依赖的近端GC盒和绑定转录因子调节基底和t-PA丙戊段时间表达式

文摘

目标。内皮组织类型纤溶酶原激活物(t-PA)释放是一个关键响应防止循环阻塞血栓形成。我们已经表明,t-PA基因epigenetically监管和极大地引起了组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂丙戊酸(VPA)。我们现在调查参与已知t-PA启动子的调控元件和评估潜在的转录因子/交互代数余子式的依赖。方法。记者向量和一个插入,单独突变在t-PA发起人CRE或GC盒二或GC盒三元素,被转染进ht - 1080和HUVECs和VPA挑战。HUVECs与核攻击目标组蛋白乙酰转移酶(HAT)和选定的Sp / KLF家族的转录因子。结果。一个完整的观察VPA-response CRE变异结构,而突变的GC盒II和III感应的大小减少了54 79%,ht - 1080和HUVECs 49和50%,分别。的减毒感应t-PA mRNA Sp2后观察,Sp4, KLF5损耗。KLF2和p300(帽子)确认为基底的积极监管机构t-PA表达式和Sp4 KLF9压抑者。结论。vpa诱发t-PA表达依赖于近端t-PA GC盒的启动子和可能涉及的交互与Sp2, Sp4, KLF5。

1。介绍

大多数的心肌梗死、缺血性中风是由于血管内凝血,当无对手的,很快可以进步到一个阻塞动脉血栓。为了防止这种情况,血管内皮的健康个体有能力敏锐地释放纤溶酶组织类型纤溶酶原激活物(t-PA) [1),导致血栓溶解。t-PA释放能力受损患者的凝血和纤溶的平衡可能转移的血栓形成,因此血管内血栓形成和传播可能导致组织梗死。有趣的是,t-PA释放已发现有缺陷的条件与血栓事件的风险增加相关,如高血压[2,3,肥胖4)和冠状动脉粥样硬化5,6]。

因此,有临床需要找到药理工具预防atherothrombotic内源性纤溶系统目标的事件。我们最近表明,丙戊酸2-propylpentanoic酸,丙戊酸钠(VPA),临床抗癫痫和心境稳定药物可用,有力地调节t-PA在培养内皮细胞和增强t-PA释放在动脉粥样硬化的人以及在猪冠状动脉缺血模型(7- - - - - -9]。临床相关的浓度和观测到了这种效应可能是由于组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制作用的VPA (10,11]。同样,t-PA表达强烈诱导古典(丁酸,trichostatin)以及其他新的组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi) [12- - - - - -15]。

然而,VPA诱发t-PA表达的机制目前未知。基于我们之前的研究,我们假设通过抑制hdac VPA调和它的影响。这将导致一个更乙酰化组蛋白在t-PA子状态,导致一个宽容和转录活性染色质状态。t-PA子访问时,绑定或转译后的修改的转录因子可以通过cis-acting调解感应元素。如果这个假设是正确的,功能失调的关键cis-element (s)或不可用的关键转录因子对VPA的响应有很大的影响。

t-PA基因转录主要来自TATA-independent转录起始位点(TIS) [18,19]。t-PA子三个元素,上游的TIS,曾被报道为t-PA表达很重要:一个环腺苷酸(营)响应要素- (CRE)网站和两个GC框(II和III) [16,17]。使用转染方法,我们对这些元素的重要性在VPA刺激。与这些元素交互相关转录因子的作用在核的实验研究。

2。材料和方法

2.1。道德声明

调查符合赫尔辛基宣言的原则。使用人类脐带细胞是哥德堡地区伦理审查委员会批准(449 - 93)。人事卡大学医院的产科病房进行口头知情同意关于使用捐赠者的脐带细胞为研究目的。鉴于研究材料是nonidentifiable,书面同意是不必要的和口头同意的伦理审查委员会的批准。

2.2。化学物质

从Sigma-Aldrich Na丙戊酸钠购买(圣路易斯,密苏里州,美国)和股票的解决方案(0.3米)准备在完整的内皮细胞培养基(瑞士巴塞尔,Lonza EGM-2)和存储在−80°C。复合之前立即在细胞培养基稀释使用。

2.3。细胞培养

由于他们的适用性作为转染大记者构造的模型系统,ht - 1080纤维肉瘤细胞在记者的研究利用。ht - 1080细胞(礼物教授罗伯特·Medcalf、莫纳什大学、澳大利亚)在DMEM培养(表达载体)补充10%胎牛血清和青霉素和链霉素。使用ht - 1080的有效性是保证通过验证一个一致的和重要的感应VPA t-PA mRNA在刺激的3毫米。

人类脐静脉内皮细胞作为(通过传代形成细胞生理相关的细胞类型核研究和证实记者研究。HUVECs所提取的胶原酶(Sigma-Aldrich)治疗20.的新鲜脐带获得卡大学医院的产科病房。在EGM-2培养基培养细胞和所有实验进行通道1。所有记者和核的实验进行了一式三份和副本,分别。HUVEC细胞实验重复从至少三个不同的捐赠者,ht - 1080实验重复三次。

2.4。记者构造和定点诱变

318个基点的近端t-PA启动子(246−+ 72)PCR扩增的插入前所述t-PA9578-CAT向量(21]和克隆到XhoI / HindIII萤火虫荧光素酶的网站记者向量(WI pGL4-Luc Promega,麦迪逊,美国)。随后,验证了构建DNA测序3730分析仪(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。的定点诱变t-PA CRE网站和GC盒二世和GC盒三世元素是由GenScript公司(美国新泽西州皮斯卡塔韦)。的近端启动子区域的示意图t-PA基因在图给出1。建立t - pa - 318 cremut pgl4 t-PA CRE站点TGACATCA突变GGCT《外国人侵权索赔法案》,创建t - pa - 318 gciimut pgl4 GC盒II网站CCCGCCC C突变一个公司治理文化一个C,创建t - pa - 318 gciiimut pgl4 GC盒三世网站CCCACCC突变一个CT一个GTc .这些特定的碱基对替换以前报道打断转录因子结合这些网站(22,23]。所有突变结构被测序验证。

2.5。瞬时转染的记者结构

那天在转染前,细胞被播种密度100 000细胞/在12-well板块(ht - 1080)或50 000细胞/在24-well板块(HUVECs)。细胞转染使用FuGENE 6 (ht - 1080)或FuGENE高清(HUVECs)试剂根据制造商的协议(Promega)使用的混合物500 ng t-PA发起人萤火虫荧光素酶的构造和10 ng SV40驱动pGL4.73 renilla荧光素酶控制向量。第二天,细胞治疗3毫米的VPA 24小时后细胞收获在被动裂解缓冲(Promega)和分析GloMax®光度计使用双荧光素酶检测试剂(Promega)。萤火虫荧光素酶信号被规范化renilla荧光素酶信号和数据提出了相对于如果控制。

2.6。短干扰RNA转染

短干扰rna (siRNAs)特定选择的Sp / KLF转录因子,p300, PCAF获得Dharmacon(热费希尔科学、拉斐特有限公司,美国)。Sp / KLF因素的选择标准是一个重要的调节(VPA)的一个微阵列实验(7)或以前被描述在一个内皮基因调控背景。每个特定ON-TARGETplus智能池核集在线资源1中列出在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/7928681。详细的核协议提出了其他地方(7]。短暂,HUVECs转染两次(0和24小时)使用DharmaFECT 4转染试剂(Dharmacon),新鲜培养基添加在48 h,细胞被刺激和3毫米VPA 72 h,在96 h细胞收获mRNA分析目标减少和t-PA基因表达。每个核都用在最后10 nM的浓度,除了Sp2和KLF6(20和40 nM,职责。)。结果只用于目标减少至少75%。两个负控制用于核;独自在一个DharmaFECT 4转染试剂添加细胞(模拟);在另一个控制使用核(全明星-控制、试剂盒)。没有区别观察t-PA或目标基因的表达与控制。

2.7。实时聚合酶链反应

总RNA制备使用RNeasy微型RNA工具包(试剂盒、希尔登,德国)和基因组DNA被使用RNase-free DNase我设置(试剂盒)。Sp2, Sp1的药t - pa, Sp3, Sp4, KLF2, KLF4, KLF5, KLF6, KLF9, KLF10, KLF13, KLF15, p300,和实时PCR PCAF信使rna进行了分析,应用生物系统公司7500快速实时PCR系统上执行使用互补和Taqman试剂从应用生物系统公司获得。t-PA mRNA分析与自定义Taqman表达分析(应用生物系统公司)使用以下序列:t-PA正向引物:5′GGC CTT GTC太极拳TTT CTA TTC三大′,t-PA反向引物:5′agc GGC TGG ATG GGT ACA三大′,t-PA探针5′tga猫呕吐有条件现金援助柠檬酸GCC GCT-3′。确认各自的可拆卸的Sp /执行KLF因子和PCAF使用Taqman基因表达分析(应用生物系统公司)和使用QuantiTect底漆的p300测定试剂盒(所有列在在线资源1)。产生HPRT作为内生内部标准在所有实验除了KLF9研究GUSB使用。

2.8。统计数据

数据提出了均值和标准平均误差(SEM)。统计评估使用成对的学生的表现以及和小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。所有的比较都是图中指定的传说和样本之间进行相同的实验和计算。的主本研究的重点是检查如果VPA-response可以调制的方法涉及定点诱变监管t-PA启动子元素或小干扰rna介导的击倒的候选人转录因子相互作用是一样的。的二次这项研究的焦点是评估如果siRNA可拆卸的转录因子影响基底t-PA基因表达。对于后者,Bonferroni调整为多个分析。

3所示。结果

3.1。突变的GC盒变弱vpa诱发t-PA子活动

评估的作用t-PA CRE和GC盒II和III元素在基底和vpa诱发t-PA子活动,ht - 1080细胞转染不变异和基因突变的318个基点插入t-PA近端启动子(数字2(一个)和3(一个))。不变异结构显示了约40倍感应(VPA(图)和3毫米3(一个))。突变的实验显示没有主要t-PA CRE元素的参与,这个网站的突变不能既不影响基底(图2(一个)(图)和VPA挑战的信号水平3(一个))。然而,GC盒II和III的重要性是明显的下降了70%在观察基底信号突变的网站(和、职责)。此外,VPA-mediated感应的每个突变构建大大减弱了。突变的GC盒II和III降低了感应的不突变结构是17 - 40倍()和8倍(),分别。空的基底信号电平pGL4.10向量(没有t-PA插入)的3%水平构造完整的插入。

验证ht - 1080细胞中观察到的反应,更多的类似记者实验生理相关HUVEC细胞类型。这些细胞转染效率较低,反映在完整的整体信号水平较低和VPA-induction插入相应的感应,只有10%在ht - 1080细胞。尽管如此,每个突变的效果几乎相同的两种细胞类型之间。没有影响的观察CRE-mutation HUVECs,而突变的GC盒II和III导致59,基底信号水平(低69%)(图2 (b))。同样,VPA-induction沮丧的不突变结构的4.4倍到2.2倍的GC盒II和III(变异结构)(图3 (b))。

3.2。siRNA可拆卸的Sp2, Sp4, KLF5变弱t-PA mRNA VPA感应

识别候选转录因子绑定两个启动子GC盒和评估他们的参与VPA-response,一组Sp和KLF因素单独用siRNA撞倒了。每个测试可以阻止导致目标减少75%或低于96 h,除了KLF10只减少了68%。由于我们未能消耗KLF10 mRNA截止水平,t-PA mRNA没有分析这些样本。

确认我们的最近的数据(7),一个大约10倍感应的观察t-PA mRNA 3毫米VPA 24 h。单独可拆卸的每个选择的Sp和KLF转录因子的不完全抵消VPA-response(数据4和5)。然而,t-PA信使rna诱导的大小显然是减少在Sp2和Sp4耗尽细胞(图4),适度降低KLF5压倒一切的细胞(图5)。的绝对数字VPA-induction nontransfected细胞相比于Sp2, Sp4, KLF5把细胞从10.2 - 6.5倍(),从9.2 - 5.7倍(),从9.4 - 7.6倍(),分别。

来验证这些积极的特异性VPA-response支安打,三种siRNAs检测潜在的脱靶效应在其他两个相关的mrna(图6)。减少所有核显示目标低于75%,但最大的影响大约每个其他的测试mrna±20%。

3.3。siRNA混战的Sp4, KLF2 KLF9影响基底t-PA mRNA的表达

siRNA可拆卸的后评价基底t-PA mRNA表达每个因素显示增强表达式Sp4枯竭和KLF9(数字4和5)。各自的海拔t-PA基因表达是2.3 - ()和3.8 - (相对于nontransfected细胞)褶皱。此外,观察t-PA表达显著下降的混战KLF2 (−31%,)。

基底t-PA表达式的感应在混战Sp4或KLF9被高架的大小反映t-PA VPA刺激后的反应。相对于nontransfected控制细胞,Sp4 KLF9把细胞的顺序显示VPA-inductions 13 - 22倍,分别。

3.4。混战的p300抑制基底t-PA mRNA表达而p300和PCAF损耗影响VPA的感应

组蛋白乙酰转移酶的作用(帽子)p300和PCAF最近提出了t-PA HDACi感应的ms - 275 (13]。因此,我们测试了核与这些帽子。损耗的p300抑制基底t-PA mRNA表达69% ()(图7)。VPA-mediated感应从9 -减少到2.5倍相对于未经处理的控制细胞。然而,t-PA感应的转染和nontransfected控制细胞几乎相同(9 - 8番相比,= NS)。细胞治疗与PCAF siRNA没有影响基底或vpa诱发t-PA mRNA的表达。

4所示。讨论

今天没有临床药理工具来提高或恢复受损内生纤维蛋白溶解。因此,强大的感应t-PA的临床使用抗癫痫药物丙戊酸(VPA)打开系统的药理调制的机会。因此,重要的是要澄清的确切机制VPA诱发t-PA。

在VPA上最近的一篇论文中,我们表明,诱导t-PA最有可能由于HDAC抑制作用的药物,当我们观察到显著增加的乙酰化组蛋白H3和H4 t-PA VPA-treatment后启动子(7]。支持,我们观察到没有感应的t-PA VPA模拟valpromide (VPM),一种物质,缺乏HDACi活动(11,24]。进一步,没有个人HDAC酶从亚科、活动花絮,或IV感应的VPA至关重要,虽然观察减毒VPA-response HDAC3单一混战,HDAC5, HDAC7。VPA pan-HDAC酶抑制剂,我们假设VPA介导作用于不同的影响t-PA HDAC酶,从而改变t-PA周围的组蛋白乙酰化状态的启动子。因此,这有利于更“接受”和转录活性染色质状态,因此开放访问功能基因的转录机械元素。本研究的目的是进一步研究探索的重要性中央cis-elements VPA-response的近端t-PA规定转录因子启动子和已知/绑定这些元素。

人类t-PA转录基因主要是开始从TATA-less转录起始位点18,19)和启动子区域特征明显包含几个cis-acting元素。其中,CRE-like元素(bp - 224−−217)和两个GC盒(GC盒II和III, bp 72−66和英国石油公司49−−−43岁的职责。)是重要的本构和诱导激活t-PA启动子(16,17,19,22]。我们的数据显示没有CRE网站的主要参与基底或VPA-stimulated t-PA推广活动,虽然我们观察到的信号水平略有下降CRE变异结构。然而,我们的数据证实中央GC盒II和III的重要性(16,17),我们观察到一个惊人的基底信号水平下降的诱变各自的网站。有趣的是,我们还观察到减少VPA-responses与突变,表明这两个网站也感应的VPA至关重要。根据这些研究结果和转录因子的能力从Sp / KLF家庭结合GC / GT盒(25),然后,我们专注于识别候选Sp和KLF因素绑定t-PA GC盒在基底和VPA-stimulated条件。

对依赖Sp1的普遍观点t-PA表达式,这有点奇怪,Sp1混战的实验显示改变t-PA表达式在控制和VPA-treated条件。一种解释可能是一个消耗Sp1蛋白质的不足。把这个疑问,我们证实了Sp1蛋白质的最低的使用积极的免疫印迹和验证信使rna抑制控制以挪士(26在Sp1耗尽样本(数据未显示)。然而,每个人都应该记住,主要都是基于以前的观测在体外方法;没有人确切证实相关性Sp1和改变染色质t-PA表达一个完整的上下文。

Sp1相比,我们的数据表明,Sp2和Sp4 t-PA表达式的监管至关重要。t-PA基因被诱导Sp4混战后,从而表明这个因素作为本构条件下t-PA基因的抑制因子。此外,VPA-induction t-PA mRNA在Sp2减毒,Sp4枯竭的样本。如果VPA-response Sp4,独立的人会期望一个相对强大t-PA感应后消耗的压制性的因素。相反,它可能VPA介导乙酰化Sp4蛋白质本身,因为已知HDAC抑制剂乙酰化物许多非组蛋白的蛋白质包括转录因子(27]。这可能会改变Sp4 t-PA基因的激活和/或支持增强的绑定t-PA启动子。前Sp3机制曾被报道(28]。的减毒VPA-responses Sp2和KLF5耗尽细胞也可以分配给一个乙酰化作用,但缺乏参与基底t-PA表达式表明,感应VPA在更大程度上依赖于这些转录因子的招聘。

虽然一个完整的观察VPA-response损耗后的每个其他测试KLF因素,KLF2以上所有KLF9显示参与基底t-PA基因表达。我们的数据表明,KLF2作为活化剂的t-PA表达式。有趣的是,这个功能的KLF2符合丰富的文档在抗血栓和抗炎作用的因素(了29日])。关于KLF9,文学是稀缺的,据我们所知,它从未被描述的上下文中t-PA监管。尽管缺乏参与VPA-response,深刻的感应t-PA KLF9混战表示阻遏作用。有趣的是,这是符合现有文献[30.)当然鼓励未来的扩展研究监管KLF9 t-PA表达的作用。

Dunoyer-Geindre和Kruithof最近评估帽子p300 / CBP的参与和PCAF t-PA感应后使用HDACi ms - 275。根据记录使用的药物抑制剂的选择性在这项研究中,他们提出了一个角色PCAF而不是p300 / CBP (13]。为了测试这些结果是否有效VPA的感应,我们使用核目标p300和PCAF。然而,我们的数据并不表明PCAF的参与。我们相信,核比药理抑制剂是一个更具体的工具,通常有广泛的影响,这可能是差异的原因。关于p300,我们的数据显示这对维护共激活剂的重要作用但没有参与VPA-response基底t-PA表达式。当然,t-PA感应的大小是减少我们的p300实验,但是我们国家独立的p300 VPA-mediated t-PA基于几乎相同的感应VPA-responses当计算相对于各自如果控制。

5。结论

我们检查了机制的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂丙戊酸(VPA)诱发内皮细胞纤溶酶t-PA。总之,我们表明,VPA-mediated诱导t-PA依赖于近端GC盒t-PA启动子和可能涉及互动(乙酰化)转录因子Sp2, Sp4, KLF5。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。

利益冲突

埃里克•Ulfhammer Pia拉尔森,米娅Magnusson, Niklas马瑞医生和Sverker Jern一起哥德堡大学控股公司股东在公司处理PCT专利申请的知识产权:PCT / GB2012/000229”方法改善内源性受损纤维蛋白溶解使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂”(发明者:Pia拉尔森,Niklas马瑞医生和Sverker Jern),申请日期:2012年3月9日。该公司没有影响研究设计和数据解释和该公司没有产品在开发中。作者证实此种竞争利益不会改变他们的坚持《政策共享数据和材料。

确认

这项工作得到了瑞典研究理事会,瑞典心肺基础上,阿尔夫卡大学医院的研究资助,英国皇家学会的艺术与科学在哥德堡,标志和Olof让基金会,马格努斯Bergvall基金会和Lars Hierta纪念基金会。

补充材料

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