文摘

在全球范围内,储存粮食是容易受到害虫侵扰,对一些作物造成重大经济损失。小麦是世界上最重要的农作物之一。许多吸吮,穿刺昆虫感染小麦谷物的形式或面粉和可能产生的毒性残留对人体健康有害。目前的研究旨在评估四个存储粮食的安全使用昆虫通过评估潜在的基因毒性效应和碎昆虫细胞毒性(t . granarium,美国oryzae,r·多米尼克,t . castaneum)及其面粉残留。MTT和彗星试验进行评估的影响6昆虫粉残留浓度(0、6.5、12.5,25岁,50岁和100%)的小仓鼠肾细胞系(BHK-21)。BHK-21细胞生存能力最低的是表示反对t . granarium(LC50% 36.42μg / ml)紧随其后t . castaneum面粉(LC50% 46.73μg / ml)相比,控制(LC50% 808.2μg / ml)。相当高的DNA彗星(%)的治疗观察t . castaneum面粉(18.8%),美国oryzae小麦(15.6%),t . granarium(15.4%),t . castaneum(13.6%)和t . granarium小麦(13.1%)。红外光谱谱储粮昆虫及其面粉残留识别各种功能性代谢物组,包括炔烃和酚类化合物,可以增强细胞凋亡和基因毒性。t . granarium,t . castaneum和他们的面粉残留最高BHK-21细胞系细胞毒性、基因毒性效应。当前的研究得出结论:昆虫残留在面粉可能对活细胞的细胞毒性和基因毒性的影响,可能影响公众健康,尤其是在消费t . granarium和t . castaneum -出没的面粉。因此,良好的储存谷物和存储他们的产品推荐。

1。介绍

在全球范围内,25%到33.33%的粮食作物,大约50%到60%的谷类作物损失是由于低效率的存储技术(1]。昆虫也严重损害储存谷物的质量。存储粮食害虫优先消耗粮食的胚胎,减少蛋白质含量,导致较低的发芽率。锈红色面粉甲虫(种有害castaneum),较小的颗粒钻(Rhyzopertha多米尼加)、米象(Sitophilus oryzae)是重要的存储粮食害虫,这可能会限制粮食出口通过破坏粮食质量(2]。这些害虫的侵扰增加了粮食种植的成本直接通过农业害虫控制的控制或间接通过象鼻虫散装存储(3]。谷物昆虫分为主要和次要害虫。主要谷物昆虫损害整个完整的谷物,而次要害虫只消耗研磨产品,灰尘,和受损的谷物3]。

农药的应用程序存储粮食害虫管理带来了额外的有毒食品大宗商品和环境威胁。几个动物模型通常用于评估农药的毒性。在活的有机体内模型变得不切实际,因为最新的有关伦理考虑,成本和时间4]。新农药的发现和制造业进一步减少的适用性在活的有机体内模型。因此,在体外细胞培养模型已成为一种有效和迅速的技术评估农药、化工、和药物毒性5]。高级集成基于单元的系统可以有效地调查的完整细胞的化学反应(6]。

多个在体外电池系统开发研究农药毒性(6- - - - - -8]。在体外系统已经成为一个互补的方法识别化学混合物的组成部分和评估生物过程的毒性。我n体外分析快速和便宜的比较传统的动物实验(9]。细胞毒性是一个重要的生物评价技术,它提供了一系列的优点。准确的细胞毒性测量可以有效地识别人类健康风险(10]。细胞毒性的化合物可能会导致细胞凋亡(程序性细胞死亡)和坏死(意外的细胞死亡)在健康细胞。凋亡细胞死亡是慢和基因控制的,而坏死的特点是快速的细胞膜和细胞溶菌作用,导致快速的细胞死亡(11]。最终,细胞增殖减少,导致较低的细胞生存能力(12]。

肾脏积极消除外源性物质从动物的身体13]。因此,一些研究已经证明了肾脏和肝脏细胞培养的重要性毒性筛选之前进行在活的有机体内动物试验(6]。细胞凋亡检测通过荧光双吖啶橙/溴化乙锭染色法被认为是一种准确、快速的技术(14]。吖啶橙可以穿透可行的和不能存活的细胞的质膜与DNA和绑定,发出绿色荧光,而溴化乙锭只能穿透不能存活的细胞和细胞膜破裂与DNA结合,发出红色荧光(15]。代谢过程和环境因素导致细胞DNA损伤率1000 - 1000000分子病变/单元/天。这种病变约60亿基地(30亿个碱基对)的人类基因组和关键基因可能会影响正常的细胞功能,提高癌症的可能性。彗星试验或单细胞凝胶电泳(SCGE)测定,通常应用于测量单个细胞的DNA损伤(16]。受损细胞DNA片段和链组成的优惠是分开下完整的DNA电泳领域,产生了一个经典的“彗星尾”形状在显微镜下。彗星的尾巴是衡量评价DNA损伤程度的视觉或通过使用图像分析软件。这是一个简单而有效的方法来测量受损,修复DNA在细胞水平。带负电荷的DNA片段通过琼脂糖凝胶在电场下拉,这看起来像一颗彗星16]。彗星试验的适用性大大增加在过去二十年的DNA损伤的评估和修复(17]。彗星试验结合了单细胞的细胞遗传学分析和生化检测的DNA单链断裂(链断裂和不完整的切除修复网站),交联,alkali-labile网站(als) [17,18]。

红外(IR)光谱技术被广泛使用由化学家来确定和识别复合结构(19]。化合物的性质不同,由于各种官能团。红外光谱法是一种经济、快速、无损的物理方法普遍适用于结构分析。它也可以被用作一种物理参数确定晶格和诱发实证定性样本之间的关系19- - - - - -21]。

许多人口并不倾向于吃面粉与存储粮食害虫出没,因为他们相信它是不能吃的。也许这是逻辑如果存储粮食昆虫和他们的食物含有有毒残留物。本研究的目的是确定的安全使用四个储粮昆虫通过评估潜在的基因毒性效应和碎昆虫细胞毒性(t . granarium s oryzae r·多米尼克和t . castaneum)及其面粉残留。他们的潜在毒性BHK-21细胞系和DNA均通过MTT,彗星化验,荧光显微镜和红外光谱。

2。材料和方法

2.1。昆虫和文化

Trogoderma granarium,Sitophilus oryzae,Rhyzopertha多米尼加,种有害castaneum成年人在存储产品的部门实验室饲养和谷物害虫、植物保护研究所、农业研究中心Dokki,埃及吉萨金字塔。几代人的昆虫在小麦谷物饲养。小麦谷物消毒在55°C 6 h为消除隐藏在使用前的侵扰。昆虫文化相同的年龄由分别将每个物种的成年人在jar(200毫升)。这些罐子满是棉布衣服,用橡皮筋固定。实验开始,25成年人分别介绍了每个物种到罐子里含有小麦或面粉(500克)和放置在一个孵化器3个月(30±2°C和65±5% R.H)。治疗和控制在类似条件下准备一式三份(22]。三个月后,昆虫出没的小麦和面粉采集样本进行进一步分析。

2.2。细胞系来源

婴儿仓鼠肾细胞系(BHK-21-ATCC®CCL-10™)从组织培养获得单位,VACSERA,埃及吉萨金字塔。

2.3。细胞毒性评估

5-dimethylthiazol-2-yl MTT[3 -(4日)2,5-diphenyl溴化四唑)进行了分析评估细胞生存能力根据Meerloo et al。23]。MEM (H)中用于培养细胞在96 -孔板在37°C和孵化有限公司224小时的孵化器。然后,MEM (H)中补充10%胎牛血清,青霉素(100国际单位/毫升),链霉素(100毫克/毫升)、谷酰胺(3毫米)和25毫米4 - (2-hydroxyethyl) 1-piperazine ethanesulfonic酸(玫瑰),和介质的pH值调整到7.2使用碳酸氢盐溶液。细胞被孵化的37°C下湿大气(95%的空气和5%的有限公司2)[24]。MTT(5毫克/毫升的股票PBS)被添加到每个好,和板块进一步孵化4 h。最后,上层清液被丢弃,DMSO (200μL)温柔地混合到每个好(25]。不同浓度(0、6.25、12.5,25日,50和100μg / ml)准备从细胞含有溶剂。光的强度吸光度是阅读使用酶联免疫吸附试验(ELISA)板读者BioTek (elx - 800)在570 nm和计算如下:细胞存活率(%)=(样本×控制)/控制×100。

2.4。在倒置显微镜下形态调查

细胞治疗在LC50值是48小时孵化并受倒置显微镜(德国卡尔蔡司)10倍的放大。特征的细胞损害如细胞质液泡化和造粒,四舍五入,破裂的细胞,细胞分离板的底部观察形态学变化进行评估。

2.5。细胞凋亡与荧光显微镜分析

细胞apoptosis-related荧光显微镜下形态变化监测(德国徕卡DM LB2)。细胞治疗的双重染色吖啶橙/溴化乙锭(AO / EB),观察到40 x放大(26]。

2.6。彗星试验

单细胞DNA彗星试验进行了研究BHK-21细胞系的DNA链断裂治疗后t . granarium s oryzae r·多米尼克和t . castaneum面粉残留。DNA损伤测量方法后,通过单细胞凝胶电泳辛格et al。(27与一些细微的修改。

2.7。傅里叶变换红外(FTIR)光谱

的官能团t . granarium s oryzae r·多米尼克和t . castaneum冻干水提取物和出没的面粉相比,识别控制治疗通过傅里叶变换红外(ir)(英国《金融时报》/ ir - 6000光谱仪紧凑,JASCO inc .)、日本)。好样品粉末与溴化钾混合(KBr) (Sigma-Aldrich、傅立叶变换红外年级)球团做准备。光谱被记录在一个传输方式从4000到400厘米−1。红外光谱得到干涉图,官能团被确定基于波数和吸收28]。

2.8。统计分析

结果表示为一个均值±SE,治疗和控制条件和重大差异的方差分析比较使用5%概率水平,如果是这样,图基的意思是比较测试使用( )。数据从time-mortality(生存)生物受到非参数生存分析使用σ图软件(版本12.0)获得生存曲线和平均存活时间的估计和计算(50%)致死浓度(毒杀μg / ml)。尾巴的时刻(任意单位)计算如下:DNA迁移长度(像素)×百分比(%)DNA的迁移。

3所示。结果

3.1。种群动态

表1介绍了实验中使用的每个物种的昆虫饲养的3个月后。25每个物种的昆虫分别发布了500克的食品环境,其中包括小麦t . granarium s oryzae和r·多米尼克和面粉t . castaneum。昆虫密度最高的数值(2613)指出T。granarium,紧随其后的是r·多米尼克昆虫(765)t . castaneum昆虫(350)。观察昆虫的最低数值密度(130)美国之后e。

表1
昆虫种群动态的成年后3个月的饲养30°C和65±5右
3.2。细胞毒性评估

表2描绘了面粉和小麦出没t . granarium,美国oryzae,r·多米尼克,t . castaneum及其对BHK-21影响细胞的生存能力(%)。不同浓度的出没的面粉(0、6.25、12.5,25岁,50岁,和100年μg / ml的细胞包含溶剂)被用于每一种昆虫。治疗后的全面降低细胞生存能力。观察细胞的可行性最高的77.03±0.84浓度100%r·多米尼克治疗,其次是74.14±4.61细胞生存能力美国oryzae面粉。观察细胞生存能力最低的31.69±1.86浓度100%t . granarium,紧随其后的是32.56±3.21t . castaneum治疗比参与控制细胞(conc.0)可行的(100%)。

表2
小仓鼠肾细胞系(BHK-21)可行性(%)在不同浓度的储粮昆虫出没的面粉以及IC的决心50%。

集成电路50(%)值的计算治疗BHK-21细胞如表所示2。治疗(昆虫和它们的分泌物)与更高的集成电路50(%)值较低的细胞毒性和安全比其他治疗方法。最低的集成电路50(%)的价值t . granariumBHK-21细胞治疗方法证明这是最具破坏性的昆虫。提出高毒性细胞(36.42μg / ml),紧随其后的是集成电路50(%)t . castaneum使用的面粉(46.73μg / ml)和IC50(%)t . castaneum(65.04μg / ml)。美国oryzae和r·多米尼克(昆虫和出没的面粉)引起的细胞毒性,最低的是410.30,376.1和138.5μg / ml,分别,而积极的控制面粉处理(808.2μg / ml)。

3.3。细胞形态在倒置显微镜下

形态调查发现各种异常处理细胞(数字1和2)。异常主要包括细胞的恶化,减少细胞壁,缺乏细胞在某些领域相同的文化美国oryzae和r·多米尼克治疗方法。此外,未能执行他们的功能细胞由于细胞的渗透和出血后细胞壁的破坏。细胞收缩和气泡的形成在细胞表面也指出,最终导致凋亡的产生。同时,这些机构的形成t . granarium和t . castaneum表明细胞死亡而正常细胞。


图1
小仓鼠肾细胞的形态学(BHK-21cell线)接触后倒置显微镜下储存谷物昆虫。(1)正常细胞(控制),(2)t . granarium处理细胞,(3)美国oryzae处理细胞,(4)r·多米尼克处理细胞,(5)t . castaneum处理细胞。

图2
小仓鼠肾细胞的形态学(BHK-21细胞株)接触后倒置显微镜下insect-infested面粉。(1)细胞治疗uninfested面粉(控制),(2)细胞治疗t . granarium使用的面粉,(3)细胞治疗美国oryzae使用的面粉,(4)细胞治疗r·多米尼克使用的面粉,(5)细胞治疗t . castaneum使用的面粉。
3.4。荧光显微镜的细胞凋亡

可行的只有AO细胞染色与一个完整的结构,明亮的绿色而AO-stained早期凋亡细胞细胞核中描绘一个明亮的绿色区域t . castaneum治疗(图3和4)。AO和EB-stained晚期凋亡细胞出现红橙色的冷凝可见染色质致密橙色区域t . granarium治疗(图4)。


图3
小仓鼠肾细胞凋亡(BHK-21细胞株)接触后在荧光显微镜下储藏的谷物昆虫。(1)正常细胞(控制),(2)t . granarium处理细胞,(3)美国oryzae处理细胞,(4)r·多米尼克处理细胞,(5)t . castaneum处理细胞。

图4
小仓鼠肾细胞凋亡(BHK-21细胞株)接触后在荧光显微镜下insect-infested面粉。(1)细胞治疗uninfested面粉(控制),(2)细胞治疗t . granarium使用的面粉,(3)细胞治疗美国oryzae使用的面粉,(4)细胞治疗r·多米尼克使用的面粉,(5)细胞治疗t . castaneum使用的面粉。
3.5。DNA彗星试验

表3演示了彗星的量(%)在小鼠的肾脏细胞暴露于储粮昆虫及其感染面粉。米象(最大的细胞被观察到美国oryzae)使用的面粉治疗。最高的观察DNA损伤t . granarium治疗,而t . castaneum使用的面粉治疗造成了至少彗星剥离强度(%),紧随其后美国oryzae。t . granarium(昆虫和出没的面粉)和治疗t . castaneum治疗表现出最高强度的彗星分离细胞核,由白色箭头标志(图5)。温和的其他治疗观察彗星剥离强度控制和正常细胞相比,由蓝色箭头标记。这些细胞的细胞核,由绿色箭头标记。

表3
小仓鼠肾细胞的DNA彗星试验(BHK-21细胞株)在暴露于储粮昆虫和面粉。

图5
彗星试验图像的小仓鼠肾细胞(BHK-21细胞株)接触后存储谷物昆虫。(1)正常细胞(控制),(2)t . granarium处理细胞,(3)美国oryzae处理细胞,(4)r·多米尼克处理细胞,(5)t . castaneum处理细胞。绿色箭头代表完整的细胞核,白色箭头表示高度的伤害,和蓝色箭头代表低程度的损害。

数据5和6演示彗星assay-based BHK-21肾细胞DNA损伤造成的存储粮食昆虫。损伤的程度不同的治疗方法估计和用箭头标记。


图6
彗星试验图像的小仓鼠肾细胞(BHK-21细胞株)接触后insect-infested面粉。(1)细胞治疗uninfested面粉(控制),(2)细胞治疗t . granarium使用的面粉,(3)细胞治疗美国oryzae使用的面粉,(4)细胞治疗r·多米尼克使用的面粉,(5)细胞治疗t . castaneum使用的面粉。绿色箭头代表完整的细胞核,白色箭头表示高度的伤害,和蓝色箭头代表低程度的损害。
3.6。红外光谱分析

红外光谱分析进行了描述红外活性官能团t . granarium,美国oryzae,r·多米尼克和t . castaneum冻干溶液提取并各自出没的面粉。uninfested面粉作为控制。红外光谱分析的结果提出了数字7和8和表4。结果表明碳氢键的存在(烷烃)、地(醇类和酯类),h(酰胺),C≡N(亚硝酸盐),C꞊O(酰胺和酮),切断(醚),C = O(酐),没有2(硝基化合物),R-S-H(硫醇)C-Cl(芳基氯),C-Br(芳基溴化)和我(芳基碘)昆虫和各自出没的面粉(表4)。图7表明,t . granarium,美国oryzae,r·多米尼克,t . castaneum治疗提出了不同峰值620厘米不等−1到3276厘米−1。广泛吸收峰值为3331厘米−1和1630厘米−1与h振动弯曲胺和拉伸C = C共轭烯烃,分别为(29日]。在620厘米宽峰−1烯烃的C = C弯曲,而达到3277厘米−1代表的拉伸- h胺和地组蛋白(30.]。红外活性官能团insect-infested面粉更集中在指纹区(< 3250 > 900厘米−1比uninfested控制)。红外活性官能团insect-infested面粉包括-哦,(酚和羧酸),h(酰胺和胺)、氮(腈),C≡C(炔烃)·hc·C = O和꞊O(醛、羧酸、酯、酰胺和酮),氟(芳基氟化),切断(酯、醚和苯酚),C-Cl(芳基氯)和我(芳基碘),如(图所示8和表4)。参与谷物(控制)包含碳氢键(炔烃)、地(酚和羧酸),h(酰胺和胺),切断(酰胺和酮)、氮(酰胺),氟(芳基氟化),切断(酚和酯),我(芳基碘),C-Br(芳基溴化)和C-Cl(芳基氯)官能团。


图7
红外光谱的储藏的谷物昆虫。(1)t . granarium处理细胞,(2)美国oryzae处理细胞,(3)r·多米尼克处理细胞,(4)t . castaneum处理细胞。

图8
红外光谱的insect-infested面粉。(1)细胞治疗uninfested面粉(控制),(2)细胞治疗t . granarium使用的面粉,(3)细胞治疗美国oryzae使用的面粉,(4)细胞治疗r·多米尼克使用的面粉,(5)细胞治疗t . castaneum使用的面粉。
表4
特征官能团的红外光谱吸收峰 。

4所示。讨论

研究显示数值密度最高T。granarium经过3个月的饲养在正常情况下比其它昆虫。这些结果符合一项研究的结果(31日]。他们说的人口增长t . granarium(35°C) 10 - 250倍,其他存储粮食的昆虫。因此,它被认为是一个危险的储存粮食害虫。莫里森et al。32)也报道t . granarium作为一个经济破坏性的害虫的存储产品隔离在美国。

肾脏积极消除外源性物质的身体。因此,BHK-21细胞系(小仓鼠肾细胞)是本研究评估中使用的四个重要的有毒影响存储粮食害虫(13]。多项研究已经证实肾脏和肝脏细胞培养可以作为有效的工具毒性筛选之前进行动物性在活的有机体内调查(6]。T。granarium治疗(昆虫或出没的面粉)提出了细胞毒性值最高,其次是t . castaneum。形态学检查和细胞凋亡测定显示cytotoxicity-related细胞异常,其中包括细胞的形状不当,形成明亮的绿色皮肤细胞核,细胞质橙色的细胞,细胞和细胞程序性死亡与正常细胞相比,对待uninfested面粉(控制)。细胞壁破裂,胞质变化颜色,和细胞分离的控制中,并未观察到细胞(28]。

t . granarium和t . castaneum治疗细胞表现出最大的彗星出现明确在细胞核DNA分离。严格控制细胞附着在核没有彗星形成。治疗的细胞毒性细胞可以归因于昆虫的腺分泌物在食品作为一种防御机制,它在昆虫。几项研究已经建立了苯醌作为防御工具的存在在面粉出没t . castaneum(33,34),r·多米尼克(35),而美国oryzae(36]。被刺,哈桑37)报道,t . castaneum和T。granarium侵扰,更对人类肺部和皮肤细胞的毒性。

Saquib et al。38甲拌磷)的细胞毒性和坏死的影响(有机磷杀虫剂)暴露对人类羊膜上皮细胞(希望)。同样,虫害会对目标生物体产生细胞毒性和遗传影响通过闻、触摸,或吃东西。这些发现强调了安全储粮的必要性保持质量,避免虫害。的国家,t . granarium已经宣布检疫害虫,高效的监控工具应用在港口和国际机场柜台的持续威胁吗t . granarium入侵(39]。

密切与参与谷物(控制)描述,切断(醚),C-Cl(芳基氯)和我(芳基碘)官能团位于指纹区主要是负责面粉被感染的细胞毒性昆虫(图四个存储粮食8)(表4)。活性成分的化学成分的基础上,结合(40)细胞凋亡分为四个主要的组(有机氯、酚类、生物碱类和酒精)。有趣的是,红外高峰在3200年,995,< 840厘米−1与氧化应激和基本层(28,29日,41]。红外光谱光谱发现的官能团在四个储粮昆虫可以负责对仓鼠肾细胞的细胞毒性和基因毒性的影响。

红外光谱采用红外线监控化学分子的官能团之间的相互作用。红外线产生的可预测的振动来表达化学或生物化学物质的“指纹”特征的样本。这种技术方便,成本效益,并迅速提供准确和可靠的结果19,42,43]。使用红外光谱法分析食品和乳制品显著增加,而小型化的要求,更好的仪器,现场分析能力快速结果(28,44]。乳制品样品的红外光谱主要涵盖两个方面:(1)量化质量浓度和纯度的参数和(2)测试,掺假,身份。一些乳制品研究人员正在努力扩大该技术在工业水平的作用。主要的焦点是为了更好地理解变化的乳制品,微生物种群,原料的处理和优化过程中对安全、统一的产品质量(21,28]。

5。结论

当前的研究阐述了四个重要储粮昆虫的毒性及其面粉通过MTT测定残留,彗星试验和红外光谱谱。这项研究进一步建立代谢物官能团的存在,包括烯烃和酚类化合物,可促进细胞凋亡和基因毒性。因此,可以得出结论,昆虫残留在面粉可以对活细胞有细胞毒性、基因毒性影响,可能影响公众健康,尤其是在消费t . granarium和t . castaneum使用的面粉。因此,良好的储存谷物和存储他们的产品推荐。未来的研究需要确定小学和中学化学成分负责细胞毒性和基因毒性在面粉上爬满了这些类型的害虫。

数据可用性

所有的数据都包含在这篇文章。

伦理批准

研究按照声明的植物保护研究所、农业研究中心,Dokki, 12619年,埃及吉萨伦理委员会。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

平方和NA负责概念化;NA和呃负责方法;NA和呃负责正式分析;平方,NA,嗯负责调查;NA是负责撰写和准备手稿;平方是负责撰写和审查和编辑手稿;平方,NA负责监督;平方是负责项目管理和资金收购。所有作者阅读和同意发布版本的手稿。

确认

作者要感谢院长以来嗯Al-Qura大学科学研究(授予代码:22 uqu4281560dsr05)。