文摘

有冲突的数据支持的做法引起过敏的食物介绍延迟到婴儿饮食预防过敏发展。本研究调查后免疫反应的发展早期口服卵抗原(卵白蛋白;卵子)暴露在一只老鼠幼崽模型。布朗挪威(BN)老鼠幼崽被随机分配到组:大坝饲养(博士),小狗每天挑战博士(42天)用口服卵子(博士+卵子c),幼崽挑战间歇性博士(4天、10、12、13)口服卵子(博士+卵子我)、人工喂养的小狗(FF)和FF幼崽挑战每天口服卵巢(FF +卵子)。血清免疫参数评估包括OVA-specific IgE, IgG1, IgA。回肠和脾信使核糖核酸(mRNA)表达式转化生长因子(TGF -β1)、母亲对decapentaplegic (Smad) 2/4/7和forkhead盒P3 (Foxp3)测定。回肠是TGF -染色β1和Smad4。结果。喂养卵子博士每天小狗保持系统性和地方肠抗体和免疫调节标记mRNA的反应。系统性TGF -β1低博士+卵子我幼崽比博士和博士+卵子c幼崽。喂养卵子FF幼崽导致大大增强OVA-specific IgE IgG1,和较低的IgA TGF -β幼崽博士1和Smad表达相比。结论。早期日常卵暴露在母亲面前牛奶保持免疫标记与调节免疫反应有关,早期预防过敏敏化。

1。介绍

变应性疾病出现由于遗传易感性和环境因素之间的复杂的相互作用,乳腺癌或配方奶粉喂养和模式早期微生物的暴露(1- - - - - -3]。最常见的食物过敏出现在婴幼儿鸡蛋和花生抗原。大约6 - 8%的三岁以下儿童受到影响,与这些过敏的发生率增加4- - - - - -7]。食物过敏,牛奶和鸡蛋通常消失三到五岁,但是有数据表明自然历史的食物过敏可能会改变甚至是食物过敏,如鸡蛋和牛奶,我们通常认为的瞬态表现出更大的持久性为青少年和成人年(8,9]。

粘膜免疫系统的抗原(过敏原)刺激被认为是口服耐受的发展的关键。在早期生活,接触剂量的食物抗原可以帮助'口服耐受的发展向诱导免疫反应(10]。过敏原的培养宽容的能力似乎也配合建立健康的肠道共生的细菌殖民化的(11]。未能开发口服耐受被认为是与food-allergic疾病的发展。然而,机制(s)的正常肠道免疫系统响应的食物及其参与食物过敏的发展仍未得到解决。了解潜在的机制将允许制定干预策略预防食物过敏以及治疗治疗婴儿已经开发了食物过敏。

口服耐受的食物抗原可诱导实验,但是优化的剂量用于敏感化是至关重要的12]。例如,诱导花生公差要求明显高于口服剂量比鸡蛋。动物喂养高剂量的鸡卵巢分泌更多的interleukin-4 (il - 4;与过敏)和更少的TGF -有关β(与公差)比美联储低剂量,更TGF -β生产和il - 4 (13]。只有少数研究新生儿评估暴露于抗原诱导的时机口服耐受。在动物模型中,Strobel et al。14]表明,口服卵子在生活的第一周给小鼠诱导体液和细胞免疫(14]。相比之下,最近的研究将早期抗原暴露与宽容的发展(15,16]。还需要更多的研究来确定最佳干预策略,促进口腔宽容。

产妇乳细胞因子,如TGF -β2和白介素(il - 10)有可能调节免疫反应食物抗原和促进宽容17- - - - - -23]。虽然母乳喂养和预防过敏之间的关系是有争议的24- - - - - -26),最近已经有越来越感兴趣母乳在调节免疫反应的作用发展到食物抗原引入新的食物饮食(16,27]。

在婴儿期,辅助T 1 (Th1)免疫反应在防止持续发展是重要辅助T 2 Th2反应和过敏性疾病的后续推广(3]。幼稚T细胞的成熟效应和调节细胞取决于抗原之间复杂的相互作用,免疫细胞和细胞因子的直接环境。TGF -β,主要是信号通过Smad家族的蛋白质,在t细胞谱系的发展上起着重要的作用。TGF -β诱发Foxp3的发展⁺T调节细胞亚群)促进宽容28,29日]。TGF - il - 4在一起β抑制Foxp3的生成⁺亚通过促进Th细胞分泌il - 10,但没有监管的功能(30.]。TGF -β在当地的肠道环境中发挥着重要作用的发展婴儿食品抗原免疫反应被引入到饮食(23,31日]。

母乳喂养之间的交互和食物抗原相遇的时机是关键因素,影响食物过敏发展(15,32]。目前有一个担心,延迟喂养直到6个月后(传统断奶年龄)项目发展中免疫反应对敏化而不是宽容的33,34]。在延迟喂养一直推荐的国家,食物过敏的几率已经升级,包括增加大于5倍观察到在澳大利亚4岁以下儿童食物过敏反应(35]。当地的肠道环境起着重要的作用在调节免疫反应的发展引入食物抗原。自分析当地的肠道免疫反应在婴儿口服抗原的介绍不是伦理上是可行的,我们评估在一个过敏性老鼠幼崽模型发展中每日早期口服卵暴露后免疫反应(连续),比间歇(偶尔)卵巢曝光。在这个在活的有机体内研究中我们集中在早期断奶时间点(14天)。发展中免疫反应是评估当卵子被引入饮食在早期生活中一个关键时刻。配方奶喂养组作为控制,正如我们之前所示后早期口服抗原致敏的喂养配方奶喂养幼崽(16]。鸡蛋卵白蛋白作为目标评估抗原特异抗原反应,因为它是一种最常见的原因在婴儿食物过敏。

2。材料和方法

2.1。动物

BN大鼠有天然倾向于过敏发展的基因(36- - - - - -39]。BN大鼠饲养,动物设施的安置孩子,青年和妇女的健康服务、阿德莱德和实验完成了批准孩子,青年和女性健康服务动物伦理委员会。

2.2。管子和维护

人工的细节鼠牛奶(公式)组成(Wombaroo食品,南澳大利亚,澳大利亚;表1的补充材料可用doi 10.1155 / 2012/396232)和人工喂养被先前描述的过程(16,23]。我们也曾证实人工鼠牛奶(公式)不包含活动TGF -β(18,40]。简单地说,在第四天的年纪,奶粉喂养组大鼠崽轻度麻醉使用forthane (Isoflurathane)和手术植入一个灵活的i.g.插管。人工鼠牛奶送到老鼠幼崽通过聚乙烯线连接到套管使用multisyringe输液泵(KDS220 multisyringe输液泵;KD科学)。我们已经表明,免疫标记的变化直接归因于公式而不是外科手术(17]。

2.3。实验设计

大鼠喂养一个标准non-purified饮食不包含卵子(雷德利Agriproducts Pty Ltd,维多利亚,澳大利亚)。一窝老鼠幼崽从120亿年被随机分配组(/组)。每组(包括大坝饲养组)组成的混合的幼崽从窝来自许多不同的大坝。每天或者一个间歇使用口服卵子接触政权。有五个喂养组:大坝饲养幼崽(博士),幼崽博士接受每日口服填喂法(0.1毫升)的10毫克卵子/天(卵子:Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)从42天(),幼崽博士接受卵子的初始口服填喂法在第四天之后,随后填喂法与卵子10天,12日和13日(0.1毫升)的10毫克卵子/天()、人工喂养的小狗(FF)和FF幼崽接收每日口服填喂法(0.1毫升)的10毫克卵子/ d ()。在第14天老鼠幼崽被杀(断奶之前)。

血液通过心脏穿刺收集和储存在−血清80°C。脾脏被切除之前,在液态氮snap-frozen,储存在−80°C。胃肠道切除,并从回肠组织被隔离起来,要么重和snap-frozen在液氮后RNA和蛋白质分析或在4%中性缓冲福尔马林固定24小时,转移到70% (v / v)乙醇为以后处理。

2.4。IgG1 IgE, IgA分析

血清OVA-specific IgE和OVA-specific IgG1被ELISA如前所述[量化23),但卵子用于涂层。幼崽的血清稀释5倍ELISA试验进行分析。标准和样本添加到复制和发现colorimetrically使用3、3′,5、5′tetramethylbenzidine(三甲;Sigma-Aldrich化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。检测的局限性OVA-specific IgE和OVA-specific IgG1 ELISA检测分别为1.95和0.78 ng / mL,分别。板块与日出麦哲伦板读者在阅读450海里(Tecan集团有限公司、Mannedorf、瑞士)免疫球蛋白和数据表示为ng / mL血清。

量化了IgA ELISA使用回肠组织。回肠蛋白质溶解产物用于描述的IgA ELISA是准备托雷et al。16]。短暂,回肠蛋白质溶解产物是由添加蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(Sigma-Aldrich化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)肠道组织(1毫升/ 100毫克组织),当时均质和离心两次。上层清液收集、整除、储存在−80°C到分析。小狗IgA分析样本稀释组博士和1/5 1/2000了FF组。标准,纯化鼠IgAκ,捕捉抗体,老鼠anti-rat IgA、二级生物素鼠标anti-rat IgA都购自BD生物科学(美国新泽西富兰克林湖)。简单地说,96 -孔板(格林尼Frickenhausen,德国)被涂上一层2μg / mL鼠标anti-rat IgA在磷酸盐(PBS)一夜之间在4°C。与洗井是洗五次缓冲区(Tween20 PBS / 0.05%),然后阻塞1小时在室温下以1% Polypep蛋白质消化(Sigma-Aldrich化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)在PBS。样品和标准(纯化鼠IgA;标准范围:125 ng / mL 1.95 ng / mL)被添加到板,并在室温下培养1小时。孵化后,盘子洗了5次,生物素添加鼠标anti-Rat IgA (0.5μg / mL)。盘子被孵化室温1小时,然后洗了六次。最后洗后,ABC的溶液试剂(美国加州向量实验室,伯林盖姆Inc .)说,在室温下盘子孵化30分钟。盘子被洗6次;洗后三甲基质添加到井30分钟后这段时间的反应是停止使用50μL 2 N的盐酸和阅读在450 nm的吸光度。IgA的检测极限是1.95 ng / mL。数据被表示为ng免疫球蛋白/ g的组织。

2.5。实时聚合酶链反应

从脾脏中提取RNA和回肠,互补脱氧核糖核酸合成、引物设计、实时PCR和分析进行了如前所述[16]。引物TGF -β1、Smad2 Smad4,我Smad7, Foxp3在表提供1。

2.6。组织学评估

免疫组织化学分析TGF -β1和Smad4段回肠。Four-micrometer部分从石蜡包埋组织,放在gelatin-coated幻灯片。部分在分级deparaffinized二甲苯和水化乙醇在水里。部分被放置在10毫米柠檬酸缓冲(1.8毫米柠檬酸;8.2毫米柠檬酸钠,pH值6.0)和被燥热引起抗原决定基恢复使用微波辐射[41]。部分被染色之前在室温下冷却30分钟。

TGF -β1,部分描述的是彩色Penttila et al。40]。对Smad4染色,组织部分第一次孵化5%正常马血清/ 1%牛血清白蛋白(BSA NHS 5% / 1%)在三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐在室温下(TBS) 30分钟阻止二次抗体的非特异性结合。然后抑制性抗体是倾析和100年μL (anti-Smad4免疫球蛋白(8μg / mL;圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯、钙、美国)补充说,一夜之间,部分被孵化在4°C。孵化后部分被洗了三次在TBS含0.05%渐变20 (ttb;5分钟/洗),然后孵化在3% (v / v)过氧化氢在室温下15分钟,淬火内源性过氧化物酶活性。TBS的部分被洗了三次(5分钟/洗)之后,第二抗体(合共轭驴anti -鼠标- 3.2μg / mL;杰克逊免疫研究实验室、西树林,PA。美国)是应用于部分(100μL /部分)和部分孵化在室温下为60分钟。部分被洗的ttb(5分钟/洗)后面跟着两个洗两次TBS(5分钟/洗)。对于TGF -β1和Smad4染色、免疫组织化学反应是使用3可视化,3-diaminobenzidine (DAB)基质+增强剂(表达载体,加州卡尔斯巴德,美国)。基质开发后,部分复染色,与梯度乙醇脱水,安装。

控制样品TGF -β1包括部分与正常鸡IgY孵化(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国)或抗体稀释缓冲。控制样品Smad4包括部分孵化NHS为5% / 1% BSA(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国)或同形像控制,鼠标IgG1 (8μg / mL)。数字图像的TGF -β1和Smad4免疫组织化学部分(400 x放大)拍摄和分析使用图像专业+软件,版本5.1(美国媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)。

2.7。统计分析

所有数据都表示为平均值+标准平均误差(SEM)。数据评估分析之前正常。OVA-specific IgE和IgG1 TGF -β1、Foxp3 Smad2 Smad4,我Smad7 mRNA表达数据进行评估利用非参数单向方差分析(克鲁斯卡尔-沃利斯)其次是邓恩的事后多重比较检验。差异被认为是重要的。所有统计分析和比较了使用GraphPad棱镜软件,版本3(美国加州圣地亚哥GraphPad软件公司)。

3所示。结果

3.1。体重变化

喂养卵子博士或FF小狗并不影响身体体重增加14天(数据没有显示)。

3.2。OVA-Specific IgE, OVA-Specific IgG1 IgA

卵子在配方喂养导致显著增加OVA-specific IgE效价与博士相比组(;图1(一))。血清OVA-specific IgG1也显著增加集团()与博士相比,,,和FF组织(图1 (b))。重要的是,OVA-specific IgG1滴度博士组之间没有显著差异,不管口头卵子接触。IgA明显更大的博士,,组(),在FF和几乎没有察觉组(图1 (c))。IgA水平博士组之间没有差别。

3.3。TGF -β1和Smad mRNA表达在脾脏和回肠

TGF -β1 mRNA表达博士和脾脏明显更大组相比,、FF和FF +卵巢组(;图2(一个))。脾TGF -β1 mRNA表达和博士之间没有显著差异组。TGF -β1 mRNA表达回肠明显更大的博士在所有组无论卵子接触而FF和组(;图2(一个));然而在回肠TGF -没有明显差异β1组博士之间的信使rna表达。Foxp3 mRNA表达脾脏明显更大的博士,和FF组相比和组(;图2 (b))。表达式博士之间没有显著差异,和FF组。虽然在回肠的mRNA表达Foxp3博士组没有差异,表达也显著大于博士组相比FF和组(;图2 (b))。

Smad通路也调查了Smad2 mRNA表达的分析,Smad4,我Smad7在脾脏和回肠。在脾脏,Smad2 mRNA表达也显著大于博士组相比和组(;图3(一个))。脾Smad2 mRNA的表达博士之间没有显著差异,和FF组。Smad 4 mRNA表达脾脏明显更大的博士和FF组相比集团(;图3 (b))。无显著差异在Smad4 mRNA表达博士之间的观察,、FF和组。我Smad7 mRNA表达博士和脾脏明显更大组相比,和组(;图3 (c))。没有显著差异我Smad7 mRNA表达之间的观察脾脏博士,老鼠,FF。在回肠,Smad2 Smad4和我Smad7 mRNA表达也显著大于博士组无论相比FF和卵子接触组(;数据3 (d),3 (e),3 (f))。在Smad2没有明显差异,Smad4,我Smad7 mRNA表达之间的回肠博士,,组。

3.4。TGF -β1和Smad4回肠的蛋白表达

TGF -β1染色主要是局部的肠上皮细胞和偶尔的绒毛固有层单个细胞回肠(数字4(一),4(b),4(c),4(d)4(e))。没有TGF -β1染色明显底部的绒毛在隐窝或周围的固有层。染色Smad4的本地化在绒毛的肠上皮细胞和细胞的固有层在所有大鼠组(数字4(g),4(h),4(我),4(j)4(k))。Smad4中没有检测到杯状细胞或平滑肌的纵向层。TGF -β1和Smad4染色一直多博士组相比无论卵暴露在部分从FF或染色老鼠。负控制(没有背景染色检测数据4(f)和4(我))。

4所示。讨论

我们调查了早期口服卵暴露后免疫反应概要博士和FF老鼠幼崽。早期口服卵暴露在幼鼠,无论剂量政权,在母亲面前牛奶保持类似的免疫反应的曝光,博士观察到大鼠的挑战,循环OVA-specific IgE水平较低;和IgG1。相比低卵子IgG1响应的老鼠崽单独喂食婴幼儿配方奶粉(没有卵子的挑战),卵子的IgE响应高(不显著不同,在卵巢挑战公式美联储幼鼠)。我们曾表明,配方奶粉喂养诱导血清总IgE的整体提升,增加IgE响应可能包含可交叉反应的抗体卵子(16]。配方喂养组只作为控制在这项研究中,我们曾显示后早期口服抗原致敏的喂养配方奶喂养幼崽(16]。结果看到OVA-specific IgG1类似于我们之前有关喂养牛奶过敏原,公布的数据β乳球蛋白(BLG),我们表明,敏感是预防maternal-milk-fed幼崽给口腔BLG在生命早期。重要的是,我们表明,该调节免疫档案保存到断奶年龄(16,23]。相比之下,免疫激活和过敏发展导致BLG美联储在公式的存在时16]。

TGF -βs是一个重要的生长因子家族参与维护肠道内稳态,调节炎症和过敏发展和促进婴儿口服耐受发展(31日]。TGF -β牛奶是主要的细胞因子在人类和啮齿动物(40,42]。TGF -β主要的信号通过Smad蛋白质家族。Smad2和Smad3磷酸化激活后TGF -β和Smad4受体,形成一个复杂的。一旦易位到细胞核,然后这个复杂的绑定到Smad绑定元素在启动子区域的TGF -β目标基因和调节转录反应与dna结合的合作伙伴(43,44]。也评估Smad基因参与途径的功能我们已经能够进一步阐明TGF -β1在肠道免疫反应的发展引入了卵子。在集团TGF -β1 mRNA表达在脾脏和当地的肠道环境没有显著差异,在老鼠博士质疑。然而,老鼠博士接受口服卵子间歇性TGF -显示降低β1和Smad2 Smad4,我在脾脏Smad7 mRNA的表达。总的来说,我们已经表明、FF和组织表现出最大的系统性损害TGF -β1 / Smad TGF -的mRNA表达较低的路径β1 / Smad基因。然而,在肠道中,第一个站点的接触食物抗原我们观察不同的表达模式。博士鼠暴露于卵子间歇性地保持TGF -β1 / Smad mRNA表达谱相似挑战博士。一个可能的解释是,外部来源的TGF -β提供由母亲的奶,足以维持这些基因的表达在当地的肠道环境。我们目前的数据还显示,在回肠FF的老鼠,有或没有卵子,低水平的所有Smad mRNA的在场博士组相比。高水平的TGF -β存在于老鼠牛奶在泌乳早期,出生后与检测到的最高水平。TGF -β水平,然后降低断奶。相比之下在maternal-fed幼鼠,TGF -的数量β1-producing肠细胞信使rna是低出生后,但水平增加断奶期间(40]。TGF -β是至关重要的维持体内平衡的肠道,促进T调节细胞,我们的数据表明,当地的FF幼崽受损肠道环境对发展潜力监管食物抗原的免疫反应。我们已经在以前的研究中显示,当BN幼鼠美联储一个公式与生理水平的TGF -补充β、标记与过敏相关开发减少和免疫反应概要牛奶过敏原,BLG不明显不同,在挑战maternal-milk-fed幼崽。这个调控免疫反应概要文件延长断奶年龄,突出TGF - - -的重要性β在发展中,防止致敏食物抗原(23]。

TGF -β1信号是由抑制性控制我Smads,主要我Smad7 [43,44]。我们已经表明,尤其是回肠,TGF -β1,我Smad7 mRNA水平维持稳态的平衡,可能会形成一个负面反馈循环。记录的转录我可以打开Smad7 TGF -βTGF -β/ Smad信号通路(45]。这表明,即使在早期口服抗原的存在挑战粘膜免疫系统可以开发和维护这样的监管机制。

TGF -β信号促进t细胞在整个寿命宽容和帮助维持正常的体内平衡。TGF -β优先增加IgA抗体反应,指导同形像切换到IgA在派尔集合淋巴结补丁46]。小川et al。47)在新生儿的研究显示在第一个月的生活增加血清两TGF - IgA与水平β1、TGF -β2在产妇初乳47]。我们的数据支持的角色TGF -β在调节IgA水平在早期食品介绍在母亲面前牛奶。我们已经表明,早期口服卵暴露在母亲的奶,比公式,维护IgA的水平。FF组,IgA水平仅略高于测定的检出限。

以及参与上皮生长,IgA生产、DC成熟,Treg细胞分化,TGF -β年代抑制肠内炎症和调节炎症反应(17,48- - - - - -51]。在成年人的肠,TGF -β1是主要的同形像出现在上皮和固有层细胞(52]。我们评估了本地化模式的TGF -β1和Smad4博士和FF老鼠的小肠有或没有抗原暴露。更丰富的TGF -染色β观察1和Smad4的博士群体,不管抗原暴露而FF组。组织学支持我们的TGF -β1和Smad4 mRNA表达数据在回肠和再次强调潜在的致敏在FF老鼠幼崽。我们演示了在当地的肠道环境,配方奶粉喂养在生命早期的结果在一个总体抑制TGF -β1和信号通路相关基因,即Smad2 Smad4,我Smad7。

TGF -β也需要感应的亚群,发挥重要作用在维持肠道的免疫内稳态。Foxp3⁺(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)监管细胞的发展是必要的口头公差(53- - - - - -56]。Foxp3 mRNA表达维护在回肠博士的老鼠接受卵子的日常表达水平类似的回肠博士不受挑战的老鼠。回肠Foxp3 mRNA表达的或博士组没有区别观察组但降低脾Foxp3 mRNA组。减少Foxp3 mRNA表达也观察到在回肠和脾脏的FF幼鼠接受卵子。我们先前已经表明该减少FoxP3 mRNA表达也指出FF BN大鼠肠系膜淋巴结的幼崽在第14天,FoxP3的频率⁺细胞在maternal-fed BN大鼠崽接受连续剂量的BLG [16]。具体的作用⁺/ CD25⁺/ CD4⁺亚群在食物过敏的发展目前还不清楚。它已经表明,Foxp3⁺细胞存在于肠道的食物过敏的孩子,但Foxp3转录水平较低(57]。相比之下,其他研究报告的低表达Foxp3在转录和缺陷55]。已经表明,重复小剂量抗原是必要的口语发展的公差由Treg细胞(58]。我们的研究结果表明,连续与间歇抗原暴露在母亲面前牛奶也许需要促进外围Treg细胞和Foxp3表达。每天反复接触卵子相比断断续续(偶尔)暴露可能让不成熟的免疫系统时间“实践”,因此有助于调节免疫反应的主要发展以防止敏感,可能增强后宽容的发展。

在婴儿过敏倾向发展,推迟固体的喂养,直到6个月之后项目发展中免疫反应对敏化(15,59]。纯母乳喂养的时间等因素,时间的介绍,和其他食物的类型(过敏原)饮食也被认为影响宽容和敏化[之间切换15]。支持这一点,在之前的时间进程的研究早期牛奶过敏原接触(BLG开始在生命的第四天)我们表现出减少水平的标记与过敏相关发展第十天,14日和21 BLG暴露后的生活在母亲面前牛奶(16]。在我们目前的研究评估早期断奶时间点的生活(14天)我们将会显示一个upregulation标记的水平与immuno-regulatory机制后早期卵巢曝光。日常但不间歇口服卵子接触开始4天产妇母乳喂养期间创建了一个免疫环境的潜力减少致敏食物抗原。Foxp3 mRNA表达,TGF -β1 mRNA和蛋白表达,表达的Smad基因参与TGF -β信号维持肠道的微环境和外围。早期经常接触食物抗原(卵子)在母亲面前牛奶在生命早期维护免疫调节机制防止过敏敏化。

补充材料