文摘

eb病毒(EBV)驱动的移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)是一个异构的和潜在的威胁生命的条件。早期识别异常EBV活动可能防止发展为b细胞淋巴瘤。我们测量EBV DNA负载和RNA概要文件在血浆和细胞血箱内的干细胞移植(SCT;),实体器官移植受者(说;),说有慢性升高ebv dna负载。在SCT, EBV DNA是不均匀分布的,在等离子体或白细胞或两者兼而有之。在说,EBV DNA负载总是相关的细胞,B细胞为主,但偶尔在T细胞(CD4和CD8)或单核细胞。所有与细胞相关SCT EBV DNA显示巴和EBNA1表达式,而LMP1和LMP2信使rna被发现在1和3的情况下,分别。在说,巴的表情中发现所有白细胞样本。LMP2和EBNA1 mRNA在5/15和2/15,被发现,但LMP1 mRNA在只有1之际,恰逢严重PTLD和高EBV DNA。结论:EBV DNA不同分布式白细胞和等离子体之间说与SCT。血液中EBV RNA分析是可行的,并有可能进一步增值对于理解致病病毒活动升高患者EBV dna。

1。介绍

淋巴增殖性疾病具有重要的意义(PTLD)是一种严重的恶性并发症(pre -)在移植受者,eb病毒(EBV)——驱动造成的b细胞增殖有缺陷的t细胞介导的免疫监视的时期(1- - - - - -3]。EBV的关键作用PTLD发病机理如下EBV潜伏性基因的表达在PTLD病变,包括丰富的小非编码EBER1 2 RNA,和必要的EBNA1蛋白质存在增殖B细胞,和EBNA2 LMP1致癌基因表达在这些细胞只有一个子集的2,3]。在单细胞水平,EBV基因表达在PTLD组织可能是异构的,共存的不同类型EBV延迟了EBNA2和LMP1双重免疫组织化学染色4,5]。这个异质性与PTLD细胞形态,相对较小的PTLD细胞表达EBNA2 LMP1的缺席,中型细胞表达EBNA2和LMP1 (latency-III或增长计划),和大immunoblastoid PTLD细胞表达LMP1只有在缺乏EBNA2(即。,默认的程序或延迟II型)。后者细胞占主导地位,可能霍奇金里施(小时)状的形态和高增殖能力。此外,偶尔细胞表明裂解病毒复制(5,6]。

PTLD影响器官(说)和干细胞移植受者(SCT),但在发病机理不同。EBV天真说患者,病毒可以来源于贪污,输血和外部来源。然而,在EBV携带受者PTLD通常源于重新激活内源性病毒潜伏性感染宿主本身的B细胞和经常本土化移植器官7]。在SCT患者EBV可能主要来自捐赠者B细胞或外生来源,由于内源性病毒可以通过预处理调节机制(8]。此外,儿科患者移植前发展中经常PTLD病毒-指示EBV来自供体材料。在SCT EBV-driven PTLD引起更多的扩散和系统性疾病最初类似传染性单核细胞增多或扁桃体炎,可能出现在多个位置。SCT的PTLD通常开发移植后早期由于严重的免疫抑制和延迟免疫重建(9]。

尽管PTLD是一个高度先进的疾病,它可以在早期阶段,恢复和先发制人的治疗。这可以通过临时降低免疫抑制,EBV-reactive T细胞注入或利妥昔单抗治疗结合减少免疫抑制(9]。大多数PTLD患者显示高浓度的EBV DNA在血液疾病的发作。EBV DNA负载监控使识别的早期阶段EBV-driven b细胞增生(10- - - - - -12]。EBV DNA坐落在循环细胞或存在等离子体分散游离DNA。目前没有证据表明ebv dna与游离在血液传染性病毒粒子。细胞窝藏EBV DNA可能是B细胞(13- - - - - -15),但偶尔T细胞、单核细胞和未成熟树突状细胞也可以感染(16- - - - - -18]。是否循环EBV携带细胞PTLD患者直接反映了tissue-bound PTLD细胞的病毒基因表达不是定义良好的19]。溶解在PTLD EBV复制起始的作用是表明在小鼠模型20.,21),但不得与移植相关的设置使用预防性抗病毒药物(11,12,22,23]。事实上,很少有人了解基因在循环EBV-positive B细胞(早期)PTLD和相关的淋巴增殖性疾病。通常直接一致性假设tissue-associated和循环B细胞之间,但这仍有待建立更加坚定。

本研究的目的是定义在血液细胞或血浆病毒DNA上(或两者)和描述病毒基因表达模式在SCT循环淋巴细胞,移植受者和没有PTLD。因此,未全血、血浆和孤立的B - t细胞分数和EBV DNA的定量分析。此外,我们确定了EBV转录PTLD的血患者的表型和早期患者b细胞增生被循环EBV DNA负载海拔。

2。材料和方法

2.1。临床标本

临床样本获得干细胞移植受者乌得勒支大学医学中心,荷兰,和伊拉斯谟医学中心,鹿特丹,荷兰,和肺移植受者大学医疗中心,格罗宁根,荷兰。前瞻性地收集了全血样品的常规诊断监测在说()和SCT患者((之前)描述了使用标准程序22,23]。说病人的数据(图13以前(部分中描述)11]。较大的血液样本的研究在最早的时间点确认和持续升高ebv dna负荷高于临床截止,表明早期PTLD [24]。证实了PTLD EBER-RISH在活检标本如前所述11,22,23]。此外,在一些病人,全血样品(期间收集的)的持续高ebv dna负载至少6个月后移植(表1)。作为细胞分离和FACS-analysis控制,全血和外周血mononucvlear细胞(PBMC)样本健康EBV载体(),从一个患者EBV-positive (Granzyme-B积极)NK / t细胞淋巴瘤()收集(3,24]。

DNA和RNA分析100μ全血是添加到900年μL NucliSens裂解缓冲(BioMerieux,波斯特,荷兰)直接在收集和储存在−80°C。等离子体是由离心分离从全血和存储−20°C。PBMCs从全血中分离出来了标准Lymphoprep离心(他一一Bio-one,纽伦堡,德国)。在大约PBMCs存储细胞在液态氮/毫升10% DMSO - rpmi - 1640中(BioWhittaker、巴塞尔、瑞士,包含20% FCS (Hyclone,南洛根,UT))。

2.2。细胞分离过程

解冻后,可行的外周血单核细胞(PBMC)是由密度梯度离心法分离Lymphoprep(他一一Bio-one)。平均每个捐赠者PBMCs使用。隔离的B和T细胞,两种不同的程序进行。在第一个方法PBMCs排序在CD20, CD4、CD8,单核细胞,流式细胞仪分选。单克隆抗体CD20, CD4、CD8和CD14共轭,分别藻红蛋白(PE), allophycocyanin (APC), Peridinin叶绿素a蛋白(PerCp)和异硫氰酸荧光素(FITC),从BD购买生物科学(富兰克林湖,NJ)。细胞培养与摩押15分钟在冰上。与PBS洗了两步后,细胞被FACS-Calibur resuspended和排序。在流式细胞仪分选,测量进行检查数量的纯度。流式细胞仪数据分析与天后软件(女主角)。人口控制的细胞被校准排序准备从冷冻PBMCs一个健康的个体在每个实验和用于所有分类实验。细胞计数和排序添加到0.2毫升RNABee (AMS生物技术,奥克,英国)。 In the second method, B-lymphocytes were isolated from PBMC by CD19 Dynabead M-450 selection (Dynal Biotech, Smestad, Norway) according to the manufacturer’s protocol. From the remaining cells (designated as “non-B-cell fraction”), the T-cell and monocyte-cell populations were sorted by FACS using monoclonal antibodies against CD4, CD8, and CD14 as described above. The cell populations were counted and added to 0.2 mL RNABee.

2.3。EBV DNA和RNA隔离

DNA和RNA分离得到临床样本收集和存储在NucliSens裂解缓冲硅基提取如前所述[25]。在100年核酸隔离μL,全血材料添加到900年μL Nuclisens裂解缓冲。硅基核酸提取后根据制造商的指示,DNA和RNA在100年被筛选了μl .此外,PCR增加浓度的血浆标本的DNA, DNA被Qiamp DNA分离血液迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。RNA在细胞起源是孤立使用RNABee (AMS生物技术,奥克,英国)所描述的制造商。

2.4。EBV DNA负荷量化

EBV DNA拷贝数在临床样本确定使用标准化量化LightCycler-based实时PCR分析,针对守恒的213个基点(完整的病毒DNA)或99个基点地区(DNA检测病毒粒子分散凋亡)病毒EBNA1基因,详细描述(26,27]。

2.5。EBV RNA扩增

EBNA1 EBV-encoded成绩单(QK拼接变种),LMP1, LMP2a和b,巴特,BZLF1(斑马)和细胞low-copy U1A snRNP记录被发现使用两步组成的rt - PCR检测gene-specific multiprimed互补脱氧核糖核酸合成之后,PCR扩增如前所述[28]。PCR产品加载到琼脂糖凝胶涂抹在尼龙膜。膜被用于特定的杂交γ32 p-atp标记寡核苷酸探针来确定他们的特异性。作为一个积极的控制,U1A snRNP rt - pcr进行所有样品如前所述。

2.6。统计分析

等离子体的病毒载量水平与全血。不同类别的意义进行了分析通过2-tailed Wilcoxon符号秩检验。值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。EBV血浆和全血中病毒DNA的负载

EBV DNA的循环加载确定早发性,建立了PTLD的病人。DNA测定血液中不同的隔间的SCT患者(说病人(相比))。SCT患者,病毒DNA分析了负载每周在干细胞移植后全血和血浆(图1)。EBV DNA在等离子体负载确定99个基点LC PCR,使检测的DNA片段,而213个基点LC PCR用于分析完整的病毒粒子相关的细胞DNA EBV在全血。血浆EBV DNA负载在PBMC横向比较与EBV DNA的负载。高度可变的结果被认为比较PBMCs血浆EBV DNA的水平(表1)。最极端的总没有SCT病人的血浆EBV DNA和DNA的负载拷贝/ 10⁶同时获得PBMC细胞样本,表明EBV DNA细胞相关。然而,相反还观察到,在等离子体高水平(拷贝/毫升)和检测水平EBV DNA的PBMC分数相同的病人。EBV DNA拷贝之间没有明确的关系被发现在全血(或PBMCs)和等离子体的SCT的病人。

说患者EBV DNA的负载主要是全血(图中发现2),只偶尔在等离子体。在大多数情况下,全血中EBV DNA复制水平高于并行等离子体()。这表明,循环EBV DNA主要是说患者的细胞相关。

3.2。EBV RNA分析循环细胞移植的病人

SCT病人有高水平的EBV DNA在细胞碎片(4例),EBNA1巴特RNA可以发现(图1)。三个病人LMP2积极性,而LMP1 RNA没有检测到。一个病人LMP1表达但LMP2 RNA是缺席。病人没有EBV负载在细胞分数,是谁但是血浆EBV DNA阳性(3.8×10⁵拷贝/毫升),显示没有EBV相关rna的表达整个血液样本。

自高架索患者EBV DNA加载循环细胞,在很大程度上与EBV的转录表型分析的PBMCs说病人。两个病人随访时间后收到了肺移植。EBV DNA负载和RNA分析如图3。从一大群说患者(与疑似PTLD)移植后早期,RNA概要分析了全血样品的时间点上升(上升)EBV DNA负荷,减少之前作为一个先发制人的免疫抑制治疗。分析EBV的转录活动,multiprimed RNA概要文件是如前所述[28]。巴特RNA被发现在所有情况下,然而EBNA1只检测到2后续样品在一个病人。转录的主要EBV-encoded致癌基因LMP1在循环细胞只在1例,恰逢EBV DNA的峰值水平荷载和coexpression LMP2基因在终末期PTLD,由组织活检证实。LMP2 RNA的表达是临时发现5额外的病人,有可逆PTLD,经检测确认的EBER-RNA活检,但降低免疫抑制后消失。没有检测到斑马mRNA(数据没有显示)。

3.3。DNA和RNA分析患者的慢性高EBV负载后说

另外一个群说患者()没有显示的PTLD,尽管EBV DNA水平持续在较高的水平(> 2000 c /毫升血液)几个星期。总的来说,这些患者监测移植后1 - 14年。所有情况下的免疫抑制是预先降低后检测两次升高(> 2000 c /毫升)和增加EBV病毒载量。结果如表所示2。RNA从PBMCs是积极的在所有情况下的低拷贝数细胞U1A记录作为一个内部积极的(质量)控制。中EBV特异性rna检测到巴在10/12的病例和LMP2 mRNA在2/10的情况下,而LMP1 mRNA在只有1例检测到高水平的循环EBV DNA负载与EBV DNA的存在在等离子体和PBMC分数。没有迹象显示循环感染细胞分裂的病人,因为的表达Qp-driven EBNA1 RNA不能检测到。病毒裂解复制也没有因为斑马mRNA在所有样本是负面的。

3.4。EBV DNA的起源说慢性高患者EBV DNA负载

慢性高水平的循环细胞相关EBV DNA中观察到的一个子集说患者()。DNA持续的高负载的起源尚不清楚,没有局部的PTLD的迹象或进行性系统性lymphoproliferation被检测到。因此,提高循环的起源和细胞分布EBV DNA进行了分析。存储PBMCs被孤立起来,随后分为B和T细胞。细胞分类进行3例使用CD19珠子选择B细胞之后non-B-cell分数排序了流式细胞仪CD4和CD8 t细胞和单核细胞。另5例,PBMCs直接按流式细胞仪到CD20 (B细胞),CD4和cd8 + T细胞和CD14积极(单核细胞)分数。盖茨排序PBMC的分析测定健康的捐赠者,每个实验在整除冻结,解冻。在流式细胞仪排序,排序数量检查纯度直接流式细胞仪分析过程之间的排序。细胞的纯度分数从85%到100%不等。分析了污染B和T细胞和单核细胞的标记。 In the fractions that were not 100% pure, the contaminating cells were not identified as B, T cells, or monocytes (all <1%). PBMCs of a patient with EBV-positive NK/T lymphoma, known to have a high viral load in T cells, were analysed as a positive control.

排序的病毒DNA负载细胞NK / T淋巴瘤患者的位于B细胞(1.2×10⁴拷贝/ 10⁵细胞),而CD8 + T细胞(1.6×10⁴拷贝/ 10⁵细胞)和单核细胞(2.0×10⁴拷贝/ 10⁵细胞),高水平的EBV DNA。整体在这个病人,单核细胞、B细胞、CD8 + T细胞含有18%,1%,和10%的总循环ebv dna负荷,分别。在健康的捐赠者,只有偶尔的低水平EBV DNA信号提纯b细胞分数。EBV DNA载入PBMCs 6说升高患者全血负荷出现在B细胞和EBV DNA检测T细胞和单核细胞(图4)。2例(1和2在图所示4),一些EBV DNA可以检测T细胞和单核细胞,除了高病毒载量的B细胞(图4(一))。在这些2例,病毒DNA的总体水平在PBMC只有部分源于B细胞,B细胞的百分比以来PBMC分数很低(1 - 5%)相比,T细胞的数量(~ 30%)和单核细胞(~ 20%)。虽然T细胞怀有一个低数量的每个单元等效EBV DNA,他们的贡献绝对高病毒载量在全血可能是由于更高的T细胞与B细胞的数量。监测病毒载量的PBMCs决定在这两个患者移植后,流式细胞仪的采样时间排序图表示4 (b)。由于样本量有限,没有详细的RNA分析可以做分离PBMC小分支。整体全血RNA模式如表所示3。

4所示。讨论

这项研究表明,尽管在酗酒者和SCT患者PTLD的发展之前EBV DNA的负载,增加的潜在生物学EBV-driven细胞增殖在SCT和说多样化。说患者病毒DNA主要细胞有关,而在SCT的血患者EBV游离DNA或细胞相关或(大部分)都可以检测到。RNA在SCT患者复杂显示巴的表达,EBNA1,偶尔LMP1和LMP2。可能由于SCT的更高的免疫抑制患者EBV阳性B细胞的病毒基因表达沉默少比说病人。有趣的是,在循环细胞RNA表达谱似乎显示更受限制的模式与PTLD活检(4- - - - - -6),这表明EBV转录沉默在循环细胞离开淋巴组织环境(14,15]。没有EBNA1 mRNA在大多数全血或PBMC标本表明循环细胞不复制,不仅仅是反映出增殖细胞在PTLD组织。这是符合先前的观察和确认当前的主要EBV持久性模型扩散和潜在的基因表达局限于淋巴组织,甚至在免疫抑制个人(14,29日,30.]。

高,EBV DNA浓度的增加会经常发现在临床的发病明显PTLD SCT病人以及说病人(8]。然而,仅高EBV负载并不是信息预测PTLD,因为大多数慢性稳定患者EBV DNA高负载在这项研究中没有出现PTLD [31日]。因此,监测EBV负荷的动态变化是更重要的是识别这些发展中PTLD的风险,为适应治疗提供更多的相关信息(11,22,23,31日- - - - - -34]。虽然说患者的病毒载量在很大程度上是细胞相关,证明了我们和其他人之前,SCT患者EBV DNA是不定地分布在细胞和等离子体(35]。这支持了先前的研究,表明在SCT血浆EBV DNA的水平可以用于诊断EBV lymphoproliferation和PTLD风险(36]。然而,在一些SCT患者血浆可以传染PBMC平行的高水平,作为显示在图1SCT病人1。因此,为了避免假阴性EBV DNA负载导致SCT高风险人群,我们和其他人主张使用全血EBV DNA检测作为首选标准化诊断方法(35,37]。我们观察到的数量没有明显相关性EBV DNA在血浆和全血或PBMC, SCT以来最高的病毒载量患者血浆不一定是高水平的患者循环细胞(早些时候提出34]。EBV DNA的循环的起源尚不清楚,但它很可能来自凋亡细胞脱落在PTLD的早期发现鼻咽癌患者和何杰金氏病38]。另一方面,凋亡EBV DNA可能反映了当地的细胞毒性T细胞的活动,提供了一种新兴的免疫反应的信号。支持这一点,它已经表明,在血浆EBV DNA的PTLD颗粒以及nonencapsidated的病人,尽管nucleosomal碎片没有直接证明(39]。

全血也可以用来监测PTLD风险在说患者EBV DNA主要局限于循环细胞(35,40]。EBV DNA的细胞相关性质在希伯说早些时候显示RNA原位染色循环B细胞的PTLD病人(11]。这里,我们证实EBV DNA的细胞协会说,由于EBV DNA水平平行血浆样本值低于浸水平与高病毒载量在全血。这是符合其他独立说研究[40- - - - - -42]。

PTLD的发病机制反映了复杂交互EBV-infected细胞同种异体的宿主环境和rejection-associated炎症活动。先前的研究在EBV RNA表达分析在PTLD组织表示类型III延迟(增长程序)总表达EBNA1(反映细胞增殖),EBNA2(反映活动转换事件),和LMP1 + LMP2(增长激活)。PTLD组织相比,EBNA1 LMP1信使rna是几乎从来没有检测到循环细胞,而LMP2 mRNA在循环细胞可以找到更频繁。只在早期急性原发性感染如延迟类型III细胞已经直接证明了循环(43]。我们的数据表明,LMP1信使rna的检测循环细胞可以被视为一个危险的信号反映癌变前的EBV-driven b细胞增殖,这需要干预。相比之下,LMP2能被探测到的更频繁,也描述了在健康个体(14]。LMP2积极说病人的比例低于前面描述(30.),但这可能是由于患者的年龄的差异在这两项研究。循环EBV阳性细胞的生物活性在酗酒者和SCT升高患者EBV dna加载似乎不同于PTLD组织表明EBV携带B细胞可能进行转录沉默EBV启动子的甲基化之前进入循环。

循环细胞的RNA概要SCT病人说病人相比更加多样化。在大多数SCT病人,RNA编码巴,EBNA1,和LMP2被检测到,而在只有一个病人LMP1信使RNA检测。人口更多的病毒RNA的存在可能是由于所患的免疫系统还没有完全恢复。因此,这将是有趣的分析这是否反映了在骨髓中EBV RNA表达。然而,由于缺乏材料在目前的研究中,这仍是至今没有解决。

EBV相关是b细胞;然而,在慢性EBV疾病描述,可以检测EBV非B细胞(3)如T / NK细胞和单核细胞(16- - - - - -18]。在这项研究中在13/15慢性患者EBV EBV在B细胞主要被探测到。在2例,EBV DNA也可以检测到的T细胞(CD4和CD8)和单核细胞。EBV感染和功能改变的单核细胞在体外通常不表达EBV受体,CD21,表征了(之前44]。

总之,我们的数据显示,血液中EBV的移植患者(慢性)升高EBV DNA的负载主要局限于B细胞显示EBV mRNA表达有限,支持的概念(pre -)恶性增殖优先发生在淋巴组织或器官移植。这些细胞做循环,但EBV基因可能是关闭之前进入血液。在说慢性高患者EBV DNA负载,EBV, B细胞主导的,但偶尔会坚持T细胞和单核细胞。

确认

这项工作是由荷兰癌症协会的支持。报告的作者没有利益冲突。