非小细胞肺癌免疫细胞浸润与预后的生物信息学意义分析

摘要

客观的．基于生物信息学对非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)表达谱芯片数据进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)和免疫细胞浸润分析，构建TICS评分模型，区分预后时间，筛选NSCLC治疗的关键基因和肿瘤相关途径。探索非小细胞肺癌患者的差异基因，预测非小细胞肺癌的潜在治疗靶点，为非小细胞肺癌的治疗提供新的方向。方法．使用81例NSCLC患者的转录组数据和GEO数据库下载匹配的临床数据(访问号:GSE120622)。形成非小细胞肺癌(NSCLC)的表达。根据TICS值计算并分组，利用mRNA表达谱数据对非小细胞肺癌患者进行GSEA。生物过程分析(GO)， DAVID和KOBAS对差异基因进行通路富集(KEGG)分析。利用蛋白质相互作用(PPI)对数据库STRING进行分析，构建目标相互作用的PPI网络模型。后果通过上述分析，我们获得了6个显著相关的免疫细胞，包括活化的B细胞（图1（b） ,， ）.根据显著相关免疫细胞的TICS值，获得41个高风险和40个低风险样本。TICS值和免疫评分值进行Pearson相关系数计算，发现TICS值和IMS值显著相关（Cor = 基于非小细胞肺癌mRNA表达谱数据，在高TICS组和低TICS组之间均发现了mRNA的显著变化（FDR 0.01，FC） > 2） .研究人员发现高TICS组有730个mRNA显著上调，低TICS组有121个mRNA显著下调。高置信度边缘（综合得分>0.7）使用字符串数据选择；然后，191个mRNAs与倒数边缘匹配；最后，构建了一个包括164个点和777个边缘的无向网络。细胞趋化因子介导的信号通路的重要成员，如CCL19，影响患者生存时间。结论. （1） 非小细胞肺癌患者的寿命与未成熟B细胞、活化B细胞、MDSC、效应记忆CD4 T细胞、嗜酸性粒细胞和调节性T细胞的存在密切相关。（2） 与NSCLC生存相关的免疫相关基因如CX3CR1、CXCR4、CXCR5和CCR7通过调节免疫过程影响NSCLC患者的预后。

1.导言

肿瘤的发生不仅与肿瘤细胞自身的生物学特性有关，而且肿瘤细胞与肿瘤免疫微环境和免疫系统的相互作用也起着非常重要的作用，其中一个需要研究的问题是肿瘤组织中的免疫细胞浸润是否与肿瘤细胞自身的生物学特性有关反恐执行对肿瘤治疗和预后的影响。

肺癌是一种发病率和死亡率都很高的主要癌症，数据显示每30年就有一人死于肺癌 世界各地[1]肺癌分为两种类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。小细胞肺癌（SCLC）约占所有肺癌病例的85%[2由于原发性肺癌患者发病隐匿，临床表现多样，缺乏特异性，大多数患者在确诊为肺癌时已处于中晚期，因此肺癌患者是否可以筛查、诊断，早期治疗成为影响预后的关键因素。

肿瘤微环境是由多种细胞(T细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞等)和细胞外成分(细胞因子、趋化因子、受体等)组成的双向、动态、复杂的网络系统，这个网络的每个元素都能够促进恶性转化，并影响肺癌的发病、进展和转移，发展和转移，以及对药物治疗的反应[3.近年来，TME中的t细胞表面程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)被证实与癌细胞表面程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)结合，导致t细胞功能障碍或衰竭，导致免疫耐受和肿瘤细胞应答。发生免疫耐受，导致肿瘤细胞免疫逃逸[4]，而在杀伤肿瘤细胞的过程中，TME中最核心的作用是由CD8+ T细胞发挥的[5]，其质量和数量对免疫治疗效果至关重要[6].黑色素瘤PD-1抑制剂的研究[7]研究发现，CD8+T细胞的数量与疗效相关。肿瘤浸润性B细胞是免疫系统微环境的重要组成部分。在非小细胞肺癌患者中，CD4+T淋巴细胞可见于B细胞浸润的肿瘤细胞和具有三级淋巴结构的肿瘤细胞中。滤泡B细胞的高密度与ted对NSCLC患者预后较好[8］.布鲁诺等[9]发现肿瘤浸润性B细胞可以将内源性肿瘤抗原呈递给CD4+TIL，并在体外改变它们。也有报道称，骨髓源性抑制细胞（MDSC）能够产生TGF-p和IL-10等因子，促进初始CD4+T细胞发育为Treg细胞，导致Treg细胞增加，从而抑制机体免疫反应[10]此外，MDSC可阻断自然杀伤细胞（NK）的分泌。分泌物质中的IFN-NK细胞是指能够杀死癌细胞和病毒感染细胞的天然免疫细胞。IFN-NK细胞可以调节其他免疫细胞的功能，促进组织生长。

趋化因子是一组小分子(分子量大多为8-10 kD)，能够趋化细胞运动。趋化因子根据n端半胱氨酸残基的数量和位置可分为四类:C、CC、CXC和CX3C。例如，CCL2趋化因子具有趋化吸引单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的能力[14］.已有研究表明，抗CCL2抗体阻断CCL2降低MDSC、增加CD4+和CD8+ T细胞浸润、促进IFNy分泌等作用，可增强PD-1治疗小鼠肺癌的肿瘤免疫作用[15].CX3CL1（FKN，fractalkine）是CX3C型趋化因子家族的唯一成员，具有趋化因子共同的趋化功能，并介导白细胞，尤其是淋巴细胞和吞噬细胞的游走和活化。李等人[16]利用基因沉默技术证实CX3CL1在肝细胞癌细胞系HepG2中稳定高表达，抑制肿瘤血管生成。在乳腺癌研究中，发现CX3CL1可能在肿瘤转移中发挥作用[17，18]，且CX3CL1高表达与乳腺癌预后良好相关[19也可作为免疫调节治疗的适应症之一。

综上所述，近年来只有少数报道研究了免疫细胞的临床病理意义，而免疫细胞浸润的总体表达水平和预后价值，尤其是在非小细胞肺癌患者中，需要进一步研究。因此，在本研究中，我们从公共数据库中收集数据并构建统计模型临床评分模型独立分析多个数据集并汇总分析结果，以阐明非小细胞肺癌预后相关的分子机制，这不仅有助于进一步了解非小细胞肺癌的发病机制，而且为非小细胞肺癌的早期诊断和治疗提供了新的思路和靶点。

2.材料和方法

2．1．预处理的数据

NSCLC患者的转录组和临床数据来自GEO数据库，使用研究队列GSE1206222(N= 81)。入组患者的相关体细胞突变数据也从上述数据库中获取。原始文件用于对所有的表达数据应用鲁棒多阵列平均(RMA)技术。此外，使用“DeEseq2”和“affy”R包来调整背景，并对本次分析的结果进行log2转换。

2.2.免疫评分、TICS评分、皮尔逊免疫细胞相关系数计算和免疫细胞浸润

（1）采用单样本基因集富集分析(ssGSEA)对81例非小细胞肺癌患者肿瘤浸润的28个免疫细胞的相对丰度进行了定量分析。采用Cox风险回归分析评估28个免疫细胞的预后。根据免疫细胞的风险值和ssGSEA的NES值计算TICS值，并计算Z-score。(2)我们对81名患者的转录本进行了主成分分析。为了获得与高浸润相关的基因，T-然后，我们获得与高浸润相关的上调和下调基因以及聚集的上调基因和样本，比较TICS值和免疫评分值，并计算Pearson相关系数。

2．3.功能与路径的富集分析

（1）我们通过GO和KEGG功能注释探索了这些不同基因的生物学过程。此外，我们还使用了“聚类分析软件”R包来实现基于替代TICS的特征基因。同时，通过使用GSEA获得GO术语和免疫细胞之间的整体关系。(2)为了找到GO项之间的关系，首先利用STRING数据库利用免疫浸润相关信号通路与相关基因构建网络。其次，挖掘网络模块，分析基因与所涉及的生物过程之间的相关性。(3)我们检测并预测了非小细胞肺癌患者的生存率，并根据免疫因子分析绘制了生存曲线。

3.结果1:构建非小细胞肺癌免疫微环境图

非小细胞肺癌最重要的治疗方法之一是免疫治疗（NSCLC）.患者组织免疫微环境的异质性可能会影响治疗效果。因此，必须了解肿瘤组织中免疫细胞的组成。首先，我们从GEO数据库（访问号：gse120622）下载了81例NSCLC患者的转录组数据和匹配的临床数据.基于ssGSEA算法，我们利用每位患者的mRNA表达数据构建NSCLC免疫细胞浸润图，包括27种适应性和先天性免疫细胞。中枢记忆CD8 T细胞、中枢记忆CD4 T细胞和浆细胞样树突状细胞是NSCLC组织中常见的免疫细胞，它们都存在于81名患者中。此外此外，还有一些个体特异性免疫细胞，如未成熟的B细胞（图1（a） ）。我们发现，大多数免疫细胞与活化的CD8 T细胞、活化的B细胞、未成熟的B细胞、单核细胞、效应记忆CD8 T细胞和其他细胞具有高度的联系。然而，某些免疫细胞与其他免疫细胞之间没有明显的联系，如灿烂的自然杀伤细胞、活化的CD4 T细胞和浆细胞样树突状细胞（图1）1（b） ）。这可能表明NSCLC患者的免疫微环境之间存在复杂的相互作用模式。

4.结果2:构建基于非小细胞肺癌患者免疫微环境的TICS评分模型

然后，在患者生存数据的基础上，采用Cox回归分析探讨27种浸润性免疫细胞与生存时间的关系，同时得出27种免疫细胞的风险比和风险系数，结果表明，个体特异性免疫细胞与患者生存时间显著相关非小细胞肺癌患者的生存率（图2(a))。MDSC细胞与其他五种免疫细胞呈高度相关性(图2（b） ）。我们根据这六种肿瘤浸润性免疫细胞的数量计算每位患者的TICS评分（见程序），然后根据TICS评分中位数将患者分为高TICS组和低TICS组。在高TICS组，我们发现未成熟B细胞、活化B细胞、MDSC效应记忆CD4 T细胞、嗜酸性粒细胞和调节性T细胞的ssGSEA得分较高( ）(图2（c） 各种研究发现，包括非小细胞肺癌在内的许多实体瘤的总体存活率与肿瘤浸润性B细胞呈正相关[8，20.- - - - - -26].此外，肿瘤浸润性B细胞和肿瘤浸润性CD4 + T细胞产生三级淋巴结构，与NSCLC的生存率呈正相关[8，26］.此外，我们根据临床生存数据分析NSCLC患者的预后。我们发现两组之间的预后有很大的差异，高TICS组比低TICS组的预后好得多。这说明构建的TICS评分可以作为临床预后的参考(图)2(d))。

5.结果3:TICS相关基因参与NSCLC重要免疫通路

对TICS相关生物学进展的进一步研究将有助于分析影响NSCLC预后的分子机制。首先，我们利用基于TICS组的mRNA表达数据对NSCLC患者进行GSEA。结果显示，高TICS组影响非小细胞肺癌预后的上调基因与T细胞和B细胞的信号通路显著相关(图)3.（a） ）。提示免疫调节是影响NSCLC预后的重要生物学过程，高TICS组上调基因是参与其免疫调节的重要分子。接下来，我们鉴定了显著不同的mRNA（FDR<0.01，FC > 2） 根据NSCLC的mRNA表达数据，在高TIC组和低TIC组之间进行比较。

最后，在高TICS组中获得了730个显著上调的mRNAs，在低TICS组中获得了121个显著下调的mRNAs（图1）3.（b） ）。根据我们的结果，上调的mRNA更可能与免疫功能相关，如CX3CR1，它介导白细胞的迁移和粘附；CCL21对B细胞、巨噬细胞或中性粒细胞没有趋化作用。为了进一步分析差异mRNA的功能，我们使用DAVID工具对其进行了丰富。基因本体（GO）结果显示，上调的mRNA富集在前10个生物学功能中。它主要包括一些与免疫应答有关的功能。同样，上调的mRNA在京都基因和基因组百科全书（KEGG）的前十条途径中富集。它主要包括细胞粘附分子和免疫等相关信号通路。这些结果充分表明，与免疫功能相关的基因可以影响非小细胞肺癌的预后。此外，我们还探讨了前10项生物功能（GO）是否相关。结果表明，这些生物学功能密切相关，可以共享同一基因集，表明这些生物学功能具有一定的相似性。

6.结果4：免疫相关基因是区分TICS的关键

接下来，我们探索了十大生物学功能相关mrna之间的相互作用。首先，我们从STRING数据中选择高可靠性边缘(综合评分>0.7)。然后，将191个mrna匹配到相互作用边缘。最后，构建一个包含164个点和777条边的无向网络(图5)。4（a） ）。然后，我们使用MCODE插件获得子网络，并选择具有高可靠性的子网络进行生物功能注释（图4（b） –44（e） )我们发现与趋化因子介导的信号通路相关的mRNA之间存在密切的相互作用。同时，我们探讨了这四个子网络是否能够有效区分高TIC和低TIC。我们发现，通过绘制ROC曲线和计算面积u，这四个小网络可以区分高TIC和低TIC在曲线下方，表明它们是区分抽动的潜在标记（图4(f))。其中，CCL19作为趋化因子介导信号通路的重要成员，已证实其在肿瘤FSC中的表达水平与CD8 + T细胞的免疫细胞浸润程度及肿瘤的积聚有关(29391257)。综上所述，CCL19表达水平与肿瘤大小有关。表达水平越低，肿瘤越大。此外，CX3CR1也是T细胞分化的标志(33658501)。这些趋化因子也与非小细胞肺癌患者的生存显著相关。有报道称肿瘤组织中CX3CR1、CXCR4、CXCR5、CCR7的表达水平显著升高，可影响患者的生存时间。CCR7表达阳性患者的5年DFS和5年OS显著升高(32896997)。

7.讨论

肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞、不同的信号化学物质和细胞外基质构成了肿瘤微环境的大部分。肿瘤微环境显著影响肿瘤的诊断、生存和临床治疗敏感性。相关研究表明，适应性免疫和天然免疫系统的免疫细胞可以渗透到肿瘤组织，形成肿瘤免疫微环境并影响肿瘤进展。化疗后患者的生存受肿瘤中免疫细胞数量的影响。在这项工作中，我们使用非小细胞肺癌mRNA表达数据创建肿瘤组织内部免疫系统的微环境图假设结合对免疫细胞和患者生存数据的分析，发现NSCLC患者的生存与未成熟B细胞、活化B细胞、MDSC、效应记忆CD4 T细胞、嗜酸性粒细胞和调节性T细胞之间存在显著相关性。接下来，我们构建了TICS评分模型并对spe进行分级根据预后相关免疫细胞含量及其与生存率的关系对患者进行cific TICS评分。TICS评分可以区分预后良好的非小细胞肺癌患者和预后不良的患者的生存时间。

此外，我们通过使用预后标志物和mRNA表达谱鉴定了TICS相关基因。我们发现，在高TICS组中，许多趋化因子显著上调。例如，CX3CR1、CXCR4、CXCR5和CCR7通常与NSCLC的生存相关。此外，CX3CR1和CCL19的高表达也可能导致肿瘤复发影响T细胞的免疫分化，如CD8 + 先前的研究表明，非小细胞肺癌活检组织中的C3水平肯定与浸润性CD4相关（24819254） +  和CD8 + 此外，功能富集的结果显示TICS相关基因参与了多种免疫相关的生物学过程和信号通路，这表明免疫相关基因通过调节免疫过程影响NSCLC患者的预后。

我们利用生物学功能排名前十的基因建立免疫基因间的PPI和高可信度PPI网络。PPI网络结果表明，这些基因之间存在密切的相互作用，说明免疫基因可能具有复杂的协同和相互作用，通过协同作用调节机体的免疫反应。此外，我们还探讨了PPI网络中的四个重要子网络。通过绘制ROC曲线并计算曲线下面积，我们发现这四个亚网络是区分患者与TICS的重要分子标志物。综上所述，我们的研究描绘了一个完整的NSCLC免疫图谱，并构建了一个基于免疫细胞含量的TICS评分模型，可以有效区分患者的预后时间。差异基因和富集分析解释了NSCLC预后相关的分子机制。PPI网络和子网络挖掘有效地识别出了区分TICS分类的潜在标记。我们希望通过本研究发现的与预后相关的免疫标志物，为临床诊断、用药及患者预后预测提供指导。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

孙恒和隋博文对这项研究的贡献不相上下。

致谢

本研究得到黑龙江省应用技术研发计划项目的资助，项目编号:GA19C109，项目名称:基于中医硕士段富金教授学术思想的脾虚型肺癌放化疗后消化道毒副作用研究，支持单位:项目编号:2020GSP07，项目名称:探索省中医肿瘤诊疗中心“一体两翼”运营模式。

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