文摘
六十菌株分离从土壤样品中有机溶剂的存在是生产木聚糖酶的筛选。其中,应变RSPP-15显示被确认为的木聚糖酶活性最高芽孢杆菌vallismortis。隔离显示最大的木聚糖酶的生产(3768 U /毫升)的白桦木材木聚糖和牛肉膏在55°C 48小时内的pH值7.0孵化。酶活性和稳定性增加181.5,153.7,147.2,133.6和127.9%和138.2,119.3,113.9,109年,104.5%的有限公司2 +、钙2 +、镁+ 2、锌+ 2,菲+ 3离子(10毫米)。木聚糖酶活性和稳定强烈抑制Hg和铜离子的存在。这种酶也稳定在30%n十二烷、异辛烷、n癸烷、二甲苯、甲苯、n己烷,n丁醇、环己烷。存在的苯、甲醇和乙醇略微降低了木聚糖酶的稳定性,分别。这种隔离可能是有用的在几个工业应用由于其耐热和耐有机溶剂的特点。
1。介绍
木聚糖酶(endo-1 4 -β-D-xylanohydrolase)是一种水解酶,在木聚糖的解聚作用,扮演着重要的角色,主要可再生hemicellulosic植物细胞壁的多糖。它是由许多微生物如细菌(1- - - - - -3)、真菌(4,5),放线菌(6),和酵母(7];尽管真菌和细菌来源的酶主要应用在工业领域,细菌木聚糖酶是首选,因为他们快速增长,需要更少的空间,可以很容易地维护和可遗传操作(8]。细菌,主要是芽孢杆菌sp,有能力生产碱性耐热木聚糖酶。先前的报道说芽孢杆菌SSP-34,芽孢杆菌stearothermophilus应变T6,链霉菌属,芽孢杆菌sp.应变NCL 87 - 6,芽孢杆菌circulansAB 16,杆菌、sv - 85是有效利用生产木聚糖酶(9- - - - - -12]。
最近,对木聚糖酶的兴趣明显增加由于其广泛的各种各样的生物技术预漂浆等目的,提高饲料的消化率股票,改变基于谷物的东西,对木质纤维材料和生物转化agrowastes可发酵产品,果汁的澄清,植物纤维的脱胶13,14]。Cellulase-free木聚糖酶活性在高温度和pH值越来越重要在纸浆和造纸行业减少有毒氯代化合物使漂白过程环境友好(15]。深层发酵提供了各种优势固态发酵,包括发酵研究,提高产品产量,扩大的过程更容易。在这项研究中,我们分离细胞外thermosolvent宽容alkalophilic木聚糖酶的菌株芽孢杆菌vallismortisRSPP-15从土壤中有机溶剂的存在。之后,我们优化的物理化学和营养参数更好的工业应用木聚糖酶的生产。
2。材料和方法
2.1。分离、筛选和鉴定Thermosolvent宽容的木聚糖酶产生菌
无菌收集土壤样本来自不同网站的纸浆和造纸工业去隔离木聚糖酶产生菌。1土壤悬浮在9.0毫升无菌蒸馏水,搅拌一分钟。然后0.1毫升悬挂在白桦木材木聚糖琼脂扩散板(pH值7.0)含1.0%木聚糖(birchwood);0.5%硫酸铵,2%的琼脂。接种板块覆盖了7.0毫升的有机溶剂(乙醇、丙醇、环己烷、甲苯、丁醇、甲醇、异丙醇)和孵化55°C,直到足够的增长出现了。足够的增长后孵化板块与刚果红溶液覆盖(0.1%)10分钟,然后用1 N氯化钠溶液使脱色。如果一株木聚糖,它开始水解木聚糖在周围和区退化没有红色的形成。选择是每个殖民地与和没有明确的和透明的区域生产木聚糖酶和木聚糖酶非生产的菌株,分别。细菌菌落显示清晰的区域被选中,为净化木聚糖平皿上有两次,保持纯培养在木聚糖琼脂偏(pH值7.0,4°C)。隔离有最大间隙区被选中作进一步研究。 The selected bacterial isolate RSPP-15 was identified by morphological and biochemical characterization as per Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology [16]。RSPP-15的身份验证从微生物技术研究所(IMTECH)、昌迪加尔、印度、基于表型(16 s rDNA)和生物化学测试。细菌隔离种植RSPP-15木聚糖营养琼脂偏55°C的24 - 48 h。成年偏被储存在4°C和亚文化每两周。
2.2。粗酶制剂和酶试验
文化是生长在150毫升锥形烧瓶中含有50毫升的基础培养基含有2.0%木聚糖和0.5%硫酸铵。介质的pH值调整到7.0前绝育手术。瓶是接种和孵化55°C为24小时足够的增长。粗酶在12000 rpm过滤和离心10分钟和酶进行测定。木聚糖酶是由测量化验公布的还原糖反应birchwood木聚糖。木聚糖酶试验是由纳尔逊(17和索莫吉氏18500年)方法使用反应混合物组成的μL底物溶液(1.0% birchwood木聚糖在1.0 M磷酸盐缓冲剂,pH值7.0),100年μL的酶解,并维持1毫升的容量增加400μL蒸馏水。反应混合物是孵化10分钟55°C。反应是停止通过添加1毫升的碱性酒石酸铜解决方案和孵化在沸水浴10分钟冷却;然后arsenomolybdate解决方案添加颜色稳定。每个样本的光学密度与反应混合物在620 nm分光光度计(日本岛津公司、日本)。一个单位的酶活性被定义为1.0的酶释放μ克葡萄糖最小/毫升。
2.3。生物量测定
细菌细胞在肉汤被离心收获(10000转10分钟4°C),用蒸馏水洗净,干在烤箱80°C,直到达到恒重。生物质是干电池的形式报道质量(g / L)。
2.4。优化的物理化学和营养对木聚糖酶生产参数
影响木聚糖酶生产的各种工艺参数进行了优化单独和独立于他人。随后被用于所有的实验优化条件按顺序排列的。优化的基础培养基接种和培养在不同的温度下,也就是说,35岁,40岁,45岁,50岁,55岁,60岁,65年,70年,75年,在标准试验条件下80°C。样本提取每8 h间隔72 h研究潜伏期的影响。pH值对酶活性的影响决定通过测量酶活性在不同pH值从4.0到11.0在55°C使用不同的合适的缓冲区在柠檬酸浓度的100毫米缓冲区(pH值4.0 - -6.0,1米),磷酸缓冲(7.0 - -8.0),Tris-HCl缓冲(pH值8.0 - -9.0),和glycine-NaOH在标准试验条件下(10 - 11.0)。生长培养基补充不同的碳源,也就是说,果糖,葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、birchwood木聚糖,甘蔗蔗渣、麦麸、米糠、米糠、玉米麸皮(在2%的水平,w / v)。不同有机氮源(牛肉提取物、明胶、酪蛋白、麦芽提取物、蛋白胨、酵母提取物、0.5% w / v)和无机氮源(硝酸钠、硝铵、氯化铵,硝酸钾,硫酸铵,尿素,0.5% w / v)也用于酶生产。此后,优化碳和氮源在不同浓度进一步优化。
2.5。金属离子对酶活性和稳定性的影响
不同金属离子对酶活性的影响是通过使用FeSO调查4,CaCl2,氯化钠,MgCl2,MnCl2,ZnSO4,CuSO4,CoCl2,HgCl2,NiCl2在最后一集中5毫米和10毫米。酶是孵化与不同金属55°C 1 h研究金属离子稳定在标准试验条件下的酶和化验。酶活性测定进行反应的温度55°C和pH值7.0。酶的活性被认为是在标准试验条件下100%。
2.6。有机溶剂对木聚糖酶稳定性的影响
细胞自由上层清液与硝基最大的木聚糖酶活性过滤膜(孔隙大小0.22μ米)和孵化为30% (v / v)不同的有机溶剂,即n十二烷,n癸烷、异辛烷、n辛烷,二甲苯,n己烷,n丁醇、环己烷n庚烷、苯、甲苯、乙醇、甲醇和丙醇7天在螺旋输管55°C和120 rpm。剩余木聚糖酶活动估计与控制,溶剂是不存在。
2.7。原油特征酶
2.7.1。温度对酶活性和稳定性的影响
研究了温度对木聚糖酶的活性的影响通过孵化反应混合物在不同温度(35 - 100°C)。这种酶在不同的温度孵化,35 - 100°C, 1 h研究酶的稳定性。残余的木聚糖酶的活动是由执行反应温度55°C和pH值7.0。酶的活性被认为是在标准试验条件下100%。
2.7.2。pH值对酶活性和稳定性的影响
pH值对木聚糖酶活动的效果是衡量在4到10的pH值范围,使用适当的缓冲的浓度100毫米(4.0 - -6.0,醋酸钠;6.0 - -8.0,磷酸钠;8.0 - -10.0,在标准试验条件下Tris-HCl)。评估稳定pH值的函数,100μ与100年L纯化酶的混合μL缓冲解决方案和孵化的55°C 1 h;然后,整除的混合物被确定残余在标准试验条件下木聚糖酶活性(%)。
2.8。统计分析
每个实验进行了三次一式三份,平均标准偏差为每个实验结果计算使用Microsoft Excel。
3所示。结果与讨论
3.1。分离、筛选和鉴定Thermosolvent宽容的木聚糖酶产生细菌培养
六十(60)细菌隔离生产变量木聚糖区birchwood木聚糖琼脂板沾刚果红溶液后与氯化钠溶液进行了研究。间隙的区域隔离反映程度木聚糖活动。那些间隙区比> 1.0厘米被视为重要的隔离。60中细菌隔离,35细菌分离株表现出良好的木聚糖酶的活动由加载重新评估他们的文化肉汤在井birchwood木聚糖琼脂板与刚果红染色解决方案是氯化钠溶液(pH值7.0)。文化汤具有良好的木聚糖酶活动清除> 1.0厘米以上区域内4 - 5 h孵化的55°C,从而表明了胞外木聚糖酶的性质。显示最大间隙区直径,隔离RSPP-15被选中作进一步研究。
有效应变RSPP-15杆状,革兰氏阳性,运动型,需氧菌和兼性自然。这对乙偶姻给了积极的结果,过氧化氢酶和氧化酶试验。它成长在一个广泛的pH值(4.0 -11)、温度(10 - 85°C),和氯化钠浓度(0.0 -12%)和能够水解明胶、酪蛋白、淀粉、渐变20、40、80。它产生的酸(乙酸、乳酸)葡萄糖、木糖、甘露糖醇、阿拉伯糖。它给了积极的柠檬酸利用率和硝酸盐还原试验。压力是halotolerant增长0.0 - -12%氯化钠的存在。的形态和生化特征,确定为芽孢杆菌由MTCC sp. MTECH、昌迪加尔(印度)。16 s rDNA序列分析显示99.3%的同源性芽孢杆菌vallismortis菌株,它被指定为芽孢杆菌vallismortisRSPP-15。16 s rDNA序列是提交给基因库(金桥:619483)。应变RSPP-15在同一集群的系统发育树(图1与不同的菌株)芽孢杆菌vallismortis。然而,16 s rDNA序列分析表明它是一个不同的和新颖的应变芽孢杆菌vallismortis。
3.2。温度对木聚糖酶产量的影响
在深层发酵温度对木聚糖酶产量的影响的一个重要参数。图2描述最大酶生产(560 U /毫升)获得了55°C为2.3 g / L生物质生产而最低(119.8 U /毫升)被观察到35°C。它保留了80%的活动在75°C。类似的结果为木聚糖酶活性的最佳温度芽孢杆菌aerophilusKGJ2报道了Gowdhaman et al。19]。木聚糖酶最适条件相似的温度已经报告了地衣芽孢杆菌在广泛的40°C到100°C (20.]。从我们的观察表明,木聚糖酶芽孢杆菌vallismortisRSPP-15可以用作工业应用在35 - 70°C的温度范围。大多数工人的报道,木聚糖酶芽孢杆菌sp.保留100%的活动70 - 80°C (8,21]。热稳定的木聚糖酶发现潜在的应用在许多行业22]。木聚糖酶酶产生的B。vallismortisRSPP-15显示有趣的特征和属性,这似乎是一个潜在的候选人在饲料和食品工业中的应用。
3.3。对木聚糖酶生产不同的潜伏期的影响
优化后的温度对木聚糖酶生产的液体培养基中,潜伏期为酶生产进行优化。结果清楚地表明B。vallismortisRSPP-15显示最大689.2 U /毫升酶生产2.3 g / L生物质生产孵化(图48 h内3)。进一步增加在潜伏期没有增加酶的酶生产,但稳定在72年是87%。同样,Nagar et al。23]和Kamble Jadhav [24)报道,从其他酶效价最高的芽孢杆菌种虫害记录在48 h和72 h。与我们的结果相比,Kumar et al。25)报道,木聚糖酶的生产b、VLK-1 96年最大(29318 IU / g) h,之后逐渐减少观察。它可能是由于变性或分解的木聚糖酶由于与其他组件的交互中,据报道在别处(24]。培养时间取决于文化的特点,增长率和酶的生产。因此我们产生木聚糖酶菌株培养48 h内,因此比报道上面提到的其他工人。
3.4。初始pH值对木聚糖酶产量的影响
介质的初始pH酶生产中发挥着至关重要的作用。研究初始pH值对木聚糖酶生产的影响,使用不同的缓冲区中调整。这是观察到的最大生产木聚糖酶(756.9 U /毫升)为2.5 g / L生物质生产的压力b . vallismortisRSPP-15在pH值达到7.0。木聚糖酶产量也显著的pH值在6.0 - -9.0,而生产更少的pH值在10.0 - -11.0(图4)。酶保留89%的活动在pH值为9.0,表明一个alkaliphilic的性质B。vallismortisRSPP-15。类似的pH值最佳的木聚糖酶的生产芽孢杆菌sp.报道了et al。古哈26]。酶稳定在碱性条件下的特点是数量减少的数量的增加酸性残留物和精氨酸(27]。微生物的增长大大影响介质酸度,影响营养物质的运输以及微生物的酶系统(11]。如果介质的pH值是不利的,增长和木聚糖酶的生产可能会限制由于衬底难接近19]。
3.5。碳源及其浓度对木聚糖酶产量的影响
不同碳源,即淀粉、甘蔗蔗渣,birchwood木聚糖、麦麸、米糠、稻壳、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、浓度为2.0% (w / v)单独测试的基础培养基的最佳温度,潜伏期,pH值观察对酶产量的影响B。vallismortisRSPP-15。这些碳源,birchwood木聚糖被发现最好的木聚糖酶生产(980 U /毫升)和2.6 g / L生物质生产甘蔗蔗渣紧随其后(923 U /毫升)在48 h(图5)。同样,加戈et al。28和古等。26)报道,芽孢杆菌haloduransMTCC 9512和芽孢杆菌sp.给最高的酶产量与birchwood木聚糖甘蔗蔗渣紧随其后。
B。vallismortisRSPP-15显示相当大的酶生产果糖、乳糖和蔗糖(图5)。几个工人也报告说,大多数芽孢杆菌种虫害显示相当大的酶生产的蔗糖、果糖、乳糖(19,24]。B。vallismortisRSPP-15也显示相当大的酶生产的小麦麸皮、米糠、玉米麸皮(图5)。达到了相似的结果芽孢杆菌sp.的麦麸和米糠据古et al。26]。b . vallismortisRSPP-15显示最小酶产生的葡萄糖(图5)。加戈et al。28]也观察到没有木聚糖酶的生产B。haloduransMTCC 9512年媒介与葡萄糖补充。生产被压抑在葡萄糖的存在暗示可能通过降解物阻遏监管。基因的表达编码胞外水解酶如木聚糖酶通常是由特定的底物(激活29日]。
在另一组实验中,不同浓度的birchwood木聚糖在中木聚糖酶生产测试在同一碳源进行生长条件。B。vallismortisRSPP-15显示2340 U /毫升木聚糖酶产量为2.4 g / L生物质生产1% birchwood木聚糖;高于这个浓度酶产量略有下降(图6)。同样,et al。古哈26)报道,最高的木聚糖酶活性得到木聚糖时使用1%浓度和酶水平降低木聚糖浓度进一步增加,然而,一些其他工人报道,最大0.5%木聚糖酶的生产(19,24]。
3.6。氮源对木聚糖酶产量的影响
无机和有机氮源,即蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、麦芽提取物、明胶、酪蛋白、尿素、硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵,硫酸铵、氯化铵、0.5% (w / v)的速度被用于生产木聚糖酶(图的基础培养基7)。隔离是最大酶生产的牛肉膏修改媒介(3245 U /毫升)其次是蛋白胨、氯化铵、硫酸铵。类似的观察也报道了Swarnalaxmi et al。20.)和Gowdhaman et al。19]。Haddar et al。30.)也报道,氯化铵支持增长和酶菌株分泌的酵母提取物和大豆蛋白胨紧随其后。等氮源尿素显示对木聚糖酶生产的抑制作用B。vallismortisRSPP-15。Gowdhaman et al。19)已经报道,补充5 g / L的尿素浓度下降导致了木聚糖酶的生产。
牛肉提取物不同浓度(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,7.0,8.0,9.0和1.0%,w / v)在中还测试了木聚糖酶生产的增长条件的氮源进行评估。B。vallismortisRSPP-15显示更高的酶生产(3768 U /毫升)为2.6 g / L生物质生产牛肉膏浓度0.3%;浓度进一步增加,酶生产减少(图8)。
3.7。金属离子对酶活性和稳定性的影响
在这个实验中,最大的木聚糖酶生产在有限的存在2 +其次是Ca(10毫米)2 +、镁+ 2、锌+ 2,菲+ 3。在这个实验中,最大酶活性(3768 U /毫升)认为100%的木聚糖酶的活动。结果表明,木聚糖酶显示最大相对活动(181.5,153.7,147.2,133.6,127.9%)和稳定性(138.2、119.3、113.9、109和104.5%)的公司2 +、钙2 +、镁+ 2、锌+ 2,菲+ 3分别离子。其他研究者也报道,有限公司2 +、钙2 +、镁+ 2、锌+ 2,菲+ 3离子强刺激的木聚糖酶活性(31日,32]。酶活性增强在金属离子的存在,这可能是由于酶的结构构象的改变33]。木聚糖酶活性略Mn所抑制2 +(表1)。木聚糖酶是强烈抑制铜的存在2 +和汞2 +。也观察到类似的结果的枯草芽孢杆菌(34),芽孢杆菌haloduransPPKS-2 [35),而Simplicillium obclavatum(36]。据报道,Hg的木聚糖酶活性抑制2 +离子,这可能是由于其与含巯基的团体或接近半胱氨酸残基的酶的活性部位(37]。木聚糖酶的抑制铜2 +离子可能是由于外生阳离子和相关蛋白阳离子之间的竞争,导致金属酶活性下降。
3.8。有机溶剂对木聚糖酶稳定性的影响
另一种方法,各种有机溶剂的影响(30%,v / v)对木聚糖酶稳定也调查了7天,和结果中描述表2。的木聚糖酶B。vallismortisRG-01非常稳定的存在下的所有有机溶剂的研究。观察到,除了苯、甲醇,乙醇,其他溶剂的存在提高了木聚糖酶的活动。孵化后n十二烷、异辛烷、n癸烷、二甲苯、甲苯、n己烷,n丁醇、环己烷、木聚糖酶活性增加到230.8,137.7,219.8,190.5,194.7,179.3,107年111.6%,分别。存在的苯、甲醇和乙醇略减少残余的木聚糖酶的活动85.8,88.4和78.3%,分别。有机溶剂稳定的碱性蛋白酶已报告铜绿假单胞菌PseA古普塔和哈雷(38]。10天后孵化的有机溶剂(25%,v / v)残留蛋白酶活动是112,75,98,92,97,94,75,90,96,102,和104%的乙醇,1-butanol,苯、甲苯、二甲苯、环己烷、正己烷、庚烷、异辛烷,n癸烷,n分别十二烷。Abusham et al。39)也报道蛋白酶枯草芽孢杆菌应变兰德与增强活动的有机溶剂(25%,v / v)的日志价值蛋白酶活动减少了37 - 65%。因此明显的从我们的木聚糖酶的研究芽孢杆菌vallismortisRG-01非常稳定的存在广泛的亲水和疏水有机溶剂用于这项研究。因此,它是合格的用于生物技术的应用和生物乙醇生产,及其所有属性使它成为一个有用的工具酶技术在纸浆和造纸工业40]。
3.9。原油特征酶
3.9.1。温度和pH值对酶活性的影响
温度对木聚糖酶活性的影响的一个重要参数。图9显示超过65 - 90%的最大活动之间保留45°C到65°C和100%左右活动保留在70°C。木聚糖酶最适条件相似的温度已经报告了芽孢杆菌aerophilus广泛的KGJ2 30°C到70°C (19]。从我们的观察表明,木聚糖酶芽孢杆菌vallismortisRG-01可以用作工业应用温度范围的45°C - 70°C。
pH值对酶活性的影响进行检测评估酶活性在不同pH值从4.0到10.0使用不同的合适的缓冲区。粗酶的芽孢杆菌vallismortisRSPP-15活跃在一个广泛的pH值从5.0到9.0。可以看出最高的木聚糖酶的活动建立在pH值7.0;另一方面,它被发现是最稳定的pH值在7.0 - -8.0(图10)。类似的模式的pH值最优酶活性也发现芽孢杆菌sp。NTU-06 [41]。上方和下方的pH值,木聚糖酶活性迅速下降。木聚糖酶的芽孢杆菌vallismortisRSPP-15稳定在一个范围的pH值5.0 - -9.0和10.0 pH值约85%的活动被保留(图10)。酶稳定在碱性条件下的特点是数量减少的数量的增加酸性残留物和精氨酸(27]。
4所示。结论
thermosolvent稳定木聚糖酶是由小说隔离b . vallismortisRSPP-15。生物体似乎有更大的潜力增强酶生产通过营养和物理参数的优化。宽容对有机溶剂和金属离子在压力条件下促进其使用的各种流程。由于其耐热的特性,它的木聚糖酶可能有潜在用途在洗涤剂等行业,食品、制药、皮革、农业、牛皮纸浆预漂过程和分子生物学技术。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
金融援助委员会科学技术,印度,非常认可Rajeeva白肢野牛,索尼女子,要不是Rai, Versha斯利瓦斯塔瓦。