文摘

我们研究了n - 3 PUFA的膳食补充剂的影响(鱼油源)的一个食物过敏的实验模型。小鼠致敏(集团)过敏或不与卵子(nonallergic组),与卵子的饮食喂养,诱发过敏的信号。老鼠与普通饮食中脂质含量的7%是由大豆(n - 3 PUFA的5%)提供或鱼(25%的n - 3 PUFA)石油。过敏组小鼠血清水平的增加antiovalbumin IgE IgG1和小肠的变化,以增加水肿,滚动微循环中白细胞数量、嗜酸性粒细胞浸润,粘液,Paneth细胞脱颗粒,相比非过敏性。所有这些炎症参数减少high-n-3-PUFA饮食的老鼠。我们的数据表明,n - 3 PUFA的饮食补充鱼油可由食物过敏的一个有效的辅助治疗。

1。介绍

膳食蛋白质的正常免疫反应与口服耐受的诱导,包括修改由胃肠道酶抗原的内腔,后接触特定抗原递呈细胞有明显激活需求,和调节性T细胞的活化。我们接受口服耐受机制的崩溃或感应口服耐受的失败导致食物过敏(1,2]。

食物过敏是障碍,影响约20 - 30%的人口在发展中国家,使他们一些最常见的慢性疾病(3]。人们普遍认为6 - 8%的儿童3岁以下出现食物过敏反应(4,5),特别是ige糖甙(6]。牛奶、鸡蛋、花生、栗子和虾通常与食物过敏发作(4,7]。在这些过敏性患者,持续的无意识的接触食品过敏原可能会引起轻微的和持久的过敏情况涉及皮肤、胃肠道和呼吸道疾病或引发多器官功能与心血管系统反应崩溃(8]。因此,有相当大的兴趣确定干预措施能够防止或修改这个病理条件。

大多数食物过敏的主要治疗策略是基于避免过敏原,这可能存在潜在的不良营养不良相关增长不足,神经发育,和心血管健康9,10]。治疗策略在研究包括口服免疫疗法(11)、疫苗(12),中国草药13),和膳食抗氧化剂补充策略(14]。另一个可用的治疗选择是使用必需脂肪酸的预防和治疗过敏的症状,一旦过敏患病率的增加与现代饮食风格(增加消费n-6多不饱和脂肪酸(n-6 PUFA)和n - 3多不饱和脂肪酸可降低摄入量(n - 3 PUFA)) (15,16]。然而,没有明确的证据关于免疫调制概要文件使用的n - 3中PUFA过敏。

在此基础上,在目前的研究中,我们评估的影响慢性摄入的n - 3 PUFA食物过敏的小鼠模型。为了模拟这种持续的食物过敏的情况,我们使用了一个实验模型的食物过敏卵白蛋白-(卵子)敏化BALB / c小鼠有口头抗原(17]。这个模型模拟几个病变发生在食物过敏患者包括增加anti-OVA IgE IgG1生产、肠道水肿,嗜酸性粒细胞浸润在小肠18]。

2。材料和方法

2.1。动物

雌性BALB / c小鼠在四周的年龄得到从我们动物设施(ICB / UFMG)。所有老鼠都收到了水和食物随意。程序是按照道德原则在动物实验中,采用动物实验伦理委员会的机构(CETEA / UFMG)。

2.2。饮食

两种不同的饮食准备依照ain - 93组件(19),不同脂肪酸成分。老鼠与普通饮食中7%的脂质含量是由大豆(对照组:5%的n - 3 PUFA)或鱼油(n - 3 PUFA的n - 3 PUFA组:25%)。饮食消费开始只是在断奶后还是老鼠(图1)。脂肪酸成分的饮食是显示在表2。新鲜的饮食是每2天,以避免脂质氧化。之前所有饮食中蛋白质的14%(酪蛋白抗原挑战和卵白蛋白抗原的挑战;表1和2)。脂肪酸的鱼油在这项研究中的应用是研究化学部门的科学研究所(ICEx / UFMG)使用气相色谱法。大豆油脂肪酸概要的使用(Lisa)是通过Sanibal和曼奇尼球场,2004年(20.]。

表1
老鼠食物成分(基于ain - 93 g饮食)。
表2
脂肪酸成分的老鼠的饮食。
(一)
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(b)
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图1
实验性的协议。BALB / c小鼠分离在4组:控制/ nonallergic,控制/过敏,n - 3 PUFA / nonallergic和n - 3 PUFA /过敏。根据饮食,老鼠收到5% n PUFA(对照组)或25% n PUFA (n - 3 PUFA组)以来,他们的饮食来源的脂质实验(断奶后)的开始到最后(7周)。按照免疫程序、小鼠致敏和接收一个升压(过敏组)和卵清蛋白(nonallergic组)。升压后7天,所有老鼠接受卵子的饮食(脂类的饮食保持相同的概要文件但蛋白质的来源是由酪蛋白卵白蛋白)。7天之后,老鼠牺牲和收集的血清和组织分析。
2.3。小鼠致敏和口腔的挑战

实验后21天(周3)的饮食消费(没有卵子),过敏组(卵子+)收到0.2毫升生理盐水(0.9%)与佐剂(1毫克Al (OH)3)和10μg卵子(五次结晶母鸡的蛋白蛋白;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。nonallergic集团(卵子−)只有盐和辅助。后14天(周5),免疫助推器是10μg卵子过敏组。同时,nonallergic老鼠收到盐水。所有注射进行皮下注射。经过7天的助推器(星期6),这两种不同的饮食保持相同的成分对脂质水平;然而,对于所有组酪蛋白取代卵白蛋白(冻干蛋white-Salto,贝洛奥里藏特、镁、巴西)在致敏小鼠诱发过敏症状(图7天1)。

2.4。血清抗体的评估

经过7天的连续挑战与卵子的饮食(7周),所有老鼠都是麻醉的ip注入10毫克/公斤混合甲苯噻嗪盐酸氯胺酮和200毫克/公斤。血清收集了anti-OVA IgG1和IgE分析。ELISA IgG1是使用板涂有卵子和100年μL 1: 8000稀释小鼠血清,山羊anti-mouse IgG1(生物技术协会南部,伯明翰,阿拉巴马州,美国)与过氧化物酶标记抗体和兔(生物技术协会南部,伯明翰,阿拉巴马州,美国)。板块开发o-phenylenediamine和H2O2在492 nm,读一个自动化ELISA读者(EL800 Bio-Tek仪器,Inc . Winooski, Vt,美国)。capture-ELISA Anti-OVA IgE是用盘子涂有老鼠anti-mouse IgE, 50μ血清L,生物素化的卵子,如前所述[21]。抗体的结果被发表在任意单位(1000 A.U)根据标准曲线用串行混合血清的稀释OVA-hyperimmunized BALB / c小鼠。

2.5。组织学分析

经过14天的口头挑战,老鼠被颈椎脱位牺牲。近端空肠拍摄进行组织学分析。这是10%福尔马林固定在PBS,嵌入在石蜡,切成5μ米厚的部分。部分都沾过碘酸希夫(PAS)与hematoxylin-eosin粘液分析或评估嗜酸性粒细胞浸润。从hematoxylin-eosin-stained十字段部分被随机选择40 x (53.333μ米2/字段)为了计算嗜酸性粒细胞的数量,和数据报告的嗜酸性粒细胞数量/字段。粘液分析,三个部分空肠沾过碘酸希夫提交的形态学分析使用一个图像分析程序运行在一个IBM的计算机。图像得到40 x (53.333μ米2/字段)JVC tk - 1270 / RGB获准与KS300软件构建和分析Kontron Eletronick /卡尔蔡司图像分析仪。杯状细胞体积的测定,所有与绿色像素选择创建一个二进制的形象和随后的总面积计算,和数据报告的比例粘液区域/面积。

2.6。肠微循环活体的显微镜

研究白细胞招募在活的有机体内、动物麻醉,通过中线切口的腹部开了。老鼠被保持在恒定的温度(34°C)。选择一段小肠并放置到一个阶段,和微循环使用活体的显微镜,荧光显微镜成像(奥林巴斯BX41)。若丹明6 g用于可视化的滚动和粘附细胞在肠道微循环。轧制是通过计算测量细胞的数量,对于一个给定的点在3分钟(细胞/分钟)和细胞仍然停止在同一点30秒数作为粘附细胞。

2.7。统计分析

结果表示为均值±SEM,正如图中显示的传说。意义是取决于ANOVA-Tukey和学生t测试, 定义的意义超过对照组。

3所示。结果

3.1。评价血清Anti-OVA IgG1和IgE抗体

实验过敏协议诱导显著增加血清水平的特定anti-OVA IgE和IgG1。有趣的是,n-3-PUFA-supplemented小鼠显著降低特定anti-OVA IgE相比对照组(图2)。

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图2
膳食补充剂与n - 3 PUFA anti-OVA IgE的血清浓度降低和IgG1 BALB / c-sensitized老鼠。BALB / c小鼠5% n PUFA(对照组)或25% n PUFA (n - 3 PUFA组)作为他们的饮食来源的脂质致敏前21天。BALB / c小鼠致敏(过敏,卵子+)不(nonallergic卵子−与卵子)。升压后7天,所有老鼠接受卵子的饮食。7天之后,老鼠牺牲和血清收集测量anti-OVA IgE, IgG1 ELISA。数据报告为±SEM手段5动物/组。* 而nonallergic集团(卵子−)用同样的饮食,和* * 相对于对照组(ANOVA-Tukey)过敏。
3.2。肠道组织学分析

卵子的摄入的饮食诱导粘膜下水肿和提高脱粒Paneth在粘膜细胞和炎性细胞浸润。有增加10倍的嗜酸性粒细胞数量控制过敏组相比nonallergic老鼠。有趣的是,水肿和嗜酸性粒细胞浸润显著降低在n - 3 PUFA增加饮食的老鼠。同时,从n - 3 PUFA-supplemented Paneth细胞小鼠显示常规的脱粒,类似于控制(图3)。

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图3
膳食补充剂与n - 3 PUFA减少组织学炎症参数在BALB / c-sensitized小鼠空肠。BALB / c小鼠5% n PUFA(对照组)或25% n PUFA (n - 3 PUFA组)作为他们的饮食来源的脂质致敏前21天。BALB / c小鼠致敏(过敏,卵子+)不(nonallergic卵子−与卵子)。升压后7天,所有老鼠接受卵子的饮食。7天之后,老鼠牺牲和小肠被组织学分析。(一)Nonallergic控制;(b)过敏控制;(c) nonallergic n PUFA;(d) n - 3 PUFA过敏。酒吧= 50μm。(b),长箭头显示嗜酸性粒细胞,短箭头显示Paneth细胞,星号显示粘膜下水肿。在(e),数据报告意味着±SEM的嗜酸性粒细胞5在每组动物的数量。* 而nonallergic集团(卵子−)用同样的饮食,和* * 相对于对照组(ANOVA-Tukey)过敏。
3.3。评价肠粘液的杯状细胞

连续暴露于抗原诱导的粘液的分泌量显著增加小肠的杯状细胞致敏野生型BALB / c小鼠相比nonsensitized动物。另一方面,抗原摄取诱导没有粘液分泌增加和n - 3 PUFA饮食的老鼠的小肠(图4)。

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图4
膳食补充剂与n - 3 PUFA减少粘液生产BALB / c-sensitized小鼠的小肠。BALB / c小鼠5% n PUFA(对照组)或25% n PUFA (n - 3 PUFA组)作为他们的饮食来源的脂质致敏前21天。BALB / c小鼠致敏(过敏,卵子+)不(nonallergic卵子−与卵子)。升压后7天,所有老鼠接受卵子的饮食。7天之后,老鼠牺牲和小肠被组织学分析。(一)Nonallergic控制;(b)过敏控制;(c) nonallergic n PUFA;(d) n - 3 PUFA过敏。酒吧= 50μm。(e),数据报告为±SEM的粘液生产每组5只老鼠。* 而nonallergic集团(卵子−)用同样的饮食,和* * 相对于对照组(ANOVA-Tukey)过敏。
3.4。活体的显微镜的肠

白细胞招募是炎症反应的标志特征,它包括一系列连续的分子之间的相互作用的白细胞和内皮细胞22]。一旦我们发现减少嗜酸性粒细胞浸润在n3-PUFA组,我们决定调查,利用活体的显微镜,在这一步的白细胞招聘这个饮食干预。过敏组滚动和粘附白细胞数量的增加肠道微脉管系统后卵子的饮食。然而,n - 3 PUFA饮食的老鼠显示滚动白细胞总数的减少(图5(一个))无差异贴壁细胞的数量(图5 (b))。

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图5
膳食补充剂与n - 3 PUFA减少白细胞滚动BALB / c-sensitized小鼠的小肠。BALB / c小鼠5% n PUFA(对照组)或25% n PUFA (n - 3 PUFA组)作为他们的饮食来源的脂质致敏前21天。BALB / c小鼠致敏(过敏,卵子+)不(nonallergic卵子−与卵子)。升压后7天,所有老鼠接受卵子的饮食。经过七天的卵清蛋白的摄入——包含饮食(卵子),白细胞滚动(a)和粘附的微脉管系统(b)小肠被活体的显微镜检查化验。数据报告为±SEM每组3只老鼠。* 相对于对照组(ANOVA-Tukey)。

4所示。讨论

Immunoglobulin-E-dependent食物过敏通常与不同程度的嗜酸性影响胃肠道炎症和水肿8]。食物过敏的治疗主要是基于药理方法(主要是抗组胺剂和脂醇)和食物抗原逃避,是最后一个在几个耐火病人唯一有效的选择。从这个意义上讲,补充剂能够减少或避免过敏反应对食品内容可能是有前途的。食物过敏模型使用在这项研究中,当ovalbumin-sensitized小鼠接受卵子(抗原)饮食,观察几种食物过敏的迹象,包括增加血清antiovalbumin IgG1 IgE和明显的组织学发现肠道炎症(粘液分泌过多,嗜酸性粒细胞浸润,Paneth细胞脱颗粒,和水肿)(17]。在目前的工作中,我们已经表明,卵子过敏小鼠不太严重的过敏反应,当饮食中ω- 3多不饱和脂肪酸增加。我们提供的证据表明,减少OVA-specific IgE生产n-3-PUFA-supplemented饮食导致减少到肠道粘膜嗜酸性粒细胞浸润,与温和的小鼠的肠道炎症反应。这些数据表明,食物补充n PUFA可能由一个有前途的治疗食物相关场地障碍尽管避免食物过敏。

已知的机制参与IgE-dependent食物过敏是由于Th2细胞产生il - 4的一代进一步代IgE IgG1抗体(8]。这些免疫球蛋白结合在肥大细胞通过其高亲和力受体( ),导致释放大量的促炎介质和蛋白酶到相邻的组织23]。此外,这些激活肥大细胞产生Th2型细胞因子,包括IL3 IL-5, IL-13,导致嗜酸性粒细胞的积累促进Th2细胞在炎症组织的扩张和释放促炎介质upregulation粘附系统,调制的细胞贩运,激活和调节血管通透性和粘液分泌,和组织损伤24]。粘膜免疫系统账户的机制,以避免无法控制对食物抗原的免疫反应,包括存在的调节性T细胞在肠道淋巴组织(25和粘液(物理屏障对抗原)(26]。与此一致的是,被动增加粘液生产预计在食物过敏模型,这是减少没有il - 4和IgE [27]。此外,肠道粘膜细胞发挥关键作用在消化道内稳态。Paneth细胞分泌细胞在小肠的上皮细胞,位于小集群Lieberkuhn隐窝的底部,他们是主要的源或抗菌肽在肠道28]。描述这些肽采取行动保护肠道黏膜对肠道细菌病原体,作为一个关键的自我平衡的角色参与建立和维护肠道菌群(29日]。在我们的研究中,组织学评估显示,在食物过敏脱粒Paneth细胞中观察到的概要文件。虽然没有被直接联系Paneth细胞和食物过敏,我们建议这些细胞可能参与allergy-induced肠道粘膜炎症。

多不饱和脂肪酸(包括n - 3和n-6 PUFA)是几类花生酸的前体,如前列腺素(PG),白细胞三烯,凝血恶烷,hydroxyeicosatetraenoic酸。消费n-6 PUFA导致特定类花生酸的形成与促炎的概要文件,在过敏性炎症有着至关重要的作用。因此,亚油酸(LA;C18: 2 n-6)的一个主要膳食n-6 PUFA,转化为花生四烯酸(AA);甜:4 n-6),纳入膜磷脂(30.]。在新陈代谢,AA释放磷脂酶和代谢PGE2,驾驶Th2反应子集。从这个意义上说,不平衡膳食摄入n-6 PUFA过敏性疾病的易感性可能增加il - 4和顺向IgE生产。与之形成鲜明对比的是,n - 3 PUFA摄入增加将导致代谢与n-6竞争PUFA新陈代谢,最终减少PGE2的合成,降低il - 4和IgE,见我们的模型(27]。此外,n - 3 PUFA补充过敏子集可能是有益的,因为更少的炎性环境可能实现在脂肪酸代谢(31日]。

事实上,n - 3 PUFA补充导致那么严重过敏小鼠的肠道粘膜炎症和减少IgE的生产。这个语句可以加强三大发现。首先,低水平的IgE观察补充老鼠。极其IgE激活肥大细胞,可以发布多个介质IgE激活,IL-5和eotaxin强有力的化学引诱物嗜酸性粒细胞。这也许可以解释观察到的嗜酸性粒细胞明显减少在n-3-PUFA-supplemented老鼠。事实上,以前的报告表明,DHA和EPA都能够减少嗜酸性粒细胞趋化因子和chemokinetic反应的剂量依赖性的方式(31日]。第二,我们观察到更少的粘液生产和Paneth细胞脱粒n-3-PUFA-supplemented老鼠,这是一个明显的组织学显示轻微的肠道炎症反应(27]。最后,肠道微脉管系统的活体的显微镜显示,鱼油富含n - 3 PUFA的食物导致滚动白细胞总数的减少,减少的迹象endothelial-leukocyte交互。一些报告表明,消费的n - 3鱼油PUFA可能减少一些慢性炎性疾病的炎症反应的特点是白细胞积累如动脉粥样硬化、哮喘、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、类风湿性关节炎(32- - - - - -35]。在先前的一份报告表明,氧化EPA白细胞与内皮细胞的交互的有效抑制剂。建议的机制负责这种效应似乎是核受体的激活过氧物酶体proliferator-activated受体 (PPAR 白细胞粘附受体表达的差别)和后续对这些36]。

与先前的作品如我们的结果是一致的,由渡边等人表明,IgE抗体反应对卵清蛋白显著降低老鼠的红花籽油(37]。Yamashiro等人也表明,肠粘膜损害对卵白蛋白过敏性反应是由omega-3-fatty-acid丰富饮食(38]。另一方面,根据模型或喂养设计,结果是有争议的。例如,约翰逊等人表明,气道过敏(Th2)期间,老鼠和鱼油生产高水平的OVA-specific IgE略高嗜酸性粒细胞浸润进入肺部。与之相反,慢性n PUFA消费(在我们的研究中所示)或lipid-based过敏预防执行自子宫,通过产妇的饮食(39,40),提供有益的免疫调制的证据和炎性组织损伤少。进一步的基本调查可能为新的试验提供指导,因为荟萃分析研究并没有证实的有益作用n或n-6 PUFA补充作为食物过敏的一级预防策略41]。

总之,我们已经表明,饮食补充鱼油的n - 3 PUFA导致减少肠道炎症反应对食物抗原,这表明n PUFA可能调节过敏免疫反应。

确认

作者感谢慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq /巴西)和Fundacao德帕罗尽管做Estado de米纳斯吉拉斯(FAPEMIG /巴西)对金融支持。一些作者也接受CNPq研究奖学金(d·a·佩雷斯·g·b·塞斯和特区卡拉)和斗篷研究奖学金(S.S.A.和P.E.P.S)。o . g .•马托斯和s . s . Amaral贡献同样这项工作。