文摘
液可以传输中枢神经系统(CNS)信息通过脑屏障外围循环系统,和血液中液也可以同样进入中枢神经系统。的组件exosomal内容发挥关键作用在细胞信号通讯,因此,exosomal的传播内容组件被认为是一种新发现的细胞之间长途通信的方法。当前的目标是探索的变化exosomal lead-exposed工人的血清microRNA集团,可能参与lead-induced神经炎症,尤其是小胶质细胞的激活和炎症因子的释放。我们提出一个方法统计分析和实验相结合的方法根据不同的exosomal微rna表达。首先,我们把工人分成两组,lead-exposed组和对照组,然后问卷用于获得他们的基本信息,和医疗测试方法被用来获得血清液。其次,主成分分析被用来构建一个综合指数的神经行为功能。此外,火山的地图和热图显示差异基因表达水平的分布和相关分析,分别。最后,两个软件应用程序,TargetScan和米兰达,被用来预测显著不同小分子核糖核酸的目标基因,分别和目标基因预测的两个软件应用程序筛选根据每个软件的评分标准。我们的研究结果表明,73小分子核糖核酸被改变的血清液lead-exposed工人,其中48小分子核糖核酸是调节和25个microrna的表达下调。此外,mir - 124和mir - 506,和他们可能参与lead-induced神经炎症的过程。
1。介绍
液是多泡体平均直径30 - 200细胞内溶酶体形成的纳米微粒,在液的内容及其核酸组件包括mRNA, lncRNA,微rna, circRNA,扮演着重要的角色在细胞信号通讯在生理和病理条件下(1,2]。众所周知,液可以分泌的神经细胞,血管内皮细胞,和脉络丛上皮细胞在中枢神经系统,和血液中的液也可以以同样的方式进入中枢神经系统(3,4]。因此,液细胞之间被认为是一种新的方式来长途通信(5,6]。在某种程度上,液携带microRNA能具体地绑定到3′非编码区域的目标mRNA,导致目标基因表达的沉默7]。最近的研究表明,exosomal微rna扮演着一个重要的角色在神经炎症和神经退行性变的发生和发展8- - - - - -10]。microrna - 124由小胶质细胞分泌脑损伤后可以调节神经炎症,以及液含有miRNA-29发布的星形胶质细胞可以吞噬相关神经元和神经元的生存(11- - - - - -13]。此外,差异表达exosomal microrna在患者的脑脊液阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)可能成为预防和治疗的新目标广告或PD (14- - - - - -16]。
铅神经毒性的特点是神经炎症(8,9]。众所周知,铅是一种重金属污染物在工业生产和日常生活的环境(17]。神经损伤造成的铅污染一直是一个公共卫生问题,但对其确切分子机制(18- - - - - -20.]。Exosomal microrna扮演一定的角色在神经退行性疾病的发生和发展和生物标志物的研究21,22]。液可以神经细胞之间的信息交流在正常情况下,这是有关错误折叠的蛋白质在神经退行性疾病的传播2,23]。此外,在神经元保护液发挥重要作用,神经再生,形成神经元和突触可塑性24- - - - - -28]。一些研究表明,差异表达exosomal脑脊液蛋白质和小分子核糖核酸的阿尔茨海默病和帕金森症患者可能成为预防和治疗的新目标的广告或PD点(29日- - - - - -31日]。但仍是知之甚少的角色exosomal microRNA在神经损伤引起的环境和职业重金属暴露。
本研究旨在调查的变化微分表达式血清microRNA概要的液lead-exposed工人和控制工人和识别差异表达。我们的发现提供了新的铅神经毒性的机制以及血清exosomal微rna的基础作为生物监测的候选标记的铅暴露。
2。对象和方法
2.1。主题
总共42职业lead-exposed工人暴露组和32无铅的工厂的工人与可比的性别和年龄的平衡,人作为对照组,被招募在唐山电池生产工厂,河北省。所有受试者的一般信息的调查进行自编问卷,和行为进行了功能测试。人的筛查exosomal微测序完成的血铅水平和奈。此外,所有参与者充分告知,他们同意参与这项研究。实验伦理委员会批准的协议是华北科技大学(批准号2017038)。
2.2。血清液隔离
血清的0.5毫升离心20分钟(2000 g,在4°C),上层的收集和转移到聚碳酸酯管。然后,离心机(10000克,在4°C) 30分钟,和上层的收集。收集到的上层清液被离心机为70分钟(100000克,在4°C)。完全移除上层清液,然后在PBS resuspend获得颗粒。接下来,样本超离心机60分钟(100 000克,在4°C),这个过程重复了三次。获得颗粒在PBS resuspended,提取液被存储在一个冰箱在−80°C为进一步使用。
2.3。血清液特性
2.3.1。透射电子显微镜法
液颗粒悬浮在30μL PBS和10μL的样本是掉在沉积的铜网1分钟。滤纸是用来消除流动液体,和10μL的铀酰乙酸(磷钨酸)下降为1分钟沉积的铜网,和滤纸用于去除流动液体。这是允许几分钟在室温下干燥。样本然后用透射电子显微镜检查。
2.3.2。免疫印迹分析
与裂解缓冲液的细胞溶解,然后离心机在13000 rpm 15分钟在4°C。包含蛋白质收集的上清液。蛋白质浓度测定用BCA蛋白质化验设备。凝胶电泳是使用8% sds - page凝胶,蛋白被转移到一家聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜是孵化5%脱脂牛奶1 h在室温下然后孵化主要抗体(老鼠anti-CD63 1: 1000)在一夜之间在4°C。与二次孵化后抗体(山羊anti-rabbit IgG-HRP, 1: 3000) 1 h在室温条件下,膜与增强化学发光试剂染色。每个波段的灰度值与图像分析软件。
2.3.3。Exosomal粒度检测
NanoSight用于检测,具体方法如下:收集到的外来体是稀释10倍到10000倍的比例,和检测样本的最大的稀释。样品是最好的,当exosomal粒子的数量是107-10年8/毫升,所以单个粒子可以被跟踪的机器。软件是用来确定液的直径。
2.4。microrna的隔离和高通量测序
1毫升pre-cooled试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)添加到提取液,和超声波均质器是用于组织破坏。超声破坏组织然后转移到1.5毫升EP管没有酶污染中提取总RNA。小RNA序列库准备利用TruSeq小RNA样本准备工具包(美国圣地亚哥Illumina公司)。在图书馆准备完成后,使用Illumina公司Hiseq2000/2500建库测序,测序读长是单端1×50个基点。然后根据执行转录组测序数据分析软件ACGT101-miR (LC,休斯顿,德克萨斯州,美国)。削减适配器序列后,消除污染的读取,并过滤低质量的读取,其余清洁读取映射到人类基因组使用短的寡核苷酸排列程序(SOAP)。其他小分子rna (rRNA, tRNA,核内小rna, snoRNA,和piRNA)检测筛查对Rfam 10.1和基因库的数据库。已知的microrna miRBase被对准他们。之间的已知的microrna的表达差异lead-exposed工人和nonlead-exposed工人进行评估通过对比log2比率的两组。选择目标基因的microrna与微分表达式利用RNAhybrid预测。 For determination of the main biological functions of the candidate target genes, Gene Ontology (GO) enrichment analysis was applied. We mapped all candidates to GO terms in the database (http://www.geneontology.org/),用超几何检验发现显著富集条件。识别的明显富集代谢途径和信号转导途径在目标基因的候选人,我们这些候选人映射到京都基因和基因组的百科全书KEGG数据库。
2.5。差异表达microrna的识别
血清的总RNA提取液,和实时PCR进行逆转录后(热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)。U6作为内部参考,罗氏光周期计®96实时荧光定量PCR仪(瑞士巴塞尔)是用于放大。SYBR绿色方法选择治疗lead-exposed工人和nonlead-exposed工人。血清microRNA的表达水平液的工人进行了测试。引物序列见表1。
2.6。统计分析
所有的统计方法进行使用SPSS软件,版本23(美国IBM)。正态分布的数据被表示为±SD方法。单向方差分析之后,图基事后测试是用于集团分析,和学生学习任务是用于统计分析应用于两组分别。频率和百分比,表达的定性数据χ2测试是用于两组之间的比较。皮尔森相关测试采用相关分析的两个连续变量服从正态分布。使用多元线性回归分析神经行为功能的影响因素指标。一个值小于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。测序的一般信息
有12个样本exosomal微测序。暴露组包括8 lead-exposed工人平均年龄为36.53±3.10年和10.38±2.62年的接触史。和血铅的平均值是273.07 mg / L。对照组包括4人,平均年龄为30.22±2.76年,平均血铅值36.52 mg / L。对照组之间的年龄差距和暴露组(表不是统计意义2)。
对神经行为功能,许多POMST POMSD, POMSA, POMSF, POMSC工人暴露组高于对照组(表3)。POMSV积极的得分低于对照组,而数据具有统计上的显著差异。
在这项研究中,奈被用作综合指数来评估水平的神经行为功能。结果发现奈几十个系列加/减,内存扫描、音频反应时间和追求目标测试工人暴露组低于对照组。简单的视觉反应时间长于对照组。差异具有统计学意义(< 0.05)。
3.2。描述液来自血清
透射电子显微镜观察表明,圆形或椭圆膜囊泡是统一的大小和形状,和一些囊泡融合的外边缘液涂上一种双层脂质膜,颜色是光和中心,周围是密集的彩色,边缘很明显(图1(一))。在整个电子显微镜观察,没有发现细胞碎片和其他亚细胞的细胞器,可以排除其他细胞成分的影响研究的蛋白质成分。
(一)
(b)
(c)
得到标准曲线方程,BCA法绘制标准蛋白质浓度的吸光度值对不同浓度。获得exosomal蛋白质的浓度是0.916μ克/μl .此外,免疫印迹分析显示CD63的表达在液(图1 (b))。最后,我们使用了纳米粒子跟踪分析(NTA),用来检测提取液囊的大小和数量。结果表明,97.4%的10 - 1000纳米粒子平均直径159.5 nm和粒子浓度为2.3×106/毫升(图1 (c))。
3.3。血清液的样品信息
Rfam非编码RNA (ncRNA)家庭数据库,包括rRNA, tRNA, snoRNA,核内小RNA,微RNA,和其他非编码RNA。在这项研究中,Rfam数据库选择注释小RNA序列测序得到的,和其他可能non-microRNA序列,如核糖体RNA, snoRNA,核内小RNA, tRNA,被移除。然后,总样本的测序数据分析统计(表4)。
3.4。识别微分在血清microrna液Lead-Exposed工人
总的来说,73年确定小分子核糖核酸(48是调节和25个表达下调)(表5和6)。此外,我们检查了所有重要的小分子核糖核酸画一个热图(图2)。热图显示lead-exposed工人区别于对照组,结果可以解释如下:小分子核糖核酸具有相似表达可能有类似的功能。然后,我们使用火山地图直观地显示不同样本之间的差异基因的分布(图3)。
3.5。预测血清microrna的目标和功能注释的液铅工人
我们使用TargetScan和米兰达软件预测的目标基因显著不同的小分子核糖核酸,分别。目标基因是基于以下标准:(a)删除目标基因与上下文的得分百分比小于50 TargetScan算法。(b)米兰达算法删除目标基因的最大自由能(Max能源)十大。最后,这两个软件应用程序的交集作为最终目标基因的微分微。
我们这些基因功能注释根据条款包括生物过程、细胞组件,和分子的功能。去浓缩目标基因分析表明,富含以下途径:蛋白质绑定,细胞质,细胞溶质,金属离子结合,核转录,转录DNA模板,调节转录,DNA模板,转移酶活动,运输、核浆、细胞骨架、胞质囊泡,细胞周期、DNA结合,蛋白质磷酸化,和神经系统的发展,证明了这些微rna靶基因发挥重要作用在铅神经毒性的过程(图4)。
从KEGG通路分析,我们发现目标基因富集在癌症通路中,蛋白聚糖在癌症、MAPK信号通路,粘着斑,胰岛素信号通路,AMPK信号通路,JAK / STAT信号通路,Rap1信号通路,内吞作用,人类乳头状瘤病毒感染,过氧物酶体,信号通路,Ras信号通路、细胞衰老,自噬,河马信号通路,催产素信号通路,组织apelin信号通路,在心肌细胞肾上腺素的信号,甲状腺激素信号通路(图5)。
3.6。验证血清液mir - 124和mir - 506
Lead-exposed工人血清液mir - 124和mir - 506表达不同的倍数。最近的一项研究表明,mir - 124表达大脑组织在一个较高的水平。此外,mir - 124和mir - 506有许多共同的目标基因。因此,我们选择mir - 124和mir - 506作为进一步研究必要的小分子核糖核酸。使用U6蛋白质作为参考,我们使用实时PCR检测液mir - 124的表达和mir - 506。因此,mir - 124的表达水平和mir - 506在lead-exposed工人高于对照组(表7)。
4所示。讨论
在这项研究中,我们使用了高通量测序方法序列lead-exposed工人的血清exosomal microRNA表达谱和人口的对照组。被定义为基因的差异表达基因满意≤0.05,褶皱变化≤1.2。结果表明,有73个差异表达的小分子核糖核酸的血清液lead-exposed工人,其中48调节小分子核糖核酸和25是表达下调小分子核糖核酸。此外,我们使用miRbase和目标扫描数据库软件来预测目标基因差异表达的73小分子核糖核酸和获得的1581个基因有显著差异。最后,我们这些基因功能注释根据条款包括生物过程,细胞组件,分子功能,和KEGG通路分析,发现大部分都是有关铅损伤的发生和发展。建议微rna分子的变化是密切相关的铅暴露水平和破坏影响,预计将成为一个新的生物标志物的铅神经毒性(32]。
微测序结果表明exosomal mir - 124的表达比对照组高出12.07倍,mir - 506也高于对照组的4.33倍。它表明,mir - 124和mir - 506可能参与了神经损伤的发生和发展造成的铅暴露;与此同时,结果类似于神经退行性疾病的研究33,34]。可用的研究发现,mir - 124有一个重要的监管影响神经炎症,和mir - 124的超表达显著抑制星形胶质细胞的激活引起的甲基苯丙胺(35- - - - - -37]。mir - 124也可以参与细胞凋亡及相关炎症反应通过调节P38的表达(38]。此外,mir - 124目标时钟抑制NF -的激活κB途径,激活NF -κB可以给负面反馈mir - 124表达(39]。
根据mir - 124的功能注释和mir - 506目标基因,我们的数据表明,微rna - 124,微rna - 506可能参与免疫炎症等相关途径JAK / STAT, NF -κB mTOR和细胞信号通路40]。此外,他们共同的目标蛋白质如AKT3 GRB2, PK3R3, SOCS1, SOCS2,国家管制当局方面,SOCS3, TNF, PDPK1, RELA, PLCG1可以同时控制多个免疫炎症信号通路(41]。总的来说,结果表明表达的增加血清液mir - 124和mir - 506可能与lead-induced炎性损伤中枢神经系统,和其作用的具体机制有待进一步研究。
5。结论
在当前的研究中,人们已经发现,铅暴露导致73年血清microRNA改变液囊,其中48小分子核糖核酸是调节和25个microRNA的表达下调。此外,mir - 124的增加,血清mir - 506液lead-exposed工人被评为高层建议液mir - 124和mir - 506可能参与lead-induced神经炎症的过程。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
施Jianzhu Bo和风扇同样起到了推波助澜的作用。研究设计是由YSZ SL,实验的实现是由JZB FS, XW,黑洞和YZ。结果分析是由JZB和FS。稿件的写作是由JZB、FS和LJZ。所有作者批准了最终版本的手稿。
确认
作者表达自己真诚的感谢华北科技大学的成员对他们的帮助提供设施。这项研究得到了国家自然科学基金,81673208 (YSZ)和81673208号(SL)。