有关35]。此外,巨噬细胞通常激活干扰素-γ产生il - 6和干扰素-这可以解释随之而来的增加γ和il - 6水平的结肠16-week-old il - 10^−−/老鼠(36]。根据这些结果,TGF -β生产10周大il - 10的结肠^−−/老鼠可能代表试图调节炎症的直接监管行动TGF -β。的确,结肠的il - 6只10周大的il - 10的生产^−−/并不高。也显著的转变从IL-17A干扰素-γ生产结肠粘膜的il - 10^−−/老鼠正好与更严重的结肠炎,炎症扩散至小肠(图1)和恶化的临床状态的动物。

细胞因子也评估在所有部分小肠。我们发现增强的十二指肠的IL-17A只10周大的il - 10水平^−−/老鼠。另一方面,有更高水平的TGF -β在结肠在同一时间点。在年龄16周,TGF -β也在近端空肠。有趣的是,增强IL-17A生产观察到10周的年龄在16周的年龄(图消失了4 (b))。的发现upregulation TGF -β在10周大的老鼠可能是一种免疫调节过程引起小肠控制炎症。然而,这并不是一个成功的调节事件以来的组织学分析小肠在那个阶段表明,炎症明显在大肠和小肠。这表明,尽管TGF -β可以是一个重要的代偿机制的免疫内稳态IL-10-deficient老鼠,这些动物没有其他炎症性疾病。然而,在肠道粘膜,il - 10和生产过剩的TGF -似乎是至关重要的β并不足以控制肠道炎症。

尽管没有在年轻小鼠肠道炎症,我们发现提高CD4的频率⁺表达一个记忆T细胞表型(CD44^高)建立前的大型肠粘膜结肠炎(6周的年龄)。伯格和同事表明,增加T细胞的数量在IL-10-deficient老鼠已经3周的年龄(19]。在一项研究中使用Gαi2-deficient溃疡性结肠炎小鼠模型,增加黏膜淋巴细胞表达CD44的数字^高标记之前分离小鼠结肠炎的发病(21]。据推测,T细胞涌入到结肠固有层在随后的一个重要因素是建立结肠炎。与严重疾病IL-10-deficient老鼠,CD44的高频^高是维护。我们有截然不同的结果T淋巴细胞CD69表达激活早期标志⁺。有一个增强CD69的频率⁺在129年sv / Ev野生型和il - 10^−−/小鼠6周- 16周的年龄。这表明年龄增加CD4激活⁺与其他研究相一致的淋巴细胞(31日),可以解释为连续暴露于抗原在传统的住房。这似乎与微生物群刺激由于没有激活CD4的频率变化⁺T细胞在小肠细菌殖民化强烈的要少得多。

诱导CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺已经显示为T细胞内稳态的重要球员肠道粘膜的37]。减少CD4的频率⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞被发现在大肠6周大的老鼠。这可能与il - 10的缺乏直接相关。此外,由CD11b分泌il - 10⁺CD11c⁺树突状细胞是一个基本维护Foxp3表达的细胞因子诱导调节性T细胞在外围结肠炎发展(38]。

我们的下一步是分析CD4的频率⁺腿上⁺这些小鼠的T细胞在结肠炎发展。CD4⁺腿上⁺T细胞是调节性T细胞表达TGF -的一个子集β绑定到膜的前体形式(与潜在相关的肽,腿上)。CD4⁺CD25⁺腿上⁺T细胞已被证明参与肠道炎症的控制实验结肠炎模型(39)和CD4⁺腿上⁺T细胞,表达CD25或不是,最近的报道作为一种独特的子集T细胞(40]。CD4的频率⁺CD25⁺腿上⁺不是年轻IL-10-deficient影响的老鼠。然而CD4⁺CD25⁺腿上⁺在IL-10-deficient小鼠T细胞减少16周的年龄在结肠和小肠。CD4的频率下降⁺CD25⁺腿上⁺观察T细胞在小肠16-week-old il - 10^−−/在同一时间点的TGF -β增加在近端空肠。因此,很可能其他细胞类型,包括巨噬细胞和肠道上皮细胞,负责生产的TGF -β而不是CD4⁺腿上⁺T细胞。我们还发现提高CD4的频率⁺腿上⁺在野生型小鼠T细胞在16周的年龄相比,频率在6周大的老鼠。我们小组在最近的一项研究描述了类似的数据在肠道粘膜与年龄相关的变化。增加CD4⁺CD25⁺腿上⁺观察细胞在肠系膜淋巴结和派尔集合淋巴结补丁6 - 24-month-old老鼠相比,年轻的动物(丽江),这表明这些T细胞子集性成熟后增加但之后保持稳定(31日]。

不仅细胞介导的体液免疫系统的组成部分已经与IBD的发病机理的人类和小鼠模型。Anticolon抗体已发现在2^−−/老鼠(41]。抗体反应等肠道微生物群空肠弯曲杆菌,已确定在人类患者,特别是那些与溃疡性结肠炎42]。在这项研究中,我们发现增强IL-10-deficient小鼠的血清免疫球蛋白和IgA水平建立和严重的结肠炎,分别。我们的研究结果是在协议与其他研究IL-10-deficient老鼠。库恩和他的同事们第一作者展示高水平的血清IgG1和IgA 8-week-old il - 10^−−/老鼠(15]。戴维森和同事还显示il - 10的大^−−/小鼠血清与结肠上皮和nonepithelial搞笑细胞大部分血清测试。然而,同样的作者创建了B cell-deficient (B^−−/)应变lL-10^−−/老鼠,老鼠获得严重的结肠炎lL-10类似^−−/老鼠,这意味着B细胞没有炎症性肠病的主要中介在这个模型(17]。因此,我们不能说这些改变是否补偿反应炎症或者他们只是一种现象与结肠炎症有关。IL-10-deficient小鼠4 - 6岁的周有相似比例的B细胞在胸腺和脾脏和正常B1细胞子集在腹膜15]。最初确认为CD5 B1细胞⁺B细胞(43]。令人惊讶的是,CD19的频率⁺CD5⁺细胞的增加固有层小和大肠16-week-old il - 10的腹膜和派尔集合淋巴结补丁^−−/老鼠。从腹膜B1细胞产生IgM为主,但类开关IgA已被证明发生在B细胞群(44),固有层B1细胞负责至少一半肠道粘膜分泌IgA的(45]。血清IgA在il - 10水平提高与炎症^−−/老鼠。分泌IgA在10周大鼠水平也较高。因此,它是合理的推测B1细胞的主要来源IgA的增量。

口服耐受是一个主要的和共同的结果口服抗原(6]。虽然提出了几种机制来解释感应,生产抗炎细胞因子如TGF -βil - 10和诱导调节性T细胞CD4等⁺CD25⁺Foxp3⁺和CD4⁺腿上⁺对于口服耐受诱导T细胞似乎是至关重要的(46]。有以前的和有争议的报道il - 10在这个过程中的作用。Rizzo和同事表明,转基因小鼠缺乏il - 4、il - 10或细胞因子都是耐火材料口服耐受(47]。之后,Aroeira和同事显示,体内消耗的il - 10与单克隆抗体并不影响口服耐受诱导小鼠(48]。在目前的研究中,我们观察到口服耐受IgE可以诱导16-week-old IL-10-deficient老鼠喂养两个方案的使用,填喂法,连续喂养。然而,只有连续喂养的抗原,但不是填喂法,可能导致压制anti-Ova IgG1。

我们组曾描述连续抗原是一种最佳的管理协议为口服耐受诱导抗原相比,政府强饲法(49]。甚至年龄小鼠(70周),通常由填喂法耐火口服耐受,可以呈现连续喂养宽容的抗原(50]。我们还展示了,在之前的一项研究用老鼠ethanol-induced结肠炎,口服耐受诱导特定血清IgG1生产gavage-fed小鼠受损(51]。正如已经报道,IgG1是最耐抑制粘膜免疫参数管理的蛋白质。鼻的抗原不抑制特定过敏血清IgG1,而连续喂养抑制很有效(52]。在这项研究中,我们证实了这些以前的数据显示,连续喂养但不是填喂法能够使患病的老鼠IL-10-deficient宽容卵白蛋白在特定IgG1抗体测定。因此,il - 10不足和严重的肠道粘膜炎症似乎减少而不是废除对口服耐受诱导。这个结果代表了一个关键的元素在设计炎性肠道疾病的新治疗方法。因为这些病理条件产生的炎症,宽容的抑制的调节特性程序获得的疾病相关蛋白质的口服将是一个选择。口服耐受目标抗原在许多模型已经成功地测试了其他炎症性疾病,如自身免疫性和过敏性疾病(6]。我们目前的数据表明,即使在严重的结肠炎和肠炎,口服耐受的方法可以作为一种治疗炎性肠道疾病的工具。然而,口服优化协议,如连续喂养,会要求这些策略的使用。

总之,我们证明了IL-10-deficient老鼠有一个进步和自发的炎症免疫系统和显著的变化。缺乏一个重要的抗炎细胞因子il - 10等导致戏剧性的免疫调节的缺陷,降低调节性T淋巴细胞在肠道粘膜,免疫球蛋白变化同形像生产和B1细胞的频率。重要的是,我们还显示,尽管几个IL-10-deficient小鼠的免疫调节机制被破坏,口服耐受诱导仍然可以被诱导。我们的研究还提供了数据显示,一些免疫调节机制仍保留和口服耐受诱导甚至在公开的炎症。

确认

作者感谢Ilda马卡de Sousa对她出色的工作照顾我们的动物设施。本研究支持拨款Fundacao德帕罗尽管做Estado de米纳斯吉拉斯(FAPEMIG APQ 00575 - 09年),巴西。一些作者接受奖学金(交流G-Santos B.C.Horta)和奖学金(A.M.C.法,D.C.Cara)慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq),巴西。

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