文摘
慢性ER应激正成为一个触发器,失衡的系统性和动脉壁因素,促进动脉粥样硬化。巨噬细胞凋亡在先进的动脉粥样硬化病变也是atherothrombotic疾病的风险增加。我们假设glucolipotoxicity可能通过ER应激调节单核细胞活化和细胞凋亡。因此,本研究的目的是(a)调查glucolipotoxicity能否实施ER应激和细胞凋亡在THP-1人类单核细胞(b)调查是否4-Phenyl丁酸(PBA),化学伴侣可以抵制glucolipotoxicity-induced ER应激和凋亡。细胞受到glucolipotoxicity或衣霉素展出ROS生成增加,基因和蛋白质(IRE1活跃,grp - 78α和排骨)表达ER应激标记。此外,这些细胞显示增加TRPC-6频道显示的表达和细胞凋亡的DNA损伤和caspase-3活动增加。而glucolipotoxicity /衣霉素氧化应激增加,压力,TRPC-6 mRNA表达,并编程THP-1单核细胞凋亡,所有这些分子扰动被PBA抵制。自ER应激的单核细胞功能障碍在糖尿病和动脉粥样硬化的潜在原因,我们的研究强调化学PBA等监护人可以缓解ER压力和有潜力成为新疗法。
1。介绍
心血管并发症是由于动脉粥样硬化疾病经常导致糖尿病患者的发病率和死亡率(1]。免疫细胞如单核细胞和淋巴细胞的作用已经涉及糖尿病的发病机理及其各种并发症包括动脉粥样硬化。临床和实验证据表明,血管壁的炎症过程的决定性因素,占病变形成和临床发展的速度在患有动脉粥样硬化2]。单核细胞和巨噬细胞,试图沿着血管细胞吞噬脂质拉登,将暴露于高血糖和高脂血症,称为“glucolipotoxicity结合病理生理情况。”的确切机制glucolipotoxicity触发单核细胞活化和动脉粥样硬化过程并不清楚。然而,证据表明,ER应激中扮演一个重要的角色在这些机制。
众所周知,ER应激激活一系列信号响应(UPR)组成的蛋白质。UPR包括至少三个信号通路由激酶IRE1和活跃转录因子ATF6 [3)信号,协调细胞反应的蛋白质,其中包括蛋白质的差别(a)对这些翻译,(b)的增强表达ER伴护蛋白质促进蛋白质重折叠,和(c)激活蛋白酶参与错误折叠蛋白质的降解。相反,长期或严重的ER应激可以导致凋亡细胞死亡的激活。最近的研究表明,慢性ER应激源自glucolipotoxicity是主要的罪魁祸首之一,可以很好地解释和胰岛素抵抗的根本原因β细胞功能障碍(4- - - - - -7]。ER应激与糖尿病和胰岛素抵抗也发现ER的扩张β肽的2型糖尿病患者(8,9]。此外,增加表达ER应激标记已经证明在db / db小岛和老鼠β肽的2型糖尿病患者(9,10]。最近的研究也暗示β细胞功能障碍由glucolipotoxicity-induced ER应激介导的氧化应激和细胞凋亡增加11]。而单核细胞的招募和保留在动脉粥样硬化病变导致斑块发展(12),巨噬细胞凋亡在先进的动脉粥样硬化病变atherothrombotic疾病的风险也增加(13]。尽管glucolipotoxicity触发ER应激而闻名,其效果在单核细胞ER应激的各种武器机械还没有明确定义。因此,我们调查了glucolipotoxicity对单核细胞的影响,参照ROS生成,转录改变各种ER应激标记,和凋亡指标。我们也调查了影响4-phenyl丁酸(PBA化学女伴)是否抵制glucolipotoxicity-induced ER应激和凋亡。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和治疗
人类单核细胞THP-1细胞经国立细胞科学中心(国立浦那(印度)。THP-1细胞被维护在endotoxin-free rpmi - 1640包含5.5毫米葡萄糖,10% (v / v) heat-inactivated胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μ2.5 g / mL链霉素,μ谷酰胺g / L两性霉素B、2毫米,1毫米丙酮酸钠和10毫米玫瑰,pH值7.0 - -7.4,5%的湿润条件下有限公司2在37°C。所有的实验,细胞受到5.5毫米葡萄糖(基底)或glucolipotoxicity葡萄糖+ 0.5毫米软脂酸(25毫米)或衣霉素(4μ米)治疗24 h的存在和缺乏4-PBA(1毫米),在无血清培养基。所有的实验都是独立进行至少三次。
2.2。细胞内活性氧(ROS)测量
细胞内ROS生成测量在THP-1单核细胞如前所述14应用共焦)与少量修改。简单地说,1×103细胞被播种在共焦有房间的幻灯片(LabTek II)预镀poly-L-lysine为0.01%。治疗后情况,2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (H2-DCFDA 10μ米)染料被添加到每个好,孵化为30分钟37°C。细胞然后用PBS洗两次。捕捉荧光的变化,细胞兴奋的波长485 nm和荧光发射在530 nm读使用卡尔Zeiss-LSM 20 x 700共焦显微镜的目标。意思是荧光强度变化表示为任意单元(AU)。
2.3。实时聚合酶链反应
2.3.1。RNA隔离
从细胞总RNA是孤立如前所述15]。总RNA的RNA质量和浓度测量使用nanodrop。1μg的RNA逆转录酶转化为互补使用100台,40岁μM Oligo-dT18底漆(新英格兰生物学实验室),10 xrt缓冲区,20 U核糖核酸酶抑制剂(Amersham生物科学),2.5毫米每核苷酸和孵化42°C 1 h。
2.3.2。定量实时聚合酶链反应
特定基因进行了定量实时PCR使用SYBR绿色主人混合(Finnzymes)。PCR扩增进行了使用abi - 7000(应用生物系统公司)与循环条件(初始周期:2分钟50°C,初始变性为15秒95°C, 40变性的周期为15秒95°C,和退火/延长60°C为1分钟)。RNA的表达水平是决定使用2-DDCt和规范化的β肌动蛋白。特定基因的引物序列表中列出1。
2.4。蛋白表达
具体的治疗后,细胞细胞溶解使用缓冲区里帕(50毫米Tris-HCl (pH值8.0),150毫米氯化钠,0.1% SDS、叠氮化钠0.2%,1% Triton x - 100, 0.25%钠脱氧胆酸盐,和1 x蛋白酶抑制剂)。总之,细胞被用在冰和离心机和孵化1小时5分钟16000克在4°C。收集到的上层清液由布拉德福德量化对蛋白质的方法。15μg蛋白在10% sds - page和转移到解决polyvinylidine氟化物薄膜(PVDF)。1小时后阻塞在5%牛血清白蛋白(BSA)和孵化与适当的初级抗体和HRP-conjugated二级抗体,检测了用增强化学发光试剂盒(通用电气医疗集团)。β肌动蛋白是作为内部控制。意思是微数据独立实验规范化控制使用Image-J软件和表示为测试蛋白质和的比值β肌动蛋白。
2.5。DNA Damage-Comet化验
DNA损伤与彗星试验评估如前所述[16]。简单地说,与200年治疗细胞混合μL 0.5%的低熔点的点琼脂糖和分层明确显微镜载玻片预镀1%正常琼脂糖融化。溶解、电泳和中和是紧随其后的是与溴化乙锭染色。幻灯片是在荧光显微镜下检查。他们取得了使用一个图像分析系统(彗星成像仪1.2.13)附加到荧光显微镜(德国卡尔蔡司)配备合适的过滤器。
2.6。半胱天冬酶3活动分析
使用caspase-specific Caspase-3活动是由比色测定肽氨基酸序列包含Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)共轭的颜色报道分子p-nitroanilide(机构)(RandD系统)。还存在乳沟肽的释放与发色团机构,即量化spectrophotometrically 405海里。治疗后细胞收获细胞溶解和10μ从每个样本为96 g蛋白是整除板。0.5μL德勤被添加到所有井增加50紧随其后μ缓冲和3.5 L 2 x的反应μL (Caspase-3比色底物。板是在37°C孵化1小时使用微型板块读者和阅读在405海里。Caspase-3活动表示为均值±SEM的光学密度。
2.7。统计分析
社会科学统计软件包(SPSS)窗口,(16.0版本,芝加哥,IL),用于统计分析。数据表示为±SEM。使用学生的对比组进行以及和值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
我们应用光纤共焦显微镜测量的荧光强度在单核细胞表明细胞内ROS生成的程度。而代表与ROS生成荧光图像描绘在图1(一),累计ROS生成数据呈现在图1 (b)。细胞受到glucolipotoxicity或衣霉素表现出增加活性氧生成比未经处理的细胞(图1 (b))。预处理的细胞与4-phenyl丁酸显示显著减少ROS生成()。完整的ER应激机械mRNA表达模式是由实时PCR和ER应激标记的mRNA累积数据模式与他们比内务工作β肌动蛋白是描绘在图2。未经处理的细胞相比,细胞治疗glucolipotoxicity或衣霉素显示活跃的mRNA表达增加,GRP78, IRE1αXBP1 ATF6,和排骨(数据2(一个)- - - - - -2 (f))。也有趣的ER应激的程度上增加标记下glucolipotoxicity高于衣霉素引起的。PBA治疗显著降低所有的转录表达ER应激标记最有可能由于其伴侣的活动。图3(一)描绘了ER应激标记的蛋白表达和代表β肌动蛋白。与mRNA的结果一致,蛋白的表达ER应激标记,即活跃,GRP78, IRE1α,XBP1也增加在细胞受到glucolipotoxicity衣霉素治疗(图3(B))。4-PBA治疗显著降低所有ER应激标记的蛋白表达。
(一)
(b)
(一)活跃
(b) GRP78
(c) IRE1α
(d) XBP-1
(e) ATF6
(f)切
自编程细胞凋亡的氧化和ER压力取决于负载的胞内钙信号2 +我们调查TRPC-6的转录水平,这对增加Ca是一个重要的推动力2 +涌入。细胞治疗glucolipotoxicity或衣霉素导致几种折叠的增加TRPC-6 mRNA水平(图4由PBA),这是明显的规范化。
与未经处理的细胞,细胞治疗glucolipotoxicity或衣霉素显示增加DNA损伤(4.6和3折,职责)。有趣的是,PBA治疗显著降低DNA损伤诱导通过glucolipotoxicity或衣霉素(图5(一个))。自切(一个中间caspase-dependent凋亡)mRNA和蛋白表达增加细胞受glucolipotoxicity或衣霉素,我们估计caspase-3酶的活性。正如所料,细胞接受glucolipotoxicity或衣霉素显示显著增加caspase-3活动(图5 (b))这意味着不受控制的ER应激可能编程对凋亡细胞。caspase-3活动增加由于glucolipotoxicity或衣霉素显著()减少4-PBA。
(一)
(b)
4所示。讨论
以下是简而言之研究的发现。首先,单核细胞受到glucolipotoxicity显示增加活性氧的生成和增加多个基因的mRNA表达ER应激的机械。其次,这些单核细胞表现出慢性ER应激的特点就是明证TRPC-6 mRNA表达的增加、DNA损伤,caspase-3活动。第三,PBA-a化学女伴,抵制所有glucolipotoxicity-induced细胞和分子改变单核细胞强调ER缓解压力的好处。
单核细胞活化,内皮细胞粘附,和轮回进入皮下空间早期动脉粥样硬化的发病机制中的关键事件。葡萄糖和脂质毒性的机制诱发monocyte-associated动脉粥样硬化只是部分。糖尿病患者的血液单核细胞显示增加活性氧的生成和氧化还原信号改变16- - - - - -21]。在我们的研究中,单核细胞受到glucolipotoxicity展出增加活性氧的生成。活性氧可以直接激活细胞死亡过程的氧化蛋白质、脂质、核酸和/或可以充当发起者或第二信使细胞死亡过程。越来越多的证据表明,蛋白质折叠和一代的活性氧(ROS)作为副产品的蛋白质氧化的ER密切相关的事件。同时也成为明显的激活UPR在暴露于氧化应激是一种自适应机制来保护细胞功能和生存。然而,持续的氧化应激和蛋白质错误折叠启动凋亡级联和目前已知多种人类疾病的发病机制中扮演主要的角色包括糖尿病和动脉粥样硬化22- - - - - -24]。
一些假设已经构思解释先进lesional巨噬细胞凋亡和动脉粥样硬化,无疑和多个机制有关。最近在培养细胞及相关机械的数据和基因因果关系的证据在活的有机体内支持角色内质网(ER)压力先进lesional斑块坏死的巨噬细胞凋亡及其主要结果(13,25]。与先前的研究一致,glucolipotoxicity研究显示增加活跃的转录,GRP78, IRE1α、XBP-1 ATF6,砍在单核细胞。这也证实了ER应激蛋白表达的增加标记。增加这一事实的表达ER应激标记glucolipotoxicity类似于诱导下衣霉素(已知的ER应激诱导物)强调glucolipotoxicity吸纳在单核细胞ER应激。
增加TRPC-6 mRNA表达glucolipotoxicity下在我们的研究暗示作用的钙含量增加单核细胞功能障碍和ER应激。钙是一个重要的细胞内信使和提供重要的细胞功能兴奋和nonexcitable细胞。可用数据瞬时受体电位锥形(TRPC)蛋白质表明这些蛋白质启动Ca2 +输入路径和维持胞质至关重要,呃,线粒体钙2 +水平(26]。改变Ca2 +体内平衡在糖尿病和相关并发症(建议27,28]。朱et al。28最近回顾TRP通道的作用和代谢疾病的影响。活动TRPC是生理上重要的Ca2 +浓度在急诊室必须保持在足够的水平为了执行它的许多基本功能的细胞器包括蛋白质折叠和贩卖。然而,Ca的损失2 +体内平衡由于不当TRPC激活可能导致ER应激反应,甚至凋亡[29日]。虽然氧化应激可以导致细胞缺陷包括ER Ca的缺陷2 +吸收和Ca2 +流出,从而增加和Ca2 +涌入(30.),一些TRPC家庭也被证明直接激活在氧化应激反应31日]。在我们的研究中,glucolipotoxicity和衣霉素导致增加在单核细胞活性氧生成,在转录水平上,我们也见证了TRPC6 mRNA表达增加。在TRPC亚科的频道,TRPC6是封闭的信号转导途径,激活c -型磷脂酶以及直接接触甘油二酯(32]。最近的研究强调TRPC6在一些疾病的病理生理作用[33,34),它似乎是一个新兴的药物目标。改变TRPC6监管和容性钙条目已被证明在血管受损的糖尿病患者(35]。而氧化应激的作用与2型糖尿病的发病机理及其微观——和macrovascular并发症(20.),TRPC6信使rna也显示在单核细胞显著高于2型糖尿病患者(36)指向的新途径的激活增加单核细胞,因此在糖尿病患者动脉粥样硬化。
ER应激是一种破坏性压力造成glucolipotoxicity从而导致细胞凋亡时,压力是长期或不受控制的。高村等。37]表明,单核细胞吞噬糖尿病患者没有有效的在正常健康人群和电子显微镜检查发现了单核细胞形态学改变细胞ER来自糖尿病患者。虽然已经知道砍通路的激活UPR可以导致细胞凋亡,连接砍死执行通路的分子机制了解甚少。我们的结果表明,细胞凋亡可能是执行的激活增加caspase-3 glucolipotoxicity之下。由于自噬操作提出了另一种细胞死亡机制或行动的上游细胞凋亡(38),这是合理的glucolipotoxicity-induced ER应激也可以通过自噬促进细胞死亡(39,40]。ER应激UPR激活也可以影响某些炎性细胞因子的表达(41)呈现的单核细胞内在促炎可能极端的后果当单核细胞浸润血管壁内膜。最近的研究提供了证据,钙依赖机制ER应激巨噬细胞凋亡(42]。TRPC-6看到mRNA水平的增加在我们的研究中也支持这一点。因为半胱天冬酶和下游细胞凋亡效应分子2 +端依赖,未来的研究应该关注的参与细胞内钙离子诱导的细胞凋亡在ER-stressed细胞葡萄糖和脂质dyshomeostasis。
在我们的研究中,glucolipotoxicity-induced ROS生成和增加ER应激标记下看到glucolipotoxicity被PBA规范化。药物干扰ER应激最近广泛的治疗潜力和化学陪伴像tauroursodeoxycholic酸(TUDCA), PBA得到太多的关注,因为他们的ER压力缓解活动这些化合物提高ER折叠能力和帮助在稳定蛋白质构象43]。PBA被发现防护在体外和在活的有机体内糖尿病模型(43- - - - - -45]。越来越多的证据表明,蛋白质折叠和一代的活性氧(ROS)作为副产品的蛋白质氧化的ER密切相关的事件。而促进适当的蛋白质折叠,PBA有助于维持平衡ER oxidoreductin 1 (ERO1)和蛋白二硫化物异构酶(PDI)从而降低蛋白质氧化时产生的ROS水平(46]。它也表明,PBA抵消氧化应激通过上调表达和超氧化物歧化酶(SOD)的活性(47,48]。罗等。49)也证明了PBA NADPH氧化酶活性和抑制强调PBA的双重监管ER应激和氧化应激。Erbay et al。50]表明,缓解PBA的ER应激保护巨噬细胞对lipotoxic死亡和抑制动脉粥样硬化的XBP1拼接,砍的表情。PBA可以调节ER应激和提供潜在的疗效在一些临床前模型的人类疾病,包括2型糖尿病(43,51- - - - - -55]。作为一种口服生物利用率终端芳香取代脂肪酸,PBA已被用于尿素循环障碍的治疗(56]。更重要的是,口服治疗预防lipid-induced显示的PBA最近在人类胰岛素敏感性和b细胞功能障碍(57]。
最后,我们的研究暴露ER应激的收敛,氧化应激和细胞凋亡存在glucolipotoxicity单核细胞和ER应激指出网络小说drug-targetable通路。我们的结果也强调化学陪伴的适应能力增强,并在进一步评估适当的临床试验,可以作为有效的抗糖尿病的/ antiatherosclerotic形式与潜在应用治疗2型糖尿病及其血管并发症如动脉粥样硬化。
缩写
| grp - 78: | 葡萄糖调节蛋白- 78 |
| 好处: | PKR像ER激酶 |
| IRE-1α: | 肌醇需要enzyme-1α |
| XBP-1: | X盒结合蛋白 |
| ATF-6: | 激活转录factor-6 |
| 切: | CCAAT / enhancer-binding同源蛋白质 |
| 盖德: | 增长逮捕和DNA损伤蛋白质 |
| TRPC-6: | 瞬时受体蛋白质六频道。 |
确认
这项工作得到了资助的生物技术(印度生物技术部),和科技部(DST-Indo-Korea项目),新德里。高级研究奖学金(SRF)的科学与工业研究理事会(CSIR),德里,也是值得庆幸的是承认。