在胰腺癌细胞因子诱导的杀伤细胞的治疗效果与k - ras基因突变肽增强树突状细胞脉冲

文摘

客观的。本研究旨在探讨cik的角色与K-ras-DCs cocultured胰腺癌细胞株,PANC-1 (k⁺)和SW1990 (k⁻)。方法。cik诱导干扰素-γ2,anti-CD3 monoantibody, K-ras-DCCIKs k-ras-DCs和cik共培养获得的。表面标记通过流式细胞仪检测。干扰素-γ白介素、CCL19 CCL22 ELISA检测。通过3 h-tdr扩散各种cik测试。杀死125 iudr k-ras-DCCIKs和ctl检查活动。结果。CD3⁺CD56⁺和CD3⁺CD8⁺被K-ras-DCCIKs高度表达。在其上层清液,干扰素-γ、il - 12和CCL19 CCL22明显高于DCCIK CIK。杀害K-ras-DCCIK率大于CIK和CTL。引起的CTL K-ras-DCs只有抑制PANC-1细胞。结论。k-ras-DC能增强CIK的扩散和增加造成对胰腺癌细胞的影响。K-ras-DC只能抑制PANC-1诱导的ctl细胞。在这项研究中,K-ras-DCCIKs也显示特定的抑制PANC-1细胞,其肿瘤抑制与ctl几乎是相同的,其总肿瘤抑制效率高于ctl。

1。介绍

胰腺癌的发病率有明显上升趋势(1,近20年来预后尚未改善(2]。目前免疫疗法对于胰腺癌主要包括活动特定的免疫疗法,单克隆antibody-directed治疗、细胞因子治疗,过继性细胞免疫治疗(3]。本研究的目的是调查的作用细胞因子诱导的杀伤细胞(cik) cocultured k - ras基因与树突状细胞(dc)和脉冲(12-Val)突变肽在胰腺癌细胞株的杀戮,PANC-1 SW1990,体内和体外。

树突状细胞(DC)是一种抗原呈递细胞,在体内的功能是最强的。他们发挥桥梁作用,主在肿瘤细胞和T淋巴细胞之间的相互作用4]。细胞因子诱导的杀伤细胞干扰素-γ和和anti-CD3 - 2单克隆抗体(细胞因子诱导的杀伤,CIK) non-MHC-restrictive细胞毒性T淋巴细胞,能够杀死肿瘤细胞通过识别一系列相关配体的表达在肿瘤表面(5,6]。到目前为止,这些细胞被认为是最快的扩散,肿瘤细胞毒性最强的,最广泛的肿瘤死亡。因此,他们是肿瘤的过继免疫治疗的首选7]。与k - CIK共培养和直流脉冲(12-Val)蛋白肽,它包含一个特定的突变的网站,可以增加抗原特异CTL子集的存在和DC-induced特异性CTL的活动。与此同时,加强CIK细胞增殖可以进一步将提高抗肿瘤免疫治疗的范围和影响。到目前为止,研究k - ras基因的协同治疗胰腺癌antigen-allergized直流和CIK尚未报道。

2。材料和方法

2.1。材料

rhIL-2和gm - csf是购自研发有限公司(美国)。il - 4、TNF-4和干扰素-γ从Peprotech被收购公司. .胎牛血清(的边后卫)和细胞中RPMI1640来自Sigma-Aldrich有限公司有限公司(美国)。淋巴细胞分离中聚蔗糖和正常的人类AB血清买来TBD Inc .(天津)。鼠标反CD3 (FITC标记)单克隆抗体,鼠标反CD56 (PE标签)单克隆抗体,鼠标反CD8 (PE标签)单克隆抗体,和鼠标反CD3单克隆抗体(未标记的)都是从eBioscience有限公司买鼠标反CD80-PE单克隆抗体,鼠标反CD83-PE单克隆抗体,鼠标反CD86-PE单克隆抗体,鼠标反CD40-FITC单克隆抗体,和鼠标反CD1a-FITC Immunotech单克隆抗体都是产品有限公司有限公司(法国)。CCL19和CCL22 ELISA试剂盒来自ADL Inc . .鼠标反Fascin-1单克隆抗体和山羊anti-mouse免疫球蛋白二次抗体来自圣克鲁兹有限公司有限公司细胞菌株,从写明ATCC PANC-1 SW1990,可用。k - ras基因突变型表位肽KLVVVGAVGVGKSALTC被SBS基因合成。有限公司. .女性裸体小鼠(BALB / c, 5 - 8周的年龄)提高防晒系数情况下是购自上海实验动物中心,中国科学院。

2.2。制备的DCs和ctl

外周血的50毫升无菌收集从一个健康的成年志愿者。外周血单核细胞(PBMCs)然后通过淋巴细胞分离介质,用RPMI1640洗两次,然后稀释/毫升RPMI1640含有10% (V / V)人类AB血清。随后,这些细胞被转移到培养瓶培养1 - 2小时。不依从细胞收获的祖细胞因子诱导的杀伤(CIK)。剩下的贴壁细胞培养通过添加直流介质(包含0.2 mg / L gm - csf, 1000 U /毫升rhIL-4),和交换一半数量的直流介质在第二天到7天。k - ras基因突变型表位肽被添加到文化的第七天。培养24小时后,文化是通过添加TNF -诱导α(10 ng / mL)在接下来的2天。淋巴细胞在最后的密度/ k - ras基因也被混合负载抗原的DC/在96孔板,分别。在37°C和5%的公司₂,CTL细胞特异性抗原诱导的培养5天之后,它已经准备好使用(8]。

2.3。CIK细胞的诱导和增殖能力

收获不依从细胞的密度调整/毫升PRMI1640媒介。添加干扰素-之后γ1000 U /毫升,文化是培养条件下37°C和5%的公司₂24小时,当CD3单克隆抗体(50 ng / mL)和rhIL-2 (1000 u)补充道。随后,这些细胞交换金额的一半中每三天和补充CD3单克隆抗体和rhIL-29]。

2.4。DCCIKs文化和检测细胞因子和核扩散活动

在96孔板,cik密度/好混合antigen-unpulsed DCs和k -肽antigen-allergized DCs,诱导和培养了9天,密度/好。与CIK细胞混合物被培养介质条件下的37°C和5%的公司₂5天。后添加³H-TdR (37 kBq /),这些细胞被培养12小时。12小时后,细胞混合物收集和检查验证他们的cpm值和液体闪烁计数器,通过计算他们的刺激指数(SI):如果= (cpm实验组−cpm的背景)/ (cpm对照组−cpm的背景)。cik的扩散、DCCIKs K-ras-DCCIKs被观察到。此外,il - 12和干扰素-γ上层清液的细胞培养14天被ELISA检测。

2.5。形态学观察和细胞表型分析DCs和DCCIKs

形态变化的DCs和DCCIKs被扫描和透射电子显微镜观察之后,k - ras基因DCs培养7天,脉冲DCs培养9天是收获。使用流式细胞仪,其表型的分子,CD1a CD80、CD83、CD86和HLA-DR,测量和记录。随后,最初培养9天的K-ras-DCs co-cultivated cik 5天。随后,cik、DCCIKs K-ras-DCCIKs收集第14天的培养,和表面标记物的表达,CD3, CD3⁺CD56⁺和CD3⁺CD8⁺检查并记录。

2.6。检测CCL19、CCL22 Fascin-1 k-Ras-DCCIKs

CIK cocultured直流和直流脉冲与k -肽在9天,CIK的上层清液,收集DCCIK和K-ras-DCCIK预加载的时间点,6个小时,12小时,24小时,48小时内,分别。和CCL19 CCL22内容(吸光度)上层清液被ELISA测试分开,每组三个重复。此外,cik DCCIKs, K-ras-DCCIKs培养14天是收获了蛋白质提取。Fascin-1蛋白质样品的每一组被sds - page分离,通过免疫印迹检测。β肌动蛋白作为内部参考。鼠标反Fascin-1单克隆抗体作为主要抗体(1:3000),和山羊anti-mouse免疫球蛋白g多克隆抗体被用来作为二次抗体(1:5000)。

2.7。杀活动不同的cik和ctl PANC-1 (10)和胰腺癌SW1990细胞

K-ras-DCCIKs DCCIKs, cik, ctl培养14天被用作效应细胞和PANC-1 SW1990靶细胞。肿瘤细胞在日志收集阶段和添加5μCi^125年I-UdR和最终的浓度5摩尔5 -氟尿嘧啶。悬浮培养的细胞培养条件下37°C和5%的公司₂为2小时。洗后与IMDM介质消除未标记的三倍^125年I-UdR,肿瘤细胞数γ计数器。只有细胞平均标签收益率高于1 cpm作为靶细胞。然后,目标细胞进行调整与IMDM中含有10% FCS的密度/毫升为使用做好准备。按照不同effector-target比率(1:6.25,1:12.5,1:25日,1:50),效应细胞与靶细胞,并配以混合介质产生一毫升(三个重复)。同时,对照组的靶细胞是用来测试自发释放率。1000 r / min离心后3分钟,effector-target细胞混合培养12小时。最后,细胞混合物在2000 r / min使离心5分钟的cpm值和测试。显示了细胞毒性的活动^125年I-UdR释放百分比,按照下列公式计算:^125年I-UdR释放比例= (cpm值实验组−cpm值自发释放组)/ (cpm值的最大释放−cpm值自发释放组)。

2.8。动物实验

PANC-1和SW1990日志准备阶段/毫升细胞悬液。每一个雌性BALB / c裸小鼠皮下接种5 - 8周大的在背上0.2毫升暂停构建肿瘤的小鼠模型。在接种后第十天,小鼠随机分为5组(每组10老鼠)。实验组(I)集团k-ras-DCCIK k-ras-DCCIKs,被用于每个注入。(2)集团DCCIK DCCIKs。(3)集团CIK CIK。细胞毒性t淋巴细胞(IV)组,与k-ras-DCs CTL诱导,。(V)组盐控制,使用盐水。ctl和各种cik注入intratumor每两天,总共十分别注射。每次注射前,长直径()和短直径()的肿瘤测量。和肿瘤大小估计公式:。观察每组的最后的存活时间。

2.9。统计分析

统计软件SPSS 16.0被用于数据分析,和Lab-wiok4.6用于免疫印迹结果的分析。测量数据与平均值±标准偏差表示。和原始数据是通过方差齐性检验,然后用于t以及和方差分析。被认为时显示统计学意义的差异。最后统计值的不同样本的灰度值比率样品及其相关的内部参考。

3所示。结果

3.1。形态学观察直流和CIK

3.1.1。k - ras基因形态的观察(12-Val)突变Peptide-Pulsed直流

后脉冲与k (12-Val)突变肽,DCs显示更大的soma的树突凸起的表面(图1(一))扫描显微镜。DCs还显示不规则形状。从显微镜、大型和长树突凸起和小的被观察到表面上。在DCs,细胞器丰富。许多线粒体和粗面内质网图像中出现,虽然不那么溶酶体观察(图1 (b))。

3.1.2。形态学观察CIK DCCIK

在显微镜下,cik显示cluster-like增长。经过3天的孵化,cik细胞群众逐渐增多,成为更大。第七天,细胞开始看起来圆润与普通形状。DCs和cik cocultured 14天后,细胞聚集在一起,形成许多细胞质量,表面上有许多树突隆起(图1 (c))。

3.2。CIK细胞表型检测直流,DCCIK

CD1a的表达水平,CD80、CD83和HLA-DR K-ras-DC高于unpulsed DC组()。然而,没有观察到显著差异tCD86表达组(中)(表1)。这表明树突状细胞可以表达成熟后表面分子抗原致敏作用。共培养后,K-ras-DCCIK人口可以表达CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD56⁺水平都显著高于unpulsed DCCIK组和CIK组()(表2)。

3.3。ELISA检测趋化因子,CCL19 CCL22和细胞骨架蛋白免疫印迹分析,Fascin-1

和CCL19 CCL22文化上层清液组表达水平K-ras-DCCIK和组DCCIK普遍高于组CIK除了预加载和第一个6点。此外,CCL19和CCL22水平K-ras-DCCIK组和组DCCIK还显示随时间上升趋势。在12小时测试后,水平更重要的是增加()。同时,CCL19 CCL22 CIK显示组表达水平没有明显增加。最后,比较K-ras-DCCIK组和组之间的趋化因子表达DCCIK也有统计学差异()(数据2(一个)和2 (b))。

3.3.1。细胞骨架蛋白免疫印迹分析,Fascin-1

结果如图3(一),3(b)3(c),这表明DCCIK fascin-1表达式,CIK, K-ras-DCCIK(培养14天)。与Lab-wiok4.6蛋白质带分析后,结果表明,细胞骨架蛋白的表达,fascin-1 K-ras-DCCIK有显著增加。与团队DCCIK和团队CIK相比,差异显示统计学意义()。此外,对比DCCIK CIK表明,差异也显著()。的灰色值参考蛋白质乐队几乎是相等的。这证明了β肌动蛋白可稳定表达的细胞。结果表明,k - ras基因突变体抗原肽可以促进DCCIKs的迁移活动。

3.4。测试CIK和DCCIK核扩散活动

cik开始从文化的第三天,增殖和细胞增殖加快在第六天的细胞数量明显增加。当培养14天,扩散能力的K-ras-DCCIK显著大于其他组()。DCCIK扩散也大于CIK ()(图4)。这表明K-ras-DC可以有效刺激CIK的扩散。被肽抗原,allergized后直流提升分泌的干扰素-γ和白介素进一步刺激CIK的扩散。

3.5。检测细胞因子,il - 12和干扰素-γ

集团的上层清液K-ras-DCCIK培养14天,干扰素-γ和il - 12水平高于CIK组和组DCCIK ()。和干扰素-γ和il - 12水平的上层清液组DCCIK也高于集团CIK (。后coculture cik和DCs,干扰素-γ和细胞上清液中il - 12水平可以增加。此外,特定的负载抗原的抗肿瘤的活性DCCIK变得更强(图5)。

3.6。检测杀害CIK活动和CTL PANC-1和胰腺癌SW1990细胞体外

K-ras-DCCIKs DCCIKs, cik, ctl k - ras基因引起的脉冲DCs被用作效应细胞,和胰腺癌细胞株,PANC-1和SW1990作为靶细胞。PANC-1 CIK组织的不同造成的影响表明,集团K-ras-DCCIK最大的杀伤率和显著超过集团CIK和组细胞毒性t淋巴细胞()。然而,没有区别组CIK和组细胞毒性t淋巴细胞()。增加effector-target比率后,造成利率效应细胞对胰腺癌细胞的组织也变得更高(图6(一))。cik组的不同造成的影响在SW1990 K-ras-DCCIKs展示,DCCIKs, cik,显示他们杀死对SW1990细胞的影响,以及他们的杀人率高于组细胞毒性t淋巴细胞()。但比较K-ras-DCCIK组和组之间的杀戮效果DCCIK显示没有统计学意义()(图6 (b))。

通过测试的体外杀禁忌K-ras-DCCIKs PANC-1 (k⁺)和SW1990 (k⁻),它是发现,当effector-target比例达到1:12.5和1:25日K-ras-DCCIKs PANC-1的抑制作用强于,SW1990 ()。然而,effector-target比率增加到1:50;K-ras-DCCIKs抑制这两种细胞显示没有统计学差异()(图7)。

3.7。各种cik细胞毒性t淋巴细胞的影响带有裸体小鼠的存活时间加载PANC-1和胰腺癌SW1990细胞

CIK细胞组和k-ras-DC-induced CTL组intratumorly注入带有裸小鼠,及其对小鼠存活时间的影响。关于PANC-1对生存时间的影响的(k⁺(图)肿瘤老鼠8(一个)),K-ras-DCCIK组的生存时间明显延长。与其他组相比有显著性差异()。在DCCIK组、组CIK和组细胞毒性t淋巴细胞、小鼠生存时间相应延长。但两组之间没有统计学差异()。这是证明了DC-induced特定的细胞毒性t淋巴细胞可以抑制PANC-1。同时,K-ras-DCCIK可以产生特定的和立即PANC-1造成影响。这将导致延长存活时间。关于SW1900对生存时间的影响的(k⁻(图)肿瘤老鼠8 (b)),K-ras-DCCIK组的生存时间,组DCCIK和集团CIK大大拉长。同时,与集团CTL相比,差异有统计学意义()。然而,仍有各组之间无显著差异()。结果表明,不同程度,CIK SW1900组织具有直接抑制。相比之下,k - ras基因突变引起的特异性CTL peptide-pulsed直流显示k - ras基因抑制低mutation-negative细胞,SW1900。在集团CTL SW1900肿瘤小鼠的存活时间不延长。

4所示。讨论

肿瘤发生的基因突变是一个持续的过程。Almoguera et al。11)首次报道了k - ras基因的点突变基因在胰腺癌患者。以来,它已经被调查,k - ras基因在85% -95%的胰腺癌患者,发生基因突变和几乎所有的突变发生在12码。因此,12 k - ras基因突变的蛋白质可以作为潜在的基因免疫治疗胰腺癌的网站12,13]。中田宏et al。14)和其他利用k - ras基因的反义寡核苷酸基因突变使转染胰腺癌细胞,PANC-1。这种治疗可以抑制k - ras基因的mRNA表达基因和ras蛋白的合成。因此,它可以抑制胰腺癌细胞的生长,促进肿瘤细胞的凋亡。他等。15)和其他人试图利用k - ras基因突变肽修改DCs为了激活T细胞。它被发现dc能有效k - ras基因存在变异的网站。在这项研究中,我们使用k - ras基因突变肽修改DCs。与修改后的DCs coculture之后,cik显示直接和具体的抑制胰腺癌细胞在体外和体内。

cik细胞人口获得人类外周血单核细胞刺激干扰素-γ2,CD3单克隆抗体(OKT3)。他们可以表达T细胞和NK细胞的表面标记,CD3⁺CD56⁺(16]。目前,CIK已知最快的增殖,肿瘤细胞毒性最强的,最广泛的肿瘤死亡(17]。cik的屠杀行动,肿瘤是通过识别的一系列相关的肿瘤细胞表面配体,虽然不是只根据一个抗原(5]。cik既能直接抑制肿瘤细胞和调节身体的免疫系统间接杀死肿瘤细胞(18]。因此,他们可以抑制肿瘤的生长和复发的直接抑制肿瘤细胞,提高免疫力的病人长期效应(19]。cik很少引起移植物抗宿主病(GVHD)和耐药性情况对患者安全、有效。Coculture cik的DCs可以增加他们的增殖活性和细胞毒性20.]。目前,为什么DCs的机制可以提高cik的屠杀活动还不清楚。推测,强化tumor-killing DCCIKs效应可能与upregulation有关的细胞因子,如白介素、干扰素-γ在DCCIKs CD3的上层清液和高表达⁺CD56⁺双阳性细胞以及[21]。在这项研究中,通过测试的表达式DCs的表面分子,结果表明,k - ras基因突变肽可以促进dc的成熟,促进有效的特定抗原(22]。干扰素-γK-ras-DCCIK组和il - 12水平最高,高于DCCIK组和组CIK显著()。此外,co-cultivation之后,CD3 K-ras-DCCIKs高度表达⁺CD8⁺和CD3⁺CD56⁺,超过那些CIK组显著()。

CCL19,趋化因子表达在二级淋巴器官和胸腺。它可以敦促DCs从周边地区迁移到T细胞聚集区在淋巴器官和诱导Th1和T细胞免疫反应(23- - - - - -25]。CCL22表达在脾脏,外周血T细胞,NK细胞,等等。(26]。上层清液的monocyte-derived DCs,完整CCL22成为DCs(高度表达,产生强烈的趋化性27,28]。在ELISA测试和CCL19 CCL22各种CIK团体,成立k-ras-DCs显然可以提高CIK的迁移活动,可以提高对肿瘤细胞的迁移能力。这些行动提供一些必要条件增加杀死活性和抑制肿瘤的生长。在免疫系统中,Fascin-1蛋白质只是表达相关成熟的DCs和DCs的运动(29日,30.]。研究表明,k-ras-DCCIKs的细胞骨架蛋白的分泌量Fascin-1明显增加。与团队DCCIK和团队CIK相比,增加有显著统计学意义()。这是证明了k - ras基因突变肽可以诱导DCs的成熟和提高k-ras-DCCIKs迁移能力。

k-ras-DCCIKs增殖能力明显高于其他组()。可以看出k-ras-DC能有效刺激cik的扩散。此外,干扰素的分泌增加γ和白介素进一步激怒cik的扩散。貂等等(31日)使用CA19-9负载抗原的成熟的DCs和抗原peptide-untreated DCs与cik coculture。与未经处理的DCs组相比,前者显示杀害活动增加。是提示,cik cocultured CA19-9脉冲DCs,有现有的抗原特异CTL子集。在体外实验中,杀害活动K-ras-DCCIK集团PANC-1也优于CIK细胞组和k-ras-DC-induced CTL集团()。它表明,通过k -脉冲、DCs进一步加强cik的谋杀活动。而k-ras-DC-induced特异性ctl, cik几乎相同的杀人效率()。特定的k - ras基因ctl有明显的抑制作用⁺PANC-1, K-ras-DCCIKs立即PANC-1造成影响,这是具体的和更显著,使小鼠的生存期明显延长。所有的K-ras-DCCIKs DCCIKs, cik显示抑制SW1990细胞。但k-ras-DC-induced特异性ctl的削弱抑制SW1990细胞。而DCCIKs的抑制作用,有显著的统计学差异()。表明,不同程度,CIK组织具备SW1900直接抑制。相比之下,k - ras基因特异性ctl显示较低的抑制mutation-negative细胞,SW1900。在集团CTL SW1900肿瘤小鼠的存活时间不延长。在这项研究中,通过与cik共培养肿瘤负载抗原的树状突,我们获得了k-ras-DCCIKs,更加突出肿瘤治疗效果和更强大的比cik肿瘤抑制作用,显示出良好的应用前景。

PANC-1分别与k-ras-DCCIK SW1990细胞被抑制。结果表明,当effector-target比例达到1:12.5和1:25日K-ras-DCCIKs PANC-1可以产生特定的抑制。此外,造成效率对这两个胰腺癌细胞有统计学差异()。然而,增加effector-target比例,具体肿瘤抑制这两种细胞的差异没有统计学意义()。证明CIK细胞有一个潜在的肿瘤抗原,进一步吸收产生具体影响癌细胞死亡。在K-ras-DCCIKs,可能有一些抗原特异CTL细胞现有的子集。致敏作用与肿瘤cik负载抗原的树状突细胞既能发挥non-MHC限制性cik细胞毒性和激活MHC限制性细胞毒性由负载抗原的树状突加强特定造成影响特定靶细胞(32]。然而,当effector-target比率高,这可能是cik“强烈肿瘤直接造成影响,包括他们的具体行动。这一现象将在未来进一步研究。

总之,结果表明,k - ras基因被脉冲后,DCs可以提高cik的扩散和迁移能力,可以增强杀死对胰腺癌细胞活动。此外,cik的杀害活动增强可能与upregulation有关干扰素-γ和il - 12在上层清液和double-positive细胞CD3的高表达⁺CD8⁺和CD3⁺CD56⁺。体外的antigen-allergized DCCIKs可以生产活动特定的肿瘤细胞死亡。肿瘤抑制的针对性与特定的ctl几乎是一样的,而他们总肿瘤抑制效率高于ctl。

缩写

ctl:	细胞毒性T淋巴细胞
DCs:	树突细胞
gm - csf:	Granulo-macrophage-stimulating因素
IL:	白介素
CIK:	细胞因子诱导的杀伤
DCCIKs:	CIK细胞cocultured DCs
CD1a、CD80、
CD83、CD8、
和HLA-DR:	DC表面标记
CD3+CD8+
和CD3+CD56+:	CIK表面标记
Fascin-1:	一种细胞骨架蛋白
PANC-1:	k - ras基因点突变的胰腺癌细胞系
SW1990:	胰腺癌细胞系没有k - ras基因的点突变
如果:	刺激指数
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子
PBS:	磷酸盐
干扰素-γ:	干扰素
FCS:	胎牛血清
ELISA:	酶联免疫吸附试验。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由中国自然科学基金会(国家自然科学基金委)(30670624,30870719)。医院IRB审批签订的使用人类的血液样本。

引用

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