文摘

白血病细胞过表达免疫原性抗原,所谓leukemia-associated抗原如透明质酸受体acid-mediated运动性(RHAMM)。持久RHAMM表达式和CD8降低⁺框架的t细胞反应RHAMM同种异体干细胞移植或单独化疗可能表明白血病细胞的免疫逃逸。在目前的研究中,我们分析了RHAMM的表达在48患有急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)。此外,我们与疾病的临床过程相关记录之前和之后的治疗。实时定量逆转录酶聚合酶链反应进行外周血单核细胞的RNA。针对RHAMM T细胞反应是评估四聚物染色(流式细胞术)和酶联immunospot有关酶联免疫斑点)(化验。结果与病人的临床结果。本研究的结果显示,近60%的患者RHAMM积极;特定的t细胞识别RHAMM可以被探测到,但他们非功能性的干扰素γ或granzyme B释放有关酶联免疫斑点试验证明了。免疫疗法如肽疫苗接种或RHAMM-specific T细胞过继转移可能提高免疫反应和AML / MDS患者的结果。

1。介绍

大约有80%的急性髓系白血病(AML)患者达到完全缓解(CR)化疗后。然而,一半的患者CR复发和只有25%的AML患者存活超过五年。因此,有一个强烈的需要等新的治疗方法来治疗白血病免疫治疗方法。白血病细胞过表达的蛋白质发挥重要作用在生存和增殖的细胞。这些蛋白质指定leukemia-associated抗原(LAAs)。LAAs包括大范围的蛋白质包括hyaluronic-acid-mediated能动性的受体(RHAMM) [1]。CD8⁺AML患者的t细胞反应对RHAMM已确定(2]。尽管如此,这仍有待阐明为什么免疫原性LAAs表达但不充分认可,以及为什么LAA⁺恶性肿瘤细胞不受通过特定CD8细胞溶解⁺T细胞。免疫逃避LAAs或差别可能成为有效的通过对这些阻碍本征函数的T细胞(3]。只有有限的信息可以在LAAs化疗前后的表达和/或同种异体干细胞移植(allo-SCT)。因此我们在这里调查RHAMM的表达以及RHAMM-specific CD8的频率⁺化疗前后T淋巴细胞/ allo-SCT。作为一个未来的角度来看,而可怜的RHAMM的免疫反应可能是通过增强免疫治疗方法,如肽疫苗接种和过继转移背景下特定的t细胞反应的化疗和allo-SCT [1]。

2。材料和方法

2.1。血液样本病人和健康的捐赠者

我们收集了173的外周血样本48从AML / MDS病人在获得病人的知情同意。本研究经当地伦理委员会批准。串行外围收集血液样本在诊断、化疗后和/或与免疫抑制allo-SCT之后,在CR或维持治疗随访期间连续时间间隔和复发。外周血单核细胞(PBMC)和骨髓单核细胞(BMMC)样本准备使用聚蔗糖Biocoll分离解决方案(Biochrom,柏林,德国)和低温贮藏根据标准协议。PBMC样本来自10个健康的捐赠者和作为消极的控制。

2.2。实时定量逆转录酶聚合酶链反应(RQ-RT-PCR)

RNA被隔离的最低2×10⁶细胞使用RNeasy + minikit(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)。五百毫微克相对地转录成RNA的cDNA使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(BioRad,慕尼黑,德国)。逆转录(RT)与70年产品稀释μL水分子生物学(Sigma-Aldrich)。九微升每口井的使用。引物和探针(TaqMan基因表达分析、表达载体)稀释TaqMan 2 xpcr大师混合根据制造商的指示。RHAMM的标准曲线,建立了机载激光器的使用四个稀释步骤/ rt - pcr基因。副本人数计算http://www.endmemo.com/。反应是在7900年重复使用ABI棱镜测试序列检测系统(应用生物系统公司)和标准条件20 40周期的放大μL的体积。

2.3。混合淋巴细胞肽文化(MLPC)

MLPC执行所述其他地方(4]。简单地说,具体CD8⁺T细胞选择从PBMCs和BMMCs magnetic-activated细胞排序(MACS)列(Miltenyi)。CD8⁻分数与30 Gy辐照和加载测试或控制肽(20μg / mL)单独或与培养基培养(无肽)。RHAMM的肽序列和控制来自磷蛋白质肽- 65的巨细胞病毒(CMVpp65)和流感基质蛋白(IMP) ILSLELMKL, NLVPMVATV和GILGFVFTL分别。CD8⁺和CD8⁻细胞被cocultured比1:4。MLPC补充了10 U /毫升(西格玛奥德里奇)和20 - 2 ng / mL IL-7 (Miltenyi) 1天。细胞毒性T淋巴细胞(ctl)收获七天为酶联immunospot有关酶联免疫斑点)(试验和/或当足够数量的CD8流式细胞术分析⁺细胞被收集。

2.4。Mini-MLPC

MLPC方法被修改成mini-MLPC, CD8的数量不足⁺从mac分离获得的细胞。Mini-MLPCs进行在圆底96 -微量滴定板在rpmi - 1640和10% heat-inactivated人类AB血清培养基补充,10 U - 2 /毫升,20 ng / mL IL-7。比率维持在MLPC (1×10⁴CD8⁺和4×10⁴CD8⁻细胞,1:4)。每口井的细胞的数量是基于工作Distler et al。5]。扩散在mini-MLPCs在传统MLPCs与扩散。

2.5。ELISPOT干扰素(IFN -)和Granzyme B

干扰素-有关酶联免疫斑点试验和granzyme B进行描述的其他地方(4)确定的特定识别RHAMM peptide-positive靶细胞根据制造商的指示(美国圣地亚哥BD)。

2.6。流式细胞术分析

RHAMM-specific T细胞的频率是由流式细胞术。如前所述(执行四聚物染色2]。简单地说,淋巴细胞与RHAMM-specific四聚体染色,随后与共轭CD3抗体和CD8 (BD生物科学)。异硫氰酸荧光素(FITC) peridinin-chlorophyll蛋白质(PerCP)和藻红蛋白(PE)被用作荧光染料。至少2×10⁴细胞被收购了。流式细胞术进行了石中剑血细胞计数器(BD生物科学)。拨款同形像控制被包含在每一个实验。数据分析使用流式细胞仪分析软件FlowJo(美国树星公司)。四聚物CD8的频率⁺T细胞被认为是积极的,如果比CD8的频率2倍或更高⁺细胞与四聚物复染色识别一个无关紧要的肽。

2.7。病人的临床状态

患者的临床状态从临床数据获得的内科三世,罗斯托克大学。临床特征的病人如嵌合现象分析,细胞遗传学,HLA,巨细胞病毒状态,和治疗进行评估的内科三世,罗斯托克大学。FLT3状态评估的血液学/肿瘤学格赖夫斯瓦尔德大学,德国格赖夫斯瓦尔德。AML病例分类按照工厂标准及在细胞遗传学特点。CR是根据标准定义的标准。

2.8。统计分析

统计分析使用统计图形+ 5。标准Wilcoxon符号秩检验被用于非参数的比较RHAMM的表达式中值治疗前后,随着数据配对,而不是正态分布。Mann-WhitneyU -测试是用于非参数表达RHAMM的中值的比较健康的捐赠者和病人。统计显著性被认为是如果值< 0.05。

3所示。结果

3.1。病人的特点

我们筛选48 AML / MDS患者的前瞻性研究。21岁患者接受allo-SCT,而27只收到了化疗在传统的协议。我们组的患者保持几乎比1:1之间的男性()和女性患者()。正常核型中发现了19个病人,和17个病人异常核型,复杂核型在七个病人。五个病人的核型是不可访问的。没有年龄的男性和女性之间的显著差异()在诊断时。患者平均随访时间为272天(中位数:225天)。九个病人死于白血病,和三个病人的疾病与白血病,也就是说,脑炎、肺炎、移植物抗宿主病。

3.2。表达RHAMM的记录之前和之后的治疗

的表达RHAMM在健康的捐赠者外周血()很低(中位数:318;范围97 - 730RHAMM拷贝/ 10⁴ABL副本)。与此形成鲜明对比的是RHAMM记录在患者明显高于治疗前(中位数:768;范围:184 - 160;)。为了比较不同治疗方法,病人诊断被分成了两组:化疗后的病人和病人allo-SCT后(图1)。外周血收集22个AML患者在诊断时。13名患者RHAMM阳性(59%),而九负(41%)。的表达RHAMM被认为是积极的时候高于外周血的最高价值衡量健康的捐赠者。没有显著差异的表达RHAMM在治疗前患者的外周血根据- itd状态(积极的和消极的,)、性别(),或者核型(正常和异常,;正常的和复杂的,;异常和复杂,)。

此外,我们旨在确定的表达RHAMM化疗前后单独或allo-SCT。因此我们测量绝对副本数量的这种基因在AML / MDS-diagnosed病人。治疗前后无显著差异,无论是通过化疗()或allo-SCT ()。然而,我们观察到更高的数字记录在CR的病人接受allo-SCT相比,那些接受化疗()。此外,RHAMM也同样表达了之前和之后allo-SCT在CR患者群。这组还显示更高的副本数量的吗RHAMM移植后相比,接受化疗的集团(,图1)。

3.3。RHAMM-Specific ctl在健康献血者

RHAMM-specific T细胞中观察到的三个十个健康的捐赠者,也就是说,155年高清HD 663和HD 005,在低频率(0.11%、0.33%和0.12%,分别地。)与CD3细胞⁺CD8⁺门组100%(图2 (g)控制数据2 (c)- - - - - -2 (f))。此外,这些RHAMM-specific ctl的活动中发现两个健康的捐赠者(HD 155和669年)至于干扰素-分泌有关酶联免疫斑点分析评估(图2(一个))。ctl从669年健康的捐赠者没有足够的数量来进行流式细胞术分析。

3.4。RHAMM-Specific ctl的病人

RHAMM-specific CD8的纵向研究⁺T细胞可能只有十个病人样本中RHAMM(29/48例)和hla a2是积极的,因为所有肽用于本研究hla a2限制。RHAMM-specific CD8的频率⁺外周血中T细胞通过流式细胞仪测定过程中疾病。此外他们杀死RHAMM激活状态和潜力⁺恶性肿瘤细胞被分泌的干扰素-评估γ分别和granzyme B。作为显示在图3 (c),RHAMM-specific ctl的频率检测所有CD8多达5.62%的1.24%⁺T细胞,0.03%到1.14%的细胞淋巴细胞。有关酶联免疫斑点试验在CD8的一般活动⁺T细胞(图3(一个)和3 (b))检测在诊断时(Dx)和CR。30天前allo-SCT RHAMM-R3-stimulated CD8释放granzyme B走强⁺如果T细胞检测T细胞比。allo-SCT一般沉默的T细胞后释放的干扰素-γ并且granzyme B(检测到数据3(一个)和3 (b))。依照这些发现流式细胞仪分析显示,RHAMM-tetramer的数量⁺CD8⁺在时间T细胞消失。

在另一个AML患者(图4),RHAMM-specific CD8⁺T细胞通过流式细胞仪检测到的当然RHAMM-specific CD8的构成不同的族群⁺T细胞(图4 (f)和4 (j)),证明了许多消极的控制(数字4 (c)- - - - - -4 (e)和4 (g)- - - - - -4(我)包括RHAMM-tetramer彩色CD8)⁺细胞被任何肽(数字不刺激4 (e)和4(我))。有趣的是我们发现CD8的一般激活⁺病人的T细胞复发的时候没有区别的阴燃和进步的疾病(数字4(一)和4 (b))。这可能是由于高浓度RHAMM的恶性细胞增殖刺激特定的t细胞反应。

在第三个AML患者抗原CD8⁺T细胞在外周血中检测到(PB)和骨髓(BM)释放干扰素-γ有关酶联免疫斑点化验和granzyme B(图5)。RHAMM-specific CD8⁺T细胞能够释放干扰素-γ和granzyme B当病人从疾病复发。这种RHAMM-specific ctl反应消失与DNA-methyltransferase抑制剂治疗后,阿扎胞苷,特别是与氟达拉滨后allo-SCT调节方案后,amsacrine,阿糖胞苷(FLAMSA) [6]。

4所示。讨论

在这个工作我们评估RHAMM的表达在48 AML / MDS患者解除痛苦。我们调查RHAMM在RNA的表达水平在患者治疗前后使用RQ-RT-PCR。此外,我们评估这个抗原特异性ctl的频率。这些分子和免疫参数与病人的临床状态。

RHAMM是首先描述为可溶性结合蛋白(7]。参与运动性、粘附、增殖、迁移和血管生成8- - - - - -11]。RHAMM也是至关重要的转换、转移入侵,成长,和修改的RAS信号级联12- - - - - -16]。多种形式RHAMM的过表达在多种实体肿瘤如子宫内膜癌(17],乳腺癌[18[],胰腺癌19),胃癌20.),肺鳞状细胞癌(21),恶性黑色素瘤(22),以及血液恶性肿瘤如AML, MDS, B-CLL,多发性骨髓瘤23,24]。百分之七十的AML患者中RHAMM mRNA和蛋白水平(24,25]。RHAMM mRNA和蛋白的过度表达与贫穷相关结果和增加外围转移乳腺癌患者(26]。最近,RHAMM的表达被报道AML的惨淡的预后因素(27]。RHAMM被确认为的一个最有前途的LAAs AML [2,24]。指定的九聚物ILSLELMKL (R3), 165 - 173,是最具免疫原性抗原决定基(4),就可以自然地处理和HLA-A2-restricted地。RHAMM-R3引发白血病患者的体液免疫和细胞反应而不是健康的捐赠者或自身免疫性疾病患者2,24,25]。此外,RHAMM-specific ctl能够溶解自体RHAMM⁺爆炸(4,28]。临床免疫接种的AML, MDS,毫米,慢性淋巴细胞白血病患者RHAMM-R3肽引起特定的免疫和血液反应。功能活跃RHAMM-R3-specific ctl被四聚物染色发现70%的患者(2,29日,30.]。与RHAMM-R3肽疫苗接种是安全的和有效的。

我们旨在确定RHAMM的表达式和特异性T细胞的自发存在反抗这LAA AML / MDS患者前后allo-SCT和/或常规化疗。

人们很少知道预后RHAMM及其互动合作伙伴在白血病中的作用。Tzankov et al。27]分析了RHAMM表达蛋白质水平的有一大群人的骨髓活检AML患者。他们发现28%的患者RHAMM积极和RHAMM可能是一个不错的预后因子的蛋白质水平。但是,没有系统的研究已经完成调查RHAMM的作用作为一种预后因子在RNA水平。到我们所知这是第一个使用RQ-RT-PCR测量报告RHAMM成绩单和确定allo-SCT前后免疫t细胞反应。在目前的研究中,我们建立了一个健壮的程序来量化绝对数量的副本RHAMM使用RQ-RT-PCR。的表达RHAMM没有明显不同的对吗- itd状态、染色体组型和性别的患者。在目前的研究中,59%的新创AML患者RHAMM表示。这一发现与工作由我们小组一致(31日]。早在我们的系列中,70%(35/50)的AML患者阳性RHAMM由传统的rt - pcr (31日]。有趣的是,有些病人在当下研究当时RHAMM -诊断在临床CR RHAMM阳性表达。这可能是由于造血重建RHAMM可能也表达了在干细胞早期文化像其他LAA WT1 (32]。另一个可能的解释是爆炸在病人的骨髓激增,因此过表达RHAMM。这也提供了一个解释越高数量的副本RHAMM收到allo-SCT和达到CR患者在治疗的病人相比常规化疗。

我们假设LAAs-specific T细胞的存在可能至少部分参与维护病人的CR。功能性RHAMM-specific ctl有关酶联免疫斑点在AML患者(检测到数据3和5)。然而,这人口逐渐消失在他们收到化疗后患者的外周血。可能下调化疗对T细胞的影响已报告之前(6,33,34]。有趣的频率RHAMM-specific T细胞在骨髓中增加这可能表明这些细胞贩运到骨髓(35]。

有关酶联免疫斑点试验的一些我们观察到的一般激活ctl(数字3(一个),3 (b),4(一),4 (b)),可能至少部分由于炎症细胞因子环境由病毒感染引起的。

总之,RHAMM成绩单是朦胧地表达了化疗和allo-SCT之前和之后。尽管如此,一个清晰的高表达RHAMM在那些受到allo-SCT CR患者。此外,我们能够检测RHAMM-specific CD8⁺t细胞的反应在两种健康的捐赠者和AML / MDS患者RHAMM的过度。化疗后,allo-SCT RHAMM-specific CD8⁺分泌干扰素- t细胞亚群失去了它的属性γ或granzyme B,最终消失了。因此这个族群的刺激RHAMM-R3肽疫苗接种或RHAMM-specific CD8的过继转移⁺T细胞可能重新安装后化疗和allo-SCT antileukemic效果。

确认

这项工作是支持格兰特r . Casalegno-Garduno国家科学技术委员会(CONACyT),墨西哥,以及慷慨的助学金R09/14和R10/03德国卡雷拉斯白血病基金会m·施密特。