文摘

兵,一个细胞外signal-regulated蛋白激酶,参与各种生理反应,如细胞增殖和分化、细胞形态学维护、细胞骨架结构,细胞凋亡,细胞癌变。在这项研究中,我们关注ERK通路在细胞损伤和autophagy-associated适应性反应在尿protein-irritated肾小管上皮细胞并探索潜在的机制。通过使用抗氧化剂防治和过氧化氢酶,我们发现ERK通路被激活一个活性氧(ROS)接触后尿蛋白依赖机制。更重要的是,ERK抑制剂U0126可以降低中性粒细胞释放gelatinase-associated lipocalin (NGAL),肾损伤molecule-1 (KIM-1)和尿蛋白,引起的凋亡细胞的数量显示ERK通路的损害效应在HK-2调解细胞损伤和凋亡细胞。有趣的是,我们还发现,microtubule-associated蛋白的表达增加1轻链3 (LC3)——(自噬的一个关键标志)和减少表达p62(自噬衬底)引起的尿蛋白被U0126逆转,表明自噬激活ERK通路。此外,雷帕霉素降低尿protein-induced NGAL KIM-1分泌和细胞生长抑制,而氯喹相反的效果,表明自噬激活ERK通路是一种适应性反应的接触尿蛋白。综上所述,我们的研究结果表明,激活ROS-ERK通路诱导细胞损伤,同时可以提供一个autophagy-associated尿protein-irritated肾小管上皮细胞的适应性反应。

1。介绍

肾小管上皮细胞损伤阻力指标纤维化,也许可以是中央的病理生理学的强烈与肾功能的下降(1- - - - - -3]。尿蛋白,肾小球疾病的病理产物,也是一个重要因素导致肾小管上皮细胞损伤。实践证明导致细胞凋亡,导致肾小管上皮细胞的分离从基底膜,最后失去功能的肾小管4,5]。不幸的是,肾小管上皮细胞损伤的潜在机制引起的尿蛋白仍不清楚,限制了研究有效治疗。因此,它具有十分重要的意义,进一步探讨尿protein-induced细胞损伤的机制。

的重要方法之一,尿蛋白会导致细胞损伤是通过提升生产活性氧(ROS) (6]。此外,ROS调节各种细胞信号通路,如ERK通路(7]。与Ras /皇家空军/ MEK / ERK的磷酸化级联、ERK通路被激活,参与调节多种细胞过程,包括增殖、分化转移,自噬和凋亡[8- - - - - -10]。然而,ERK通路在肾损伤的作用直到现在仍然是有争议的。ERK通路是各种疾病的致病因素模型,如囊性肾脏疾病(11],肾结石[12),单侧输尿管梗阻肾脏(13,14]。更直接,帝国等人表明,ERK通路介导的albumin-induced毒性tec (15]。相比之下,Takase等人证明了ERK通路可以作为一个重要的tec prosurvival因素下蛋白质过载(16]。和最近的研究证实ERK pathway-mediated自噬引起的足突细胞损伤保护在脂多糖(17]。鉴于ERK通路的各种功能,我们推测,它可能同时在同等条件下扮演不同的角色。因此,研究的目的是确定的确切作用在肾小管上皮细胞ERK通路激怒通过尿蛋白,并提供一个理论依据肾损伤的治疗引起的尿蛋白。

2。材料和方法

2.1。尿蛋白的提取

如前所述(硫酸铵沉淀法18)被用来提取尿蛋白治疗患者病理诊断为微小病变性肾病综合症(价值)。

2.2。细胞培养和治疗

人类近端管HK-2细胞(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)是维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Gibco,大岛,纽约)补充10%胎牛血清(Gibco)在标准条件下。这些细胞被使用(NAC) 10毫米防治(Beyotime生物技术研究所、江苏),2000 U /毫升过氧化氢酶(Beyotime生物技术研究所、江苏)10μM U0126(σ,圣路易斯,密苏里州)10μ米雷帕霉素(Calbiochem拉霍亚、钙、美国),和10μM氯喹(σ)之前的尿蛋白(8 g / l)。细胞ROS生产以2 h, LC3的表达和P62量化在8 h。嗜中性粒细胞的水平gelatinase-associated lipocalin (NGAL)和肾损伤molecule-1 (KIM-1)分泌测试在12 h Quantikine™工具(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。凋亡细胞的数量在48小时化验。和p-ERK和t-ERK量化的表达在不同的时间点。

2.3。流式细胞术分析

细胞凋亡测定和细胞ROS生产使用流式细胞仪检测。所有细胞在各种实验条件下收获在48 h与文化解决方案包含0.05胰蛋白酶和PBS冲洗。细胞凋亡是由AnnexinV-FITC凋亡检测设备(Dojindo、熊本、日本)与流式细胞仪制造商的协议后石中剑流式细胞分析仪(BD FACSCanto二世,圣何塞,CA)。ROS测量,HK-2细胞孵化DMEM包含10μ米2 - - - - - -7 - - - - - -二乙酸Dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA、Beyotime生物技术研究所、江苏)30分钟在黑暗中。然后,收获细胞使胰蛋白酶化和resuspended PBS。荧光是由流式细胞仪石中剑流式细胞分析仪(BD FACSCanto二世,圣何塞,CA)。

2.4。免疫印迹

自噬的反应和ERK通路都是通过免疫印迹检查。孵化的末尾,细胞与PBS和细胞溶解冰洗15分钟1×里帕裂解缓冲。的媒体和细胞溶解产物在13000 rpm离心机在4°C 15分钟颗粒细胞碎片,和细胞蛋白质的浓度决定用BCA试剂。与相同浓度的细胞蛋白质样品混合5×示例缓冲区和加热10分钟的95°C和12% sds - page凝胶分离。样品被转移到聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔,Billerica的)。阻塞后5%脱脂牛奶2 h,一夜之间,细胞膜被孵化与兔抗体针对microtubule-associated 4°C蛋白1轻链3 (LC3)——(σ,圣路易斯,密苏里州),p62 / SQSTM1(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA), p-ERK(细胞信号技术,丹弗斯,MA)和t-ERK(细胞信号技术,丹弗斯,MA)。洗后,探讨了膜与HRP-conjugated二级抗体(Beyotime生物技术研究所、江苏)在室温下1小时。免疫反应性的乐队可视化使用ECL +免疫印迹检测系统(皮尔斯,罗克福德,IL)。

2.5。细胞生存能力分析

细胞培养与5毫克/毫升甲基噻唑基四唑(MTT)解决方案(Calbiochem) 4 h在37°C。甲瓒晶体溶解在二甲亚砜。光密度是决定在570纳米板读者(热Labsystems Multiskan MK3,上海,中国。

2.6。统计分析

所有统计测试用SPSS 16.0进行。Shapiro-Wilk测试用于检测变量的常态。所有数据都表示为 的意思(S.E.M.)。多个组使用方差分析进行了比较,其次是Bonferroni事后测试。价值被认为是统计学意义如果小于0.05。

3所示。结果

3.1。tec ERK通路是由氧化应激激活后暴露在尿蛋白

在这项研究中,我们第一次评估活动的ERK通路通过检查磷酸化ERK的表达(p-ERK),激活ERK通路的一个重要标志。如图1,p-ERK的表达显著增加tec治疗后尿蛋白2 h,显示ERK通路的激活后尿蛋白过载。与此同时,我们发现活性氧产量显著升高。随后,澄清ERK通路激活和活性氧过剩之间的关系,我们进行蛋白质过载HK-2细胞抗氧化剂(南汽和猫)。流式细胞术和免疫印迹结果表明p-ERK的表达降低与抗氧化剂的应用。总的来说,这些结果表明,ERK通路激活在urinary-treated tec和ROS-dependent介导的机制。

3.2。ERK通路激活参与尿Protein-Induced TEC受伤

因为之前有研究表明,暴露在尿蛋白导致受伤甚至HK-2细胞凋亡,然后我们打算进一步探讨ERK通路是否负责任的过程。首先,抑制效应的ERK抑制剂U0126 ERK通路被免疫印迹检测。如数据所示2(一个)和2 (b),U0126预处理能有效地抑制p-ERK的表达,表明有效堵塞U0126激活ERK通路。然后,我们评估了早期和晚期凋亡的耦合与FITC染色膜联蛋白V和π。结果表明,ERK抑制剂可以减弱细胞凋亡引起的尿蛋白(数字2 (c)和2 (d))。此外,U0126减少的水平管损伤标记NGAL KIM-1,与尿蛋白刺激(增加数据2 (e)和2 (f))。这些结果表明,ERK通路激活引起的尿蛋白导致HK-2细胞损伤和凋亡细胞。

3.3。自噬ERK通路曝光后引发的反应是tec尿蛋白

正如我们先前的研究发现,细胞自噬被暴露在尿蛋白,激活ERK通路的确切作用在自噬激活在本研究进一步探讨。如图3,p62没有重大变化但LC3-II的数量显著增加接触尿蛋白8 h后,表明自噬的激活。然而,这些影响可能是通过抑制消除与U0126 p-ERK的表达,表明自噬激活通过尿蛋白绝对是ERK通路相关的。

3.4。自适应自噬反应减轻TEC损伤引起的尿蛋白

我们下一个评估自噬在TEC损伤的作用。众所周知,雷帕霉素自噬流量增加,而氯喹街区自噬途径。因此,雷帕霉素或氯喹是否影响尿protein-induced细胞损伤检查。我们发现增加NGAL KIM-1释放(数字4(一)和4 (b))和生长抑制(图4 (c))减少了雷帕霉素,而相反的结果与氯喹在评估KIM-1分泌。这些发现表明,自噬反应激活ERK通路是自适应,因为它可以减弱肾小管损伤引起的尿蛋白。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,ERK通路被激活ROS-dependent机制TEC细胞暴露于尿蛋白。更重要的是,它被证明在细胞损伤扮演双重角色。一方面,它直接导致细胞损伤;另一方面,它可以诱发自适应自噬对减轻细胞损伤。ROS-ERK途径的复杂性在TEC细胞尿蛋白过载条件下首次澄清。

ERK通路参与各种细胞过程(19]。在目前的研究中,结果表明,一旦ERK活性抑制,尿protein-induced TEC细胞凋亡和释放的因素导致肾损伤减少,显示ERK通路的不利作用的过程。然而,专门ERK通路介导细胞损伤的机制目前还不清楚;它可能与线粒体功能障碍(20.,21]或抑制Akt通路的阳性细胞生存(22]。值得注意的是,ERK抑制剂U0126未能完全阻止尿protein-induced细胞损伤,表明non-ERK途径也可能参与调节尿蛋白的毒性。

之前的研究表明,尿蛋白可以诱导内质网应激在tec和线粒体功能障碍,导致大量的活性氧产量(23,24]。作为一种重要的细胞内信使,活性氧激活ERK通路通过刺激EGF和PDGF受体(25,26]或通过氧化C118残留在Ras直接27]。与此同时,ROS能抑制ERK-specific磷酸酶活性和降低磷酸化ERK的退化(25]。与这些研究一致,我们的研究发现,虽然尿蛋白刺激大量活性氧的生成,在tec tec的ERK通路被激活。此外,体外抑制剂量的ROS,南汽,猫可以阻断ERK的活化。这些结果让我们得出这样的结论:氧化应激引起的尿蛋白对ERK途径激活是极其重要的。

ERK通路一直被认为是一个重要的监管途径对细胞自噬28]。小王和曾庆红有插图,ERK通路可以诱导自噬通过Beclin 1 (29日,30.)因此,我们断定,ERK通路参与了自噬的行为和证实这个假说通过蛋白质超负荷养殖tec的典范。使用实验方法符合我们之前的研究,我们发现LC3-II的表达明显增加,与自噬的表达基质p62 ERK途径激活后下降。p62是有选择地纳入自噬小体,并有效地通过自噬降解,p62表明自噬降解的减少表现不会受ERK通路的影响。与此同时,积累LC3-II表明自噬激活(14]。然而,LC3-II剂量的增加是恢复和刺激U0126下p62回到正常水平,这有效地抑制ERK通路。这些结果表明,自噬的激活引起的尿蛋白至少部分地依赖于ERK通路。越来越多的文章证实真相,增加细胞内自噬致病因素可能会影响部分战斗细胞损伤,提高细胞存活率(31日,32]。与之前的研究一致,当自噬流量提升了雷帕霉素,KIM-1和NGAL的排泄减少,尽管增加细胞增殖。与此同时,细胞损伤往往是自噬通路被氯喹时加重。因此,我们的研究结果表明,ERK通路的激活唤醒自适应自噬响应下尿蛋白刺激。

研究人员报道,凋亡细胞的行为依赖于持续激活ERK在一段时间内(33),细胞凋亡可能加剧激活ERK信号传递到细胞核的时候(34]。具体来说,在细胞质中ERK激活消息会诱导自噬(17]。因此,我们相信,当刺激,尿蛋白,在细胞质中ERK通路将激活一个autophagy-related通路并启动一个autophagy-associated适应性反应。然而,在持续的刺激下尿蛋白,激活ERK信号的细胞质中有可能重返核。这可能减弱自噬和细胞抵抗损伤的能力。此外,核的激活ERK将联系apoptosis-related通路,导致细胞凋亡。在没有外部干预,持续的尿蛋白最终会损害tec通过ERK通路。,上述结果表明,活化时间和/或地点的具体监管ERK通路可能会提供一种新颖的治疗机会在几乎所有的中小学肾病尿蛋白过度,尤其是糖尿病肾病。然而,这项研究的结果仍不足以解释tec ERK通路的作用和机制。例如,脚手架蛋白可以加速这个通路的激活,然后参与调节信号的可持续性和强度(35]。因此,需要更多的信息来解释ERK通路。

5。结论

总之,我们的研究表明ROS-ERK通路是一把双刃剑,当刺激尿蛋白。它能诱发TEC受伤,同时提供一个autophagy-associated适应性反应(图5)。因此,精确调控的途径可能是一种很有前途的目标病人患有TEC损伤引起的尿蛋白。

缩写

兵:	细胞外signal-regulated蛋白激酶
KIM-1:	肾损伤molecule-1
NGAL:	中性粒细胞gelatinase-associated lipocalin
ROS:	细胞活性氧
侦探:	肾小管上皮细胞
LC3:	Microtubule-associated蛋白质1轻链3
南京:	防治作用
猫:	过氧化氢酶
说唱:	雷帕霉素
CQ:	氯喹
反对:	控制
:	尿蛋白。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

建昆邓小平和Xueqin张了同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家重大科技专项项目“重大新药发展”(批准号2017 zx09304019)和中国国家自然科学基金(号。81570656,81670654,81874443)。