1.介绍
单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是一种线性双链DNA病毒，主要感染上皮细胞和神经元细胞。HSV-1的生产性感染包括基因表达的级联(即早期、早期和晚期基因)、病毒DNA复制、组装和病毒出口。HSV-1的即早(IE)基因ICP4(感染细胞多肽4)是早期和晚期病毒基因有效转录所需的主要调控基因之一，并驱动HSV-1通过生产性复制周期[
1 ，
2 ］.ICP4也在潜伏期HSV-1的再激活中发挥作用。ICP4的调控似乎是由延迟相关转录本(LATs)在转录后水平发挥的[
3. ，
4 ］.抑制ICP4基因可抑制多种细胞内病毒的产生[
5 - - - - - -
8 ］.
MicroRNAs (miRNAs)是一种小型的、21~23个核苷酸的非编码rna，在从单细胞真核生物到多细胞真核生物的广泛生物体中通过各种机制在基因表达的转录后调控中发挥重要作用[
9 ］.病毒mirna的存在于2004年首次在eb病毒中被报道[
10 ］.microrna由病毒编码的发现表明,病毒已经进化到利用RNA沉默的监管自己的基因,宿主基因,或两者兼而有之,导致功能包括(I)潜伏性和溶解性病毒感染,(II)免疫逃避,(3)防止细胞凋亡(IV)病毒复制,和其他(V) (
11 - - - - - -
13 ］.对于HSV-1，第一个microRNA miR-H1在生产性感染中作为晚期基因表达已于2006年报道[
14 ］.此外，2009年首次报道人类脑细胞HSV-1感染诱导miRNA-146a介导炎症信号[
15 ］.到目前为止，已经发现16个HSV-1 miRNAs [
4 ，
12 ，
14 ，
16 ］.其中，miR-H1和miR-H6均位于LAT启动子的上游。miR-H1由LAT启动子上游LAT意义方向的序列编码，而miR-H6位于LAT反义方向[
16 ］.Umbach等首先发现miR-H6下调ICP4蛋白的表达，提示其有助于病毒潜伏期的建立和维持[
4 ］.同样，潜伏感染的特征是大量表达编码LAT的位点，它可以抑制神经元细胞系中的裂解复制和IE基因表达[
3. ］.然而，miR-H6和H1在培养细胞感染后2小时(p.i.)就被检测到，在产生HSV-1的感染样本中大量表达，而其他HSV-1 miRNAs(即miR-H2， -H3和-H4)在潜伏感染期间大量表达[
16 ，
17 ］.同时，在感染突变型HSV-2病毒并在LAT启动子和miR-H6之间插入序列的细胞中，miR-H6的表达显著降低[
18 ]，以及潜伏但非急性感染的带有HSV-1 LAT缺失突变体的小鼠神经节(dlLAT1.8) [
17 ］.这些结果提示，当miR-H6在溶菌感染中大量表达时，除了建立和维持潜伏感染外，它可能在病毒感染中发挥其他作用[
12 ，
17 ］.
作为人类的主要病原体，HSV-1可导致多种疾病，甚至可能危及生命[
19 ，
20. ］.HSV-1感染常见的眼部表现包括睑缘炎、结膜炎、角膜炎和葡萄膜炎;其中，复发性病毒性角膜炎可导致严重角膜失明[
2 ］.此外，角膜组织被认为是HSV-1可建立潜伏感染的部位[
2 ，
21 ，
22 ］.角膜上皮由基质前的几层细胞组成。因此，它被赋予了保护外来病毒入侵的重要作用。原发性角膜上皮细胞HSV-1感染通常表现为树突状病变。但是，hsv -1诱导的角膜炎也经常出现，因为炎症的免疫病理不是由大量病毒的溶解性感染直接产生的[
23 - - - - - -
26 ］.在这种情况下，细胞因子在病毒诱导的免疫病理中发挥重要作用。已知的一种促进HSV-1免疫反应的细胞因子是白细胞介素-6 (IL-6)，它是一种具有多种活性的细胞因子，包括促炎和抗炎活性[
27 ］.同时，HSV-1的LAT和ICP0启动子内存在IL-6响应元件，可能是IL-6诱导的转录因子的结合位点。LAT启动子中IL-6反应元件缺失的病毒结构体，比不缺失的类似结构体的重新激活率低得多[
28 ］.有报道称，HSV-1感染可诱导IL-6在多种细胞中产生，如白细胞[
29 ]、上皮细胞EMT-6和HaCat [
30. ，
31 ，以及角膜上皮细胞和成纤维细胞[
32 ］.
关于miR-H6在裂解感染中的丰富表达以及miR-H6编码序列(LAT启动子上游)的定位，我们想知道miR-H6在HSV-1感染中是否与其他mirna (miR-H2-miR-H5)有不同的功能。因此，我们研究了miR-H6靶向ICP4对HSV-1复制的影响，特别是对人角膜细胞中IL-6产生的影响。我们发现，miR-H6靶向ICP4可抑制HCE中HSV-1的复制，减少IL-6的产生，这可能为防止HSV-1溶解感染和抑制角膜炎症提供了一种途径。
2.材料和方法
2．1．细胞与病毒感染
本研究中使用的HCE来源于前面描述的人类角膜缘细胞[
33 ，
34 ］.细胞在含10%胎牛血清(FBS;人表皮生长因子(EGF;Sigma, St. Louis, MO)， 5
μ g/mL人转铁蛋白(Sigma)， 5
μ g/mL胰岛素，0.4
μ g/mL氢可的松(Gibco BRL, Grand Island, NY)。HEp-2细胞在含10%新生牛血清的DMEM/F12中生长(Gibco, NY, USA)。细胞在37℃5% CO中孵育2 -95%的空气孵化器。将HSV-1 (F毒株)的病毒株在HEp-2细胞上繁殖，并根据前面所述的方法测定病毒株效价[
35 ］.
使用前面描述的方法，HCE细胞被HSV-1感染[
5 ，
34 ］.简单地，将细胞培养到80 - 90%融合，然后用HSV-1感染1小时，每15分钟轻轻摇晃15秒，让病毒吸收。1 h后，去除接种物，用无血清DMED/高糖替代培养基。以5、1、0.1的感染倍数(multiplicity of infection, MOI)感染的细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次并收获。
2．2．HSV-1 miR-H6模拟物和转染
我们使用的miR-H6模拟物是双链的，由广州瑞博生物有限公司(广州，中国)根据成熟的miR-H6 (5 ' -CACUUCCCGUCCUUCCAUCCC-3 ')化学合成。假RNA是一种小RNA，它不以任何已知基因为目标，作为阴性对照。将HCE细胞培养至70-80%融合，然后根据制造商的说明，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)转染miR-H6(50或100 nM)和mock。转染24 h后，在MOI 0.1时用HSV-1感染细胞。在指定的时间，收集细胞和培养基，以作进一步的实验。
2．3.斑块化验
空斑实验如前所述进行，但进行了修改[
5 ］.HCE细胞在12孔板中生长至70 - 80%汇合，然后转染miR-H6模拟物并如上所述感染HSV-1。在吸收HSV-1 1小时后，细胞被1ml的1:1低熔点琼脂糖(NuSieve GTG琼脂糖，美国)和2 × DMEM/高糖的混合物覆盖，只允许病毒在细胞间传播。每小时48小时，仔细取出琼脂糖，用结晶紫染色20分钟，然后拍照。最后，测量斑块大小。
２.４.实时聚合酶链反应分析
将HCE细胞培养至80 ~ 90%汇合，然后以5、1和0.1的多重感染(multiplicity infection, MOI)感染HSV-1。在每小时24小时，用PBS洗涤细胞三次并收获细胞。根据生产说明书，用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)分离细胞总RNA。随后，使用All-in-One miRNA Q-PCR检测试剂盒(FulenGen, Guangzhou, China)检测RNA样本。miR-H6 5 '引物为CACTTCCCGTCCTTCCATCCCA(产品大小为74)，homo snRNA U6 5 '引物为CAAATTCGTGAAGCGTTCCATAT(产品大小为79)。通过iQ5 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)，反应条件为95°C for 10 min, 95°C for 10 s, 65°C for 20 s, 72°C for 10 s and 72°C for 5 min，共38个循环。用iQ软件计算同一样本中各mRNA相对于U6 mRNA的量。每次运行都完成了熔化曲线分析，以确认扩增的特异性。
2．5．间接免疫荧光法
在每小时12和24小时，根据前面描述的方法，使用载玻片固定的细胞进行间接免疫荧光分析[
5 ］.细胞与识别HSV-1 ICP4的小鼠抗人单克隆抗体(Abcam, Cambridge, UK)在4°C孵育过夜。然后用tritc标记的山羊抗小鼠IgG抗体(中国北京中山金桥)在37℃下孵育细胞1小时。用hoechst染色10分钟。然后使用共聚焦激光扫描显微镜(卡尔蔡司，耶拿，德国)观察细胞。用PBS(而不是第一抗体)孵育的细胞作为阴性对照。
2．6．免疫印迹分析
每小时24小时，用裂解液缓冲液(20 nM三盐酸)裂解细胞。冻融3次，4℃，12,000 rpm离心30分钟，去除细胞碎片。以牛血清白蛋白为标准，采用双喹啉酸法测定上清液中的蛋白质含量。按照我们之前的方法进行Western blot [
5 ］.用1
μ g/mL识别HSV-1 ICP4的小鼠抗人单克隆抗体(Abcam, Cambridge, UK)或0.2
μ g/mL小鼠抗gapdh(康辰，中国)，4℃过夜。然后，将山羊抗小鼠IgG二抗(中国北京中山金桥)暴露1 h。使用化学发光Phototope (R)-HRP Western Blot检测系统(Cell Signaling Technology, Inc.， Danvers, MA, USA)对蛋白条带进行可视化，并通过柯达成像站4000MM (Kodak, Rochester, NY, USA)进行曝光。
2.7。酶样免疫吸附试验(ELISA)
用miR-H6和mock转染HCE细胞，然后如上所述感染HSV-1，或者直接培养转染后的细胞不感染病毒。在转染6、12和24小时，或转染后30、36和48小时收集培养液，对未感染HSV-1的细胞，使用特异性IL-6 ELISA试剂盒(Boster, Wuhan, China)检测上清中的IL-6水平。根据制造商的说明，使用人IL-6构建标准曲线。
2.8。统计分析
所有实验均至少重复3次，定量数据以均数±SD表示。采用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析
P
<
0．05
被认为具有统计显著性。
3.结果
3．1.miR-H6对细胞和病毒复制的影响
如上所述，在MOI 0.1转染HCE细胞并感染HSV-1，在相差显微镜下观察6、12和24 h的细胞形态变化(图)
1(一) )．在6小时内，转染了miR-H6的细胞、不含小RNA的mock细胞和对照组细胞之间的细胞形态没有明显差异(数据未显示)。12 h时，miR-H6转染组和对照组均能观察到细胞病变效应(CPE)，而miR-H6转染组和对照组均不能观察到CPE。被感染的细胞通常呈簇状，许多单个细胞未被感染。每小时24小时，CPE显著增加，模拟细胞中可见许多巨大的多核细胞，但没有小RNA细胞。然而，在转染miR-H6的细胞中，包括多核巨细胞中，可看到较少的CPE。
miR-H6对hsv -1感染HCE细胞的细胞变化和病毒复制的影响。在HCE细胞中转染miR-H6模拟物和mock，然后在转染24 h后感染HSV-1的MOI 0.1。(a)分别在感染后12 h和24 h拍摄细胞形态学变化。CPE明显升高，经模拟RNA处理的细胞和未经小RNA处理的细胞中可见大量多核巨细胞;转染miR-H6模拟物的细胞中CPE和巨多核细胞较少。(b, c)斑块检测显示，miR-H6处理后斑块大小和数量减少，差异有统计学意义(
P
<
0．05
)．用miR-H6模拟物(0,50,100 nM)和模拟RNA (mock)或不使用小RNA (HSV-1)处理细胞。对照组(Ctl)由未感染病毒的细胞和经小RNA处理的细胞组成。(d) Real-time PCR检测hsv -1感染的HCE细胞中miR-H6的表达，并以病毒滴度依赖的方式改变miR-H6水平(
P
<
0
．
0
1
＊
，单因素方差分析，MOI 0.1, 1, 5)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
采用空斑实验检测MOI 0.1 HSV-1感染HCE细胞中的病毒数量，正常细胞不形成空斑，无小RNA的HSV-1导致大量空斑形成，与模拟相似。然而，miR-H6治疗显著降低了斑块的大小和数量(图)
1 (b) )，有显著差异(图
1 (c) ，
P
<
0．05
)．同时，采用MOI 5、1、0.1检测hsv -1感染的HCE中miR-H6在24 h p.i时的表达，结果显示hsv -1感染的HCE中miR-H6显著升高，且miR-H6的表达与感染病毒的浓度一致(图)
1 (d) ，
P
<
0
．
01
)．未感染的HCE细胞无miR-H6表达。
3．2.miR-H6抑制ICP4蛋白表达
首先,ICP4蛋白质表达是间接免疫荧光法观察到在12和24 h p。1型单纯疱疹病毒感染和12 h p。,有很弱的ICP4染色HCE细胞转染与模拟,没有商场RNA,少ICP4表达式指出与miR-H6 HCE细胞转染;在正常HCE对照细胞中未观察到ICP4(图)
2(一个) )．在24小时内，ICP4蛋白表达显著增加。与转染mock和未转染小RNA的细胞相比，转染miR-H6的HCE细胞中ICP4的免疫染色强度显著减弱(图)
2 (b) )．
在hsv -1感染的HCE细胞中，miR-H6降低ICP4蛋白表达。用miR-H6模拟物和模拟RNA转染HCE细胞，转染24 h后用HSV-1的MOI 0.1感染HCE细胞。在12小时内(a)和24小时内(b) HCE细胞中ICP4蛋白染色。TRITC标记抗体染色的ICP4(红色，左)和hoechst染色的细胞核(蓝色，中)。ICP4与细胞核合并(右)，比例尺:20
μ m. (c) Western blot检测ICP4条带。(d)定量分析(c)中的条带。在转染miR-H6的HCE细胞中，ICP4水平显著降低(
P
<
0．05
＊
， miR-H6与模拟或单纯HSV-1)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
使用抗ICP4抗体，Western blot检测miR-H6对ICP4蛋白的影响(图)
2 (c) )．在24小时内，在转染miR-H6的HCE细胞裂解液中ICP4的表达降低，而在未处理的小RNA细胞和模拟细胞中ICP4的表达保持不变(图)
2 (d) ，
P
<
0
．
05
)．同样，ICP4在正常HCE细胞中无表达。
3．3.miR-H6对IL-6释放的影响
ELISA检测培养基中IL-6蛋白的表达(图)
3. )．6 h时，转染miR-H6的HCE细胞培养液中IL-6水平低于转染mock和未转染小RNA的HCE细胞培养液;然而，没有显著差异(
P
>
0．05
)．在12小时内，转染miR-H6的HCE细胞的IL-6水平显著低于转染mock或未转染小RNA的HCE细胞(图)
3(一个) ，
P
<
0．01
)．在24 h p。,HCE的il - 6水平与模拟,没有小RNA转染下降相比在12 h p。细胞转染的il - 6水平介质miR-H6相比略低的水平模拟或者只有HSV-1-infected转染细胞。与对照组相比，后两者的水平明显更高(
P
<
0．05
)．
miR-H6对培养基中IL-6释放的影响。用miR-H6转染HCE细胞，并在转染后24小时(a)或未感染病毒(b)后感染HSV-1的MOI 0.1。*转染miR-H6模拟物的HCE细胞与单独转染miR-H6模拟物或单纯转染HSV-1的HCE细胞的统计学差异(
P
<
0．01
)；+/++ 正常HCE细胞与单纯模拟或单纯HSV-1细胞的统计学差异(
P
<
0．05
+
；
P
<
0．01
+
+
)．
(一)
![]()
(b)
![]()
通过比较转染了miR-H6的HCE细胞、模拟细胞和正常细胞的IL-6水平，来检测miR-H6对HCE细胞产生IL-6的影响(图)
3 (b) ，
P
>
0
．
05
)．各时间点各组间IL-6无明显变化。
4.讨论
在HSV-1裂解感染过程中，ICP4上调早期和晚期基因，通过与RNA聚合酶II相关转录因子的相互作用下调IE基因，抑制LAT启动子，阻止LAT的产生[
36 ，
37 ］.ICP4是HSV-1 miR-H6的靶点[
4 ］.因此，我们开始本研究的目的是观察miR-H6对HCE中HSV-1复制和炎症细胞因子IL-6产生的影响，HSV-1感染可导致角膜失明[
21 ，
38 ］.我们发现，在HCE和人视网膜色素上皮细胞中，miR-H6抑制ICP4蛋白的表达并抑制HSV-1产生感染(数据未显示)。Umbach等人也报道了类似的结果，他们发现miR-H6抑制了293T细胞中ICP4的表达，这些293T细胞共转染了合成的miR-H6双工中间体和表达野生型ICP4或ICP4突变体的质粒[
4 ］.由于病毒miRNA的调控依赖于感染的环境，如细胞类型和病毒基因组表达，我们聚焦于hsv -1感染的HCE，以研究miR-H6在生产感染中的作用。
以往的研究发现，microRNA在HSV-1潜伏感染中表达高度丰富，这导致了microRNA在建立和/或维持潜伏感染中发挥重要作用的概念[
4 ，
16 ，
39 ］.然而,通过实验小鼠在感染急性和潜在的神经节和裂解性感染州立细胞感染了广式或LAT缺失突变体1型单纯疱疹病毒,克莱默等人发现,LAT缺失突变体建立和维护潜伏感染和得出结论,microrna并不是必不可少的延迟在小鼠三叉神经节,但可能有助于促进它[
17 ］.Du和同事发现，在外植神经节中，病毒基因的表达是无序的，而不像在培养的受感染细胞中那样是按顺序排列的，病毒mrna的积累与mirna /LATs积累的减少同时发生，由病毒基因产物降解而不是这些mirna /LATs的短半衰期[
40 ］.然而，对HSV-1 mirrorna数量的研究表明，在生产性感染中miR-H6和miR-H1最丰富，而miR-H2、-H3和-H4在潜伏样本中大量表达[
4 ，
16 ，
17 ］.我们还发现，在hsv -1感染的HCE细胞中，miR-H6的表达随着病毒浓度的增加而增加。所有这些数据表明HSV-1 microrna可能在病毒生命周期中具有阶段特异性的功能，并且高水平的miR-H6可能在溶解感染中具有除维持潜伏感染之外的其他作用[
17 ］.在我们目前的研究中，我们感兴趣的是miR-H6通过转染合成的miR-H6模拟物到HCE细胞并随后感染HSV-1来沉默ICP4。更多关于miR-H6的研究，如对其功能的干扰，以及对裂解感染中时间依赖效应的精确分析，将对我们了解病毒及其诱发的疾病有更大的影响。
角膜HSV-1感染表现为反复的病毒溶解性感染、免疫炎症、新生血管等。IL-6作为一种重要的细胞因子，靶向多种细胞类型并诱导一系列广泛的反应。这些反应通常被简单地分为促炎反应和抗炎反应[
41 ］.研究表明，IL-6调控的信号转导途径主要有两个:STAT3和SHP2/Gab/MAPK信号，分别涉及gp130 YxxQ和Y759动机[
42 ］.IL-6在这些角膜病变中起重要作用，已有研究证实[
38 ，
43 - - - - - -
46 ］.此外，之前也有报道称HSV-1感染会影响IL-6。通过使用缺乏病毒转位蛋白VP16或任何ICP0、ICP4、ICP8或ICP27的HSV-1突变体，病毒感染的白细胞或小鼠上皮细胞系EMT-6显示出未改变的诱导IL-6的能力[
29 ，
30. ］.因此，它们中的任何一个单独对IL-6的产生都不是必需的。近日有报道称,在卡波济氏sarcoma-associated-herpes-virus——(KSHV -)感染细胞,mir - 1293,针对病毒RNA, il - 6和mir - 608,针对人类白介素ORF,可以从力学上看与KSHV ORF57蛋白质、RNA结合出口因素(REF)在同一站点和ICP27以类似的方式,从而影响il - 6生产(
47 ，
48 ］.虽然在本研究中我们不知道HCE中是否存在miR-H6的靶序列，但我们没有发现miR-H6在没有HSV-1感染的HCE中抑制IL-6的释放。因此，miR-H6在hsv -1感染的HCE细胞中降低IL-6的产生是由于通过抑制ICP4抑制病毒的产生，因为诱导IL-6需要一个功能病毒基因组[
29 ］.
我们的研究发现，miR-H6模拟物可以抑制HCE细胞中产生HSV-1的感染以及伴随的IL-6的释放。沉默病毒microRNA靶点作为一种新的抗病毒治疗方法，我们的结果可能意味着，在角膜炎等病变组织中，使用miR-H6不仅可以抑制病毒复制，而且由于IL-6的产生，也可以减少炎症。