文摘

我们评估ranirestat,醛糖还原酶抑制剂,在糖尿病性白内障和自发糖尿病神经病变(DN)鸟居(SDT)大鼠与epalrestat相比,积极控制。动物被分成治疗组和每天一次口服ranirestat(0.1, 1.0, 10毫克/公斤)或epalrestat(100毫克/公斤)40周,正常Sprague-Dawley老鼠,老鼠和未经处理的SDT。镜头不透明是得分从0(正常)到3(成熟白内障)。合并后的分数(6)从两个镜头每个动物的总代表。DN是评估通过测量运动神经传导速度(MNCV)坐骨神经。山梨醇和果糖含量测量透镜和坐骨神经40周后糖尿病发病。白内障发展更多的未经处理的老鼠比正常老鼠( )。Ranirestat显著( )抑制白内障快速发展;epalrestat没有。Ranirestat显著逆转MNCV下降(40.7±0.6 m / s)在SDT老鼠存在剂量依赖的相关性( )。Epalrestat也扭转了阻止MNCV减少( )。山梨糖醇含量在SDT鼠坐骨神经显著增加(2.05±0.10 nmol / g), ranirestat显著抑制剂量依赖性,( ,< 0.01,< 0.01);epalrestat没有。Ranirestat防止DN和白内障;epalrestat防止DN。

1。介绍

全球糖尿病最近已经几乎达到流行水平。与糖尿病相关的主要问题是它的并发症,是糖尿病性视网膜病变(DR)和白内障,糖尿病神经病变(DN)和肾病。博士是一个成人视力丧失和失明的主要原因(1]。临床试验表明,强化血糖控制减少博士的发病和进展(2,3]。其他代谢因素,如血压(4和高脂血症5,6博士),也会影响发展的多因子的密集治疗这些代谢紊乱和高血糖的预防糖尿病的并发症。然而,许多患者仍出现严重并发症,尽管最近的各种新的抗糖尿病的药物。

很少有药物可以直接防止糖尿病并发症独立于血糖水平。高血糖附带的代谢变化,如增加活动的多元醇通路7),激活的蛋白激酶C (PKC) [8),增加氧化应激(9),白细胞粘附到内皮细胞(10),和积累先进的糖化终端产品(年龄)11),被认为是相关的开发和发展糖尿病并发症包括眼部并发症。特别是,多元醇通路强烈与其他相关并发症包括氧化应激,PKC激活,年龄积累导致诱导血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是最重要的因素,诱发视网膜新生血管形成。因此,多元醇通路是最具吸引力的目标进行辅助治疗,防止糖尿病眼部并发症和DN。多元醇通路中的关键酶是醛糖还原酶(AR),发现在视网膜上,镜头,和周围神经的雪旺细胞12];AR抑制剂(阿里斯)已报告减缓视网膜毛细血管基底膜的增厚和糖尿病性白内障的实验研究进展13]。基于良好的结果在实验研究中使用阿里斯[14),阿里的一个临床试验,sorbinil,进行15),但相关的药物没有抑制作用的发展,博士和热情减退眼部并发症的临床应用。然而,我们先前的研究显示阿里的一个强有力的预防效果,fidarestat,博士的发展自发糖尿病鸟居(SDT)大鼠(16]。我们最近证实,新开发的阿里,ranirestat更有效预防发展博士在SDT老鼠17]。在目前的研究中,我们评估的影响ranirestat白内障和DN SDT老鼠与商用epalrestat相比。

2。方法

2.1。动物

保健和处理动物是按照视觉和眼科学研究协会声明使用动物在眼科和视觉研究和有望医科大学动物保健和使用委员会。男性SDT老鼠和Sprague-Dawley (SD)老鼠从克丽,获得公司(日本东京)。所有SDT老鼠证实基于nonfasting糖尿病血糖浓度超过350 mg / dL。所有的老鼠被喂食标准的鼠粮(CRF-1、东方酵母,Inc .,东京,日本)有或没有阿里。ranirestat-treated老鼠治疗一次每日口服ranirestat;epalrestat-treated老鼠喂养食物含有epalrestat在糖尿病的发病;和SD大鼠和未经处理的SDT老鼠喂养食物没有阿里。Epalrestat, ARI商用在日本,作为一个积极的控制。

动物被分为六组:正常SD大鼠( ),未经处理的SDT老鼠( ),ranirestat-treated(0.1毫克/公斤/天40周)SDT老鼠( ),ranirestat-treated(1.0毫克/公斤/天40周)SDT老鼠( ),ranirestat-treated(10.0毫克/公斤/天40周)SDT老鼠( )和epalrestat-treated(100毫克/公斤/天40周)SDT老鼠( )。

2.2。测量体重、血糖和糖化血红蛋白

体重、血糖和糖化血红蛋白(HbA1c)每月测定一次。从尾静脉血样采集nonfasting老鼠测量血糖和糖化血红蛋白。血糖测定葡萄糖分析器(Antosense Bayer-Sankyo,东京,日本)。糖化血红蛋白测定使用自动化glycohemoglobin分析仪(hlc - 723 V迷奸,Tosoh公司,东京,日本)。

2.3。眼部组织病理学

下深麻醉诱导的腹腔内注射戊巴比妥钠(25毫克/公斤体重,戊巴比妥钠,Dainihonseiyaku,大阪,日本),眼睛是无核的常规组织病理研究和放置在一个固定剂(Kurabo上缀ky - 500年,日本)。0.1%的固定眼睛洗mol / L甲次砷酸盐缓冲和嵌入在石蜡。石蜡块被切割4μm和苏木精和伊红染色为常规病理检查。免疫组织化学过程是基于标准avidin-biotin辣根过氧化物酶的方法使用每个抗体和发展原子能委员会衬底发色体(美国DakoCytomation Carpinteria, CA)。Nε(羧甲基)赖氨酸(CML)是应用单克隆抗体对人类年龄(1:50稀释CML,转基因Inc .熊本,日本)。牛血清作为主要抗体-控制免疫染色。

2.4。活组织镜检查的白内障

学生们完全扩张局部眼科的解决方案包含tropicamide 5%,盐酸去氧肾上腺素5%,和前部分包括镜头在两只眼睛观察和拍摄的老鼠。镜头不透明的程度分级如下:0,清楚普通镜头;1,轻微的皮质层的不透明度;2、皮质层中的扩散不透明;3、成熟的白内障。每个动物的不透明度得分的镜头被添加和之和作为双眼白内障总分(- 6)。Biomicroscopic裂隙灯检查15岁和40周后发病的糖尿病。

2.5。测量运动神经传导速度(MNCV)

大鼠坐骨神经的MNCV测量使用相同的方法,以前的报告(18]。老鼠被克制的卧姿,氟烷气体连续吸入麻醉的2.5%。一个常数37.5°C到38.5°C的直肠温度由温度控制系统保持(日本Kohden作为——1100年,日本东京)。右侧坐骨神经作为近端刺激点(S1)和右胫骨的脚踝地区神经作为远端刺激点(S2)。一个活跃的电极针(负)被插入在S1和S2,和一个参考电极(积极)插入约1厘米从S1向脊柱。记录,积极和参考电极都浅插入正确的足底肌肉。使用一个诱发电位检测器(meb - 7202,日本Kohden), S1和S2与单一矩形脉冲(刺激持续时间,0.1毫秒;当前:超大的,1.0 - -4.2 mA)和动作电位的变化都被记录下来。近端和远端延迟从S1和S2的刺激,分别上升的动作电位( 和 分别在ms)和S1和S2之间的距离( 在毫米)测量。当时MNCV计算使用以下方程: 。

2.6。山梨糖醇的测定和果糖

老鼠与50毫克/公斤的腹腔内戊巴比妥钠麻醉(美国雅培,雅培公园,IL),和坐骨神经,镜头,和视网膜被移除时,及时与液氮冷却,并存储在−50°C。山梨醇和果糖含量坐骨神经和镜头组织是由梁的方法等。8]。镜头和坐骨神经是均质和水的浓度为10毫克/毫升,提取与甲醇和离心机(4°C, 10000 rpm, 1分钟)。一毫升的上层清液应用于InertSep SAX / SCX 1(50毫克/ 50毫克/毫升)筒(GL科学公司,东京,日本)。下,洗出液蒸发干燥氮气流在40°C。残留于200年解散μ乙腈/水混合物的L (9: 1, v / v)。然后山梨糖醇,果糖含量测定的LC / MS / MS系统包括一个SIL-HTC LC-10A(日本岛津公司集团,日本京都)和API4000串联质谱仪(美国应用生物系统公司/ MDX SCIEX, MA)与大气压化学电离。列和autosampler气温35°C和10°C,分别。分离是一个CAPCELL PAK NH2 UG80 (5μ米,4.6毫米 mm L。,Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) using a mixture of 0.1% dichloromethane-acetonitrile/water (90/10, v/v) at a flow rate of 1 mL/min. The analytical run time was 18 min. The monitored ion was used for 217 m/z → 181 m/z for sorbitol and 215 m/z → 179 m/z for fructose.

3所示。结果

3.1。体重、血浆葡萄糖和血糖血红蛋白

数据1,2,3显示重量的变化、血糖和糖化血红蛋白在实验。与SD大鼠相比,SDT老鼠明显( )轻有或没有阿里治疗。平均血糖水平和糖化血红蛋白水平的SDT老鼠明显( )高于SD大鼠。然而,没有显著差异之间的血糖和糖化血红蛋白水平SDT老鼠有或没有治疗。阿里斯并不影响血糖控制。因此,我们并不认为血糖效应在这个研究。


图1
实验期间体重。SD大鼠比SDT老鼠重有或没有治疗。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。

图2
实验期间血浆葡萄糖水平。SD大鼠的平均血糖水平显著低于SDT老鼠有或没有治疗。等离子体水平没有显著差异在SDT老鼠有或没有治疗。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。

图3
糖化血红蛋白水平在实验。SD大鼠的平均糖化血红蛋白水平明显低于SDT的老鼠有或没有治疗。没有显著差异的糖化血红蛋白水平在SDT老鼠有或没有治疗。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。
3.2。白内障患病率

数据4和5显示总白内障得分在15 - 40周。白内障的发病率在未经处理的SDT 15周大鼠( )与正常SD大鼠( )( ,Wilcoxon rank-sum测试)。减少白内障发展ranirestat-treated SDT老鼠在15周( 0.1毫克/公斤/天; 1毫克/公斤/天; ,10毫克/公斤/天)比未经处理的SDT老鼠( ,Wilcoxon rank-sum测试)。Epalrestat ( 100毫克/公斤/天)并没有阻止白内障发展SDT老鼠。同样,白内障的发生率在未经处理的SDT 40周更大鼠( )与正常SD大鼠( )( ,Wilcoxon rank-sum测试)。减少白内障ranirestat-treated SDT开发的老鼠在40周( 0.1毫克/公斤/天; 1毫克/公斤/天; ,10毫克/公斤/天)比未经处理的SDT老鼠( ,Wilcoxon rank-sum测试)。Epalrestat ( 100毫克/公斤/天)并没有阻止白内障发展SDT老鼠。


图4
白内障总得分在15周。的总得分白内障治疗SDT老鼠在15周明显高于的SD大鼠。 ,Wilcoxon等级和测试。的总得分白内障SDT老鼠对待ranirestat 15周时明显低于未经处理的SDT的老鼠。 ,Wilcoxon等级和测试。没有显著差异之间的总得分白内障治疗SDT老鼠和SDT老鼠epalrestat对待。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。

图5
在40周总白内障分数。总白内障治疗SDT老鼠的得分显著高于40周的SD大鼠。 ,Wilcoxon等级和测试。的总得分白内障SDT老鼠ranirestat治疗40周显著低于未经处理的SDT的老鼠。 ,Wilcoxon等级和测试。没有显著差异之间的总得分白内障治疗SDT老鼠和SDT老鼠epalrestat对待。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。
3.3。MNCV坐骨神经

Ranirestat ( m / s, 0.1毫克/公斤/天, ; m / s 1毫克/公斤/天, ; m / s 10毫克/公斤/天, , 分别;Dunnett测试)预防减少MNCV在40周观察坐骨神经的控制项老鼠( m / s) ( 以剂量依赖性的方式)。Epalrestat(100毫克/公斤/天)也阻止MNCV减少( 米/秒, , 通过 以及)。非糖尿病的MNCV控制SD组 米/秒( )(图6)。因此,ranirestat DN和epalrestat阻止发展的SDT老鼠。


图6
MNCV水平坐骨神经在40周。MNCV水平治疗坐骨神经的SDT老鼠在40周显著低于SD大鼠。 ,学生的 以及。MNCV水平坐骨神经的SDT老鼠接受ranirestat和那些接受epalrestat明显高于未经处理的SDT的老鼠。 ,Dunnett类型意味着测试和排名 ,学生的 以及。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。
3.4。山梨糖醇在镜头和果糖

山梨糖醇,镜头中果糖含量如图15 - 40周7,8,9,10。虽然似乎有剂量依赖性降低山梨醇和果糖与ranirestat治疗所带来的镜头,未经处理的镜片的水平也很低。


图7
镜头中的山梨糖醇含量在15周。虽然似乎有剂量依赖性降低山梨醇水平与管理ranirestat镜片,山梨糖醇含量在未经处理的镜头和镜头处理epalrestat非常低。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。

图8
山梨糖醇含量在40周的镜头。虽然似乎有剂量依赖性降低山梨醇水平与管理ranirestat镜片,山梨糖醇含量在未经处理的镜头和那些接受epalrestat很低。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。

图9
镜头中的果糖含量在15周。虽然似乎有剂量依赖性降低政府的镜头中果糖含量ranirestat,未经处理的镜头中的果糖水平非常低。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。

图10
镜头中的果糖含量40周。未经处理的镜头非常低的果糖水平相对于其他ARI-treated镜片。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;环保局:epalrestat。
3.5。在坐骨神经山梨醇和果糖

坐骨神经山梨醇含量在15 - 40周数据所示11和12。山梨糖醇的增加水平控制大鼠的坐骨神经( nmol / g)显著降低( ,ranirestat Dunnett测试)和政府(10.0和1.0毫克/公斤/天)和epalrestat(100毫克/公斤/天)在15周。在40周,山梨糖醇水平的增加大鼠坐骨神经控制( nmol / g)显著降低所有ranirestat剂量(0.1和1.0毫克/公斤/天, ;10.0毫克/公斤/天, ,Dunnett测试)。然而,epalrestat没有显著的影响在增加山梨糖醇的水平。


图11
坐骨神经的山梨糖醇含量在15周。山梨糖醇水平在坐骨神经治疗SDT老鼠的SD大鼠有显著提高。 ,学生的 以及。山梨糖醇含量坐骨神经治疗ranirestat(1.0和10毫克/公斤/天)明显低于未经处理的SDT的老鼠。 ,Dunnett joint-ranking测试类型。坐骨神经的山梨糖醇水平处理epalrestat也明显低于未经处理的SDT老鼠。 ,学生的 以及。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;epal: epalrestat。

图12
山梨糖醇含量坐骨神经在40周。山梨糖醇水平在坐骨神经治疗SDT老鼠的SD大鼠有显著提高。 ,学生的 以及。山梨糖醇含量坐骨神经处理所有剂量的ranirestat(10.0和1.0毫克/公斤/天)低于未经处理的SDT的老鼠。 和 ,Dunnett joint-ranking测试类型。Epalrestat不会影响降低山梨醇水平。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;epal: epalrestat。

坐骨神经中的果糖含量在15 - 40周数据所示13和14。果糖含量的增加控制大鼠的坐骨神经显著降低( 由ranirestat Dunnett测试)(1.0和10.0毫克/公斤/天)和epalrestat(100毫克/公斤/天)在15周。在40周,增加水平的果糖在坐骨神经控制老鼠与所有剂量的ranirestat显著降低(0.1和10.0毫克/公斤/天, ;1.0毫克/公斤/天, ,Dunnett测试)。然而,epalrestat果糖水平上没有显著的影响。


图13
坐骨神经中的果糖含量在15周。果糖水平治疗坐骨神经的SDT老鼠的SD大鼠有显著提高。 ,学生的 以及。果糖含量坐骨神经治疗ranirestat(1.0和10毫克/公斤/天)明显低于未经处理的SDT老鼠。 ,Dunnett joint-ranking测试类型。坐骨神经的果糖水平处理epalrestat也明显低于未经处理的SDT的老鼠。 ,学生的 以及。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;epal: epalrestat。

图14
坐骨神经的果糖含量40周。的果糖水平坐骨神经治疗SDT老鼠在SD大鼠血压要高得多。 ,学生的 以及。果糖含量坐骨神经治疗剂量的ranirestat都明显低于未经处理的SDT的老鼠。 和 ,Dunnett joint-ranking测试类型。Epalrestat不会影响减少果糖水平。的NDM: non-diabetes糖尿病;糖尿病:糖尿病;王妃:ranirestat;epal: epalrestat。
3.6。组织病理学

未经处理的眼睛(图的标准苏木精染色15左)显示,一个僵化的核漂浮在液化皮层和空泡形成和解体皮层纤维。Epalrestat-treated眼睛(图15、中)几乎相同的结果未经处理的眼睛。然而,ranirestat-treated眼睛(图15发现,右)几乎正常的镜头。疣状CML显示严重染色的未经处理的眼睛(图16,顶部)与最小的染色ranirestat-treated(10毫克/公斤/天40周)眼镜(图16,底部)。治疗眼睛的晶状体皮质显示液化对CML和广泛的染色。然而,眼睛最小的染色了CML治疗晶状体核和皮质。




图15
病理学(苏木精、原始放大4 x)在40周。在一个未经处理的眼睛(左),镜头有一个僵化的核漂浮在液化皮层和空泡形成和解体皮层纤维。epalrestat-treated眼(中间),未经处理的结果几乎是一样的眼睛。在ranirestat-treated眼睛(右),眼睛几乎正常晶状体和视网膜。


图16
CML疣状(原始放大4 x)在40周。疣状对CML显示了治疗眼睛严重染色(顶部)与最小染色ranirestat-treated眼(底部)。

4所示。讨论

我们之前报道的预防效果ranirestat DN和白内障在链脲霉素(STZ)全身的糖尿病大鼠18]。在这研究中,ranirestat降低山梨醇积聚在坐骨神经和提高减少在MNCV STZ-induced糖尿病大鼠。药物也有一个强有力的预防对镜头的影响在整个实验周期不透明度。

然而,STZ-induced糖尿病大鼠糖尿病眼部并发症的并不是一个理想的动物模型,因为它通常只显示博士的早期阶段,没有潮红。STZ-induced糖尿病大鼠白内障但SDT鼠开发更高级的hypermature白内障和三个主要糖尿病眼部并发症,增生性博士,白内障,潮红19]。博士hypermaturity白内障发展,发展到高级阶段。大视网膜皱褶模仿牵引性视网膜剥离,在视神经盘是最广泛的荧光素渗漏特性发现博士在这个老鼠。在某些SDT老鼠,潮红发展大规模的前房出血与新生血管性的虹膜周围纤维膜。虽然有一些差异在SDT老鼠和人类之间的糖尿病眼部并发症糖尿病患者的眼部并发症SDT老鼠模仿人类。因此,SDT老鼠进行研究糖尿病眼部并发症是很有用的。使用这种独特的鼠模型中,我们测试了ranirestat的影响,新阿里博士在SDT老鼠在先前的研究。Ranirestat阻止SDT老鼠增生性博士的发展(17]。然后我们进行了当前实验评估的影响在白内障和DN ranirestat SDT老鼠和ARI epalrestat比较商业化的影响。eparlestat的临床剂量为150毫克/天/成人。根据这一剂量,约2毫克/公斤/天可能适合获得阿里的效果。因此,我们测试了三种不同剂量的ranirestat(0.1、1和10毫克/公斤/天)和hyperdose epalrestat(100毫克/公斤/天)。未经处理的SDT老鼠和老鼠epalrestat-treated SDT发达成熟白内障。然而,最小的白内障ranirestat-treated SDT开发的老鼠。我们认为这种差异结果的差异每个阿里的组织渗透。因此,高果糖和山梨糖醇水平可能会在未经处理的SDT老鼠的镜头和epalrestat-treated SDT大鼠坐骨神经,但低水平ranirestat-treated SDT老鼠。然而,结果不是我们所期待的。 We previously reported similar findings that the sorbitol level in the lenses of untreated diabetic rats decreases with time [20.]。先进的破坏和瓦解的先进成熟白内障的晶状体皮质观察治疗SDT老鼠(图15)。这种病变可能导致山梨醇和果糖晶状体囊的泄漏可能是因为小的囊破裂的时间。病理变化也可能会引起另一个代谢变化的多元醇通路的高级阶段。果糖分解3-deoxyglucosone和山梨糖醇,果糖最终耗尽关闭镜头胶囊。如果山梨糖醇的水平和果糖透镜测量糖尿病性白内障的早期阶段,结果可能是不同的。

Ranirestat预防减少MNCV坐骨神经的方式,存在剂量依赖的相关性和效果强于epalrestat(图6)。

在坐骨神经,造成显著降低山梨醇和果糖治疗ranirestat(数据11,12,13,14)与高水平的山梨糖醇在未经治疗的糖尿病和果糖SDT老鼠,必须与MNCV下降有关。

我们相信,我们的发现强烈建议一个潜在的治疗用途的ranirestat预防糖尿病眼部和神经并发症。Epalrestat,世界上唯一的商用阿里,也为DN被证实是有效的,但其效果在某种程度上是有限的糖尿病眼部并发症。因此,看来阿里斯对糖尿病并发症,预防效果和ranirestat可能更有效地预防糖尿病眼部并发症与epalrestat相比,有限的有利影响。

利益冲突

作者没有利益冲突。