HSV-1 miR-H6在体外抑制人角膜上皮细胞中的HSV-1复制和IL-6表达

摘要

角膜内的HSV-1感染可导致失明。单纯疱疹病毒1 (HSV-1)的感染细胞多肽4 (ICP4)是病毒转录调控因子，是生产性感染所必需的。此前已经证明，HSV-1基因组编码的miR-H6靶向ICP4帮助维持潜伏期。在本研究中，将合成的miR-H6模拟物转染到hsv -1感染的人角膜上皮(HCE)细胞中。通过空斑实验、免疫荧光和Western blot验证了mir - h6转染HCE后对HSV-1复制和病毒ICP4表达的抑制作用。与未转染或mock相比，miR-H6产生低滴度HSV-1和弱的ICP4表达。此外，通过ELISA检测，miR-H6可以降低释放到培养基中的白细胞介素6。综上所述，这些数据表明，miR-H6靶向ICP4可抑制HSV-1的产生性感染，并减少HCE中白细胞介素6的产生，这可能为预防HSV-1溶解性感染和抑制角膜炎症提供了一种途径。

1.导言

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种线性双链DNA病毒，主要感染上皮细胞和神经细胞。HSV-1的生产性感染需要一系列基因表达（即早期、早期和晚期基因）、病毒DNA复制、病毒组装和排出。HSV-1的即刻早期（IE）基因ICP4（感染细胞多肽4）是高效转录早期和晚期病毒基因所需的主要调节基因之一，并通过生产性复制周期驱动HSV-1[1，2］.ICP4也在潜伏期HSV-1的再激活中发挥作用。ICP4的调控似乎是由延迟相关转录本(LATs)在转录后水平发挥的[3.，4］.抑制ICP4基因可抑制多种细胞内病毒的产生[5- - - - - -8］.

MicroRNAs (miRNAs)是一种小型的、21~23个核苷酸的非编码rna，在从单细胞真核生物到多细胞真核生物的广泛生物体中通过各种机制在基因表达的转录后调控中发挥重要作用[9］.2004年首先在Epstein-Barr病毒中报道病毒miRNA的存在[10］.microrna由病毒编码的发现表明,病毒已经进化到利用RNA沉默的监管自己的基因,宿主基因,或两者兼而有之,导致功能包括(I)潜伏性和溶解性病毒感染,(II)免疫逃避,(3)防止细胞凋亡(IV)病毒复制,和其他(V) (11- - - - - -13]至于HSV-1，2006年报道了第一个microRNA，miR-H1，作为生产性感染中的晚期基因表达[14］.此外，2009年首次报道人类脑细胞HSV-1感染诱导miRNA-146a介导炎症信号[15].到目前为止，已发现16个HSV-1 miRNA[4，12，14，16]其中，miR-H1和miR-H6均位于LAT启动子的上游。miR-H1由LAT启动子上游的序列在LAT义方向编码，而miR-H6位于LAT反义方向[16］.Umbach等首先发现miR-H6下调ICP4蛋白的表达，提示其有助于病毒潜伏期的建立和维持[4］.同样，潜伏感染的特征是大量表达编码LAT的位点，它可以抑制神经元细胞系中的裂解复制和IE基因表达[3.］.然而，miR-H6和H1在培养细胞感染后2小时(p.i.)就被检测到，在产生HSV-1的感染样本中大量表达，而其他HSV-1 miRNAs(即miR-H2， -H3和-H4)在潜伏感染期间大量表达[16，17］.同时，在感染突变HSV-2病毒的细胞中显着降低miR-H6表达，其插入LAT启动子和miR-H6之间的序列[18]，以及潜伏但非急性感染的带有HSV-1 LAT缺失突变体的小鼠神经节(dlLAT1.8) [17］.这些结果表明，除了在裂解感染期间大规模表达miR-H6时，除了建立和维持潜在感染之外，它可能在病毒感染期间发挥其他作用[12，17］.

作为人类的主要病原体，HSV-1可导致多种疾病，甚至可能危及生命[19，20.］.HSV-1感染常见的眼部表现包括睑缘炎、结膜炎、角膜炎和葡萄膜炎;其中，复发性病毒性角膜炎可导致严重角膜失明[2]此外，角膜组织被认为是HSV-1潜伏感染的部位[2，21，22].角膜上皮由基质前方的几层细胞组成。因此，它被赋予了抵御外源性病毒入侵的重要作用。HSV-1在角膜上皮细胞中的原发感染通常表现为树突状病变。然而，HSV-1诱导的角膜炎也经常出现，如大量的病毒裂解感染并不能直接产生炎症的免疫病理学[23- - - - - -26]在这种情况下，细胞因子在病毒诱导的免疫病理学中起着重要作用。一种已知有助于HSV-1免疫应答的细胞因子是白细胞介素-6（IL-6），它是一种具有多种活性的细胞因子，包括促炎和抗炎活性[27］.同时，HSV-1的LAT和ICP0启动子内存在IL-6响应元件，可能是IL-6诱导的转录因子的结合位点。LAT启动子中IL-6反应元件缺失的病毒结构体，比不缺失的类似结构体的重新激活率低得多[28］.通过HSV-1感染诱导的IL-6在诸如白细胞等各种细胞中报道了[29]、上皮细胞EMT-6和HaCat [30.，31，以及角膜上皮细胞和成纤维细胞[32］.

关于裂解感染中的大量表达和miR-H6编码序列（LAT启动子上游）的位置，我们想知道miR-H6是否与其他miRNA（miR-H2-miR-H5）具有不同的功能因此，我们研究了靶向ICP4的miR-H6对HSV-1复制的影响，特别是对人类角膜细胞中IL-6产生的影响。我们发现靶向ICP4的miR-H6抑制HSV-1复制并减少HCE中IL-6的产生，这可能提供了一种预防HSV-1裂解感染的方法抑制角膜炎症。

2。材料和方法

2．1．细胞与病毒感染

本研究中使用的HCE衍生自人肢细胞，如前所述[33，34].细胞在补充有10%胎牛血清（FBS；美国纽约州Gibco）的DMEM/高糖中培养，10 ng/mL人表皮生长因子（EGF；西格玛，密苏里州圣路易斯市），5 μg/mL人转铁蛋白（西格玛），5 μg/mL胰岛素，0.4μg/mL氢可的松(Gibco BRL, Grand Island, NY)。HEp-2细胞在含10%新生牛血清的DMEM/F12中生长(Gibco, NY, USA)。细胞在37℃5% CO中孵育₂-95%的空气孵化器。将HSV-1 (F毒株)的病毒株在HEp-2细胞上繁殖，并根据前面所述的方法测定病毒株效价[35］.

使用前面描述的方法，HCE细胞被HSV-1感染[5，34］.简单地，将细胞培养到80 - 90%融合，然后用HSV-1感染1小时，每15分钟轻轻摇晃15秒，让病毒吸收。1 h后，去除接种物，用无血清DMED/高糖替代培养基。以5、1、0.1的感染倍数(multiplicity of infection, MOI)感染的细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次并收获。

2．2．HSV-1 miR-H6模拟物和转染

我们使用的miR-H6模拟物是双链的，由广州核糖生物有限公司（中国广州）根据成熟的miR-H6（5′-CacuuccGuccC-3′）进行化学合成模拟是一种小RNA，不以任何已知基因作为阴性对照。HCE细胞生长至70–80%汇合，然后转染miR-H6（50或100 根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）进行nM）和模拟。然后，细胞在MOI 0.1 24处感染HSV-1 在指定时间，收集细胞和培养基进行进一步实验。

2.3。斑块测定

菌斑试验如前所述进行，但经过修改[5].HCE细胞在12孔培养板中培养至70%至80%汇合，然后转染miR-H6模拟物并如上所述感染HSV-1。吸收HSV-1 1 1小时后 h、 细胞被1 甲1毫升 : 1低熔点琼脂糖（美国NuSieve GTG琼脂糖）和2×DMEM/高糖的混合物，仅允许病毒在细胞间传播。48岁 h.p.i.，小心地去除琼脂糖，并用结晶紫染色平板20分钟 然后拍照。最后，测量斑块大小。

2.4。实时PCR分析

HCE细胞培养至80%至90%汇合，然后在24小时以5、1和0.1的多重感染（MOI）感染HSV-1 h p.i.，细胞用PBS洗涤三次并收集。根据制造商的说明，用TRIzol试剂（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）分离细胞总RNA。随后，使用多功能miRNA Q-PCR检测试剂盒（中国广州富伦根）检测RNA样本miR-H6 5′引物为CaCTTCTCTCCA（产物大小为74），同源snRNA U6 5′引物为CaAATTCGTGAGGTTCCATAT（产物大小为79）。反应条件为95°C，反应时间为10分钟 在95°C温度下至少38次循环10分钟 s、 温度为65℃，温度为20℃ s、 温度为72℃，温度为10℃ s和72°C温度下5分钟 通过iQ5实时PCR检测系统（Bio-Rad）计算min。通过iQ软件计算每个mRNA的量相对于相同样本中的U6 mRNA的量。每次运行通过熔融曲线分析完成，以确认扩增的特异性。

2．5．间接免疫荧光法

在12和24小时P.I。，根据前述方法使用滑动的电池进行间接免疫荧光分析[5］.细胞与识别HSV-1 ICP4的小鼠抗人单克隆抗体(Abcam, Cambridge, UK)在4°C孵育过夜。然后用tritc标记的山羊抗小鼠IgG抗体(中国北京中山金桥)在37℃下孵育细胞1小时。用hoechst染色10分钟。然后使用共聚焦激光扫描显微镜(卡尔蔡司，耶拿，德国)观察细胞。用PBS(而不是第一抗体)孵育的细胞作为阴性对照。

2．6．免疫印迹分析

每小时24小时，用裂解液缓冲液(20 nM三盐酸)裂解细胞。冻融3次，4℃，12,000 rpm离心30分钟，去除细胞碎片。以牛血清白蛋白为标准，采用双喹啉酸法测定上清液中的蛋白质含量。按照我们之前的方法进行Western blot [5].将膜与1进行孵育 μg/mL识别HSV-1 ICP4的小鼠抗人单克隆抗体(Abcam, Cambridge, UK)或0.2μg/mL小鼠抗GAPDH（中国上海康晨）分别在4°C下过夜。然后，将其暴露于次级山羊抗小鼠IgG抗体（中国北京中山戈登布里奇）中1小时 h、 使用化学发光光敏肽（R）-HRP蛋白质印迹检测系统试剂盒（美国马萨诸塞州丹弗斯市Cell Signal Technology，Inc.）观察蛋白条带，并通过柯达成像站4000MM（美国纽约州罗彻斯特市柯达）曝光。

2.7.酶样免疫吸附试验（ELISA）

用miR-H6和模拟将HCE细胞转染，然后如上所述用HSV-1感染，或直接培养转染的细胞，没有病毒感染。The medium was collected at 6, 12, and 24 h p.i., or 30, 36, and 48 h post transfection for cells without HSV-1 infection, and the IL-6 levels in supernatant were determined using a specific IL-6 ELISA kit (Boster, Wuhan, China). Human IL-6 was used to construct a standard curve according to the manufacturer’s instructions.

2.8。统计分析

所有实验至少重复进行三次，定量数据以平均值±标准差表示。数据的统计分析采用单因素方差分析（SPSS 17.0），数据的平均值为被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.miR-H6对细胞和病毒复制的影响

如上所述，在MOI 0.1转染HCE细胞并感染HSV-1，在相差显微镜下观察6、12和24 h的细胞形态变化(图)1(一))。在6小时P.I.中，用miR-H6转染细胞的细胞形态没有明显差异，模拟，没有小RNA，对照细胞（数据未显示）。在12小时的p.i.中，可以在模拟中观察到细胞病变（CPE），而没有小的RNA细胞，但不在用miR-H6转染的细胞中并进行对照。感染的细胞通常显示簇，许多单独细胞仍未染成。在24小时P.I.，CPE显着增加，并且许多巨型多核细胞可以在模拟中看到，并且没有小的RNA细胞。然而，在用miR-H6转染的细胞中可以看到更少的CPE，包括多核巨细胞。

采用空斑实验检测MOI 0.1 HSV-1感染HCE细胞中的病毒数量，正常细胞不形成空斑，无小RNA的HSV-1导致大量空斑形成，与模拟相似。然而，miR-H6治疗显著降低了斑块的大小和数量(图)1 (b))差异有显著性（图1）1 (c)，)同时，在24小时时，在感染HSV-1的HCE中测定MOI为5、1和0.1的miR-H6 h p.i.结果表明，在HSV-1感染的HCE中，miR-H6显著增加，并且miR-H6的表达与感染病毒数量的浓度一致（图1）1 (d)，)。未感染的HCE细胞无miR-H6表达。

3.2.miR-H6抑制ICP4蛋白表达

首先,ICP4蛋白质表达是间接免疫荧光法观察到在12和24 h p。1型单纯疱疹病毒感染和12 h p。,有很弱的ICP4染色HCE细胞转染与模拟,没有商场RNA,少ICP4表达式指出与miR-H6 HCE细胞转染;在正常HCE对照细胞中未观察到ICP4(图)2(一个))。在24小时内，ICP4蛋白表达显著增加。与转染mock和未转染小RNA的细胞相比，转染miR-H6的HCE细胞中ICP4的免疫染色强度显著减弱(图)2（b）)。

miR-H6对ICP4蛋白的影响也通过使用ICP4抗体的Western blot检测（图2（c）).24岁 h p.i.，ICP4在转染miR-H6的HCE细胞裂解液中的表达降低，而在未经处理的小RNA细胞和模拟细胞中的表达保持不变（图2（d），)。同样，ICP4在正常HCE细胞中无表达。

3.3.miR-H6对IL-6释放的影响

ELISA检测培养基中IL-6蛋白的表达(图)3.)。6 h时，转染miR-H6的HCE细胞培养液中IL-6水平低于转染mock和未转染小RNA的HCE细胞培养液;然而，没有显著差异().12点 h p.i.，转染miR-H6的HCE细胞中的IL-6水平显著低于转染模拟或不转染小RNA的HCE细胞（图3（a），).24岁 h p.i.，与12小时时相比，转染模拟和未转染小RNA的HCE中的IL-6水平降低 h p.i.与模拟转染或仅HSV-1感染细胞相比，转染miR-H6的细胞培养基中的IL-6水平显著降低。后两种细胞的IL-6水平显著高于对照组()。

通过将HCE细胞中的IL-6水平进行测定，测定miR-H6对HCE细胞产生的IL-6产生的影响（图3（b），)。各时间点各组间IL-6无明显变化。

4.讨论

在HSV-1裂解感染期间，ICP4上调早期和晚期基因，通过与RNA聚合酶II相关的转录因子相互作用下调IE基因，抑制LAT启动子并阻止LAT产生[36，37]此外，ICP4是HSV-1 miR-H6的靶点[4]因此，我们开始这项研究的目的是观察miR-H6对HSV-1复制和HCE中炎性细胞因子IL-6产生的影响，HSV-1感染可导致角膜失明[21，38］.我们发现，在HCE和人视网膜色素上皮细胞中，miR-H6抑制ICP4蛋白的表达并抑制HSV-1产生感染(数据未显示)。Umbach等人也报道了类似的结果，他们发现miR-H6抑制了293T细胞中ICP4的表达，这些293T细胞共转染了合成的miR-H6双工中间体和表达野生型ICP4或ICP4突变体的质粒[4］.因为病毒miRNA调节依赖于感染的背景，例如细胞型和病毒基因组表达，所以我们专注于HSV-1感染的HCE，以研究MiR-H6作用对生产性感染。

在先前的研究中发现了HSV-1潜在感染中微小RORNA的高度丰富表达，这导致MicroRNA在建立和/或维持潜在感染方面发挥重要作用的概念[4，16，39］.然而,通过实验小鼠在感染急性和潜在的神经节和裂解性感染州立细胞感染了广式或LAT缺失突变体1型单纯疱疹病毒,克莱默等人发现,LAT缺失突变体建立和维护潜伏感染和得出结论,microrna并不是必不可少的延迟在小鼠三叉神经节,但可能有助于促进它[17］.Du和同事发现，在外植神经节中，病毒基因的表达是无序的，而不像在培养的受感染细胞中那样是按顺序排列的，病毒mrna的积累与mirna /LATs积累的减少同时发生，由病毒基因产物降解而不是这些mirna /LATs的短半衰期[40]然而，对HSV-1微RNA数量的研究表明，生产性感染中的miR-H6和miR-H1最丰富，而miR-H2、-H3和-H4在潜伏样本中大量表达[4，16，17]我们还发现，在HSV-1感染的HCE细胞中，miR-H6的表达随着病毒浓度的增加而增加。所有这些数据表明，HSV-1微RNA可能在病毒生命周期中具有阶段特异性功能，并且高度丰富的miR-H6水平可能在裂解感染中除维持潜伏感染外还有其他作用[17］.在我们目前的研究中，我们感兴趣的是miR-H6通过转染合成的miR-H6模拟物到HCE细胞并随后感染HSV-1来沉默ICP4。更多关于miR-H6的研究，如对其功能的干扰，以及对裂解感染中时间依赖效应的精确分析，将对我们了解病毒及其诱发的疾病有更大的影响。

HSV-1在角膜中的感染以反复的病毒溶解感染、免疫炎症、新生血管等为特征。IL-6作为一种重要的细胞因子，靶向多种细胞类型并诱导广泛的反应。这些反应通常简单地分为促炎性或抗炎性[41]结果表明，受IL-6调控的两条主要信号转导途径分别涉及gp130-YxxQ和Y759，分别是STAT3和SHP2/Gab/MAPK信号[42]以前的研究已经证实，IL-6在这些角膜病变中起着重要作用[38，43- - - - - -46］.此外，之前也有报道称HSV-1感染会影响IL-6。通过使用缺乏病毒转位蛋白VP16或任何ICP0、ICP4、ICP8或ICP27的HSV-1突变体，病毒感染的白细胞或小鼠上皮细胞系EMT-6显示出未改变的诱导IL-6的能力[29，30.］.因此，他们中的任何一个对IL-6生产不是必不可少的。It was reported recently that in Kaposi’s sarcoma-associated-herpes-virus-(KSHV-) infected cells, miR-1293, targeting viral IL-6 RNA, and miR-608, targeting human IL-6 ORF, can mechanistically compete with KSHV ORF57 protein, which binds RNA export factor (REF) at the same site and in a similar way to ICP27, and thus influence IL-6 production [47，48].虽然在目前的研究中，我们不知道HCE中是否存在miR-H6的靶序列，但我们没有发现miR-H6在没有HSV-1感染的HCE中抑制IL-6的释放。因此，miR-H6减少HSV-1感染的HCE细胞中IL-6的产生是由于通过抑制ICP4抑制病毒的产生，因为功能性的病毒诱导IL-6需要al基因组[29］.

我们的发现是，miR-H6模拟物可以抑制HCE细胞中产生HSV-1的感染以及伴随的IL-6释放。沉默病毒microRNA靶点作为一种新的抗病毒治疗，我们的结果可能意味着在角膜炎等病变组织中，使用miR-H6不仅可以抑制病毒复制，而且还可以减少IL-6引起的炎症生产

利益冲突

本文不存在商业利益冲突或任何其他利益冲突。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no. 20141201);基金资助:国家自然科学基金资助项目(81070765);10151008901000143)。

工具书类

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