埃及儿童激素抵抗肾病综合征患者线粒体复合体I缺陷

摘要

背景和目标．肾病综合征(NS)是儿童最常见的肾小球疾病之一。高达20%的患者是类固醇耐药(SRNS)，这是一个具有挑战性的子集，具有发展为终末期肾病的高风险。线粒体疾病(MIDs)的肾脏表现包括肾病综合征、肾功能不全、肾结石、巴特样综合征、局灶节段性肾小球硬化和肾钙化。当前研究的目的是测量线粒体复合物I在诊断为SRNS的儿童肾脏活检中与类固醇敏感肾病综合征(SSNS)患者相比的活性，以阐明其在发病机制和预后中的作用，为进一步的遗传学工作提供依据。对象和方法．120例根据临床和实验室检查结果诊断为肾病综合征的患者的肾活检，分为SRNS组(60例)和SSNS组(60例)。两组均进行肾活检和肌肉匀浆中线粒体复合物I的病理研究和分光光度测定。结果．在SRNS组中有44例患者(73%)发现了显著的血缘关系阳性，而在SSNS组中有33例患者(55%)发现了显著的血缘关系阳性。复合物I活性在SRNS组(0.2657±0.1831 nmol/ml/min)明显低于SSNS组(0.4773±0.1290 nmol/ml/min) ( ）.在SRNS组中复合物I活性与蛋白尿重呈显著正相关(r0.344, ）.两组间血清C3、C4水平差异有统计学意义( ，分别为0.053)。结论．有肾病综合征主诉的患者线粒体复合物I缺乏可能在他们对类固醇治疗的反应性和SRNS的发展甚至疾病的预后中发挥作用。

1.介绍

肾病综合征(NS)是一种以大量蛋白尿(>3 gm尿蛋白)、低白蛋白血症、水肿和高脂血症为特征的临床症状[1］．它是儿童最常见的肾小球疾病之一，全世界NS平均发病率为每10万儿童2-16.9 [2］．大约80%的儿童在皮质类固醇治疗4周内完全缓解，被认为是类固醇敏感肾病综合征(SSNS) [3.］．大多数激素应答患者(60-70%)在完全缓解后会出现>1复发，其中30%会被归类为激素依赖[4］．第三类是类固醇抵抗性肾病综合征(SRNS)，定义为每天2 mg/kg/d的强的松治疗4周后仍无缓解[3.］．一般来说，SRNS，特别是局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，如果患者没有部分或完全缓解，在确诊5年内发生终末期肾病(ESRD)的风险为50% [5］．

线粒体疾病是一组异质性疾病，其最主要的临床表现与神经和肌肉表型相关;然而，随着对线粒体疾病的认识和认识的提高，临床表现的范围已经扩展到包括其他器官系统，如心脏、肝脏、胃肠道和肾脏[6］．

肾脏表现可能是众所周知的线粒体疾病综合征的一部分，如MELAS(线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样症状)、mermerf(肌阵挛、红色纤维不规则的癫痫)、Pearson综合征、Kearns-Sayre综合征、和利综合征，或作为唯一的疾病表现或临床特征不完全符合界定的综合征[7］．

线粒体呼吸链酶复合体I (NADH:泛素氧化还原酶)缺乏被认为是线粒体疾病中最常见的单一酶缺乏[8］．Complex I的结构构建块和额外的蛋白质亚基都由44个不同的基因编码[9］．这些基因的致病突变已被检测到，为这些患者的疾病提供了遗传基础，可以认为是原发性复合物I缺陷[10］．

本研究的目的是检测埃及儿童SRNS患者中线粒体复合物I缺陷的频率及其在预后中的作用，以便进一步对潜在的遗传疾病进行分子研究。

2.材料和方法

本研究在埃及开罗大学儿童医院(Cairo University Children 's hospital, CUCH)医学院遗传代谢疾病实验室进行，根据肾病综合征的临床和实验室诊断标准，经临床招募后纳入120例小儿患者。患者进一步分为两组，60例对类固醇治疗(SSNS)有反应的患者作为对照组，60例对类固醇治疗(SRNS)无反应的患者。本研究得到了开罗大学研究伦理委员会(REC)的批准(参考编号:027901)。n - 15 - 2018)。患者和对照组的父母对研究中所进行的所有程序都给予了书面知情同意。

包括120名埃及儿科患者，67名男性（55.8％）和53名女性（44.2％）;关于SRNS组，患者的平均年龄为7.5±3岁，而SSN是6.4±2.9岁。他们是从海上大学医学院的儿科肾病门诊诊所招募。根据临床和实验室标准被诊断为NS，60名患者（50％）怀疑由于类固醇治疗后4周缺乏缓解，患有SRNS，并且在类固醇治疗后被诊断为SSNS。所有患者都使用14尺度活检针进行肾活检，给出两个核心，一个用于病理研究，另一个在液氮中冷冻并保持在-80至生物化学复合物I测定（所有人口统计，临床，病理和生物化学数据可在补充中获得表格）.

样品在冰上均质，1:9 ( )，在320 mmol/L蔗糖、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和10 mmol/L Trizma-base中，pH 7.4，使用预冷手持玻璃均质器。每个样本在9-10个周期内均质约15 - 20mg肾组织，然后转移到Eppendorf管中。

用分光光度法测定线粒体呼吸链酶和柠檬酸合酶(CS)活性[11，12］．EC1.6.5.3复杂我(NADH泛醌还原酶)活性测定的rotenone-sensitive NADH氧化在340纳米,而CS (EC 2.3.3.1)活动是由5-thio-2-nitrobenzoic酸的形成孵化后组织匀浆与乙酰辅酶a、草酰乙酸、5,50-dithiobis——(2-nitrobenzoic酸),在412纳米12］．复合物I活性以CS(一种线粒体标记酶)活性的比例表示，以标准化nmol/ml/min的样品线粒体富集。计算极差、均值、标准差和Z-score。患者与对照组之间的统计学差异用p值表示(显著性<0.001)。

3.结果

本研究共纳入120例患者，分为两组，第一组为SRNS(60例)，第二组为SSNS(60例)。两组间女性53例(44.2%)，男性76例(55.8%)，差异有统计学意义。诊断时SRNS组的年龄(均值±SD 7±SD年)与SSNS组的年龄(均值±SD 6.5±2.8年)差异有统计学意义( ）.

主要病理表现为局灶性节段性肾小球硬化(FSGS) 44例(73.3%)，SSNS 40例(66.7%)，其次为轻度肾小球肾炎(MCGN)， I组8例(13.3%)，II组16例(26.6%);I组7例(11.7%)，II组4例(6.7%)。IgA肾病在I组中仅出现1例(1.7%)，但在II组中未发现。

蛋白尿是诊断肾病综合征的重要实验室发现;本研究纳入的患者中，SRNS组24小时尿蛋白水平为4.5868±1.2451 g/d, SSNS组为3.7205±1.466 g/d ( ）.

两组间血清C3浓度差异有统计学意义;SRNS组为77.23±21.4 mg/dl, SSNS组为95.78±32 mg/dl (0.000)。血清C4浓度两组间差异有统计学意义(0.053);其中位水平为7.4 mg/dl (25^th-75 - 4.5^thⅱ组中位水平为5.5 mg/dl (25^th-75 - 2.7^th10.2)。

在所有患者的所有肾脏活检中进行Complex I检测;SRNS组活性为0.2657±0.1831 nmol/ml/min;SSNS组为0.4773±0.1290 nmol/ml/min，两组间差异有统计学意义( ）.SRNS患者肾活检中复合物I活性与蛋白尿严重程度之间存在统计学正相关(r0.344,0.00)(图1）.

4.讨论

肾病综合征是世界范围内儿童常见的一种肾小球疾病，其发病率和不同种族的类固醇反应性均有显著差异[13］．肾病综合征的平均发病率为每10万儿童2-16.9。了解不同种族的差异可能指向导致肾病综合征的潜在因素，这仍然是难以捉摸的，并可能突出解释药物反应差异的因素[2］．

线粒体呼吸链酶NADH-Q氧化还原酶(复合物I)由核基因和线粒体基因的混合物编码[14］．大多数儿童线粒体复合体的疾病是由核基因突变引起的，尽管也发现了线粒体DNA的突变[9］．线粒体呼吸链酶紊乱的一个问题是，突变可能只在受影响的组织中表达，有时，遗传筛查不能给出明确的诊断，因此可能需要进一步的生化和免疫组织化学检查[12］．因此，尽管有侵袭性，但对受影响器官的评估可能更合适，但确认呼吸链酶异常可能有助于确定最适当的遗传试验[14]使用CS活性作为参考控制诸如样本的线粒体富集的变量[11］．

本研究阐明了通过常规临床肾活检获得的肾组织中检测线粒体复合物I的可能性，并概述其在SRNS的发展和预后中的作用。这是第一次在肾组织中测量复合物I。这是重要的，因为它表明，如果以CS活性的比值表示，年龄特异性参考区间可能不是肾复合物I活性的必要指标。

120名儿童被纳入本研究;他们的平均年龄为7岁，从1.5岁到15岁不等。其中女性53名(44.2%)，男性67名(55.8%)。SRNS组44例(73%)，SSNS组33例(55%)。

在诊断为SRNS的患者中，复合物I活性的范围为0.022 - 0.64 (Mean 0.2657, SD 0.1831)，而在SSNS中为0.21 - 0.66 (Mean 0.4773, SD 0.1290)。根据我们的结果，复合物I在肾组织中的活性范围与其在骨骼和肝脏组织中的对应范围不同(0.104-0.268;0.054-0.22 nmol/ml/min)，但根据Ghose等的工作[14，15研究人员报告了相同的发现，尽管与我们的研究相比，复合物I的活动范围存在差异[12］．这可以用种族差异和样本大小的差异来解释。

线粒体疾病在表型表现中显示出显著的变异性;同时，基因缺陷只有在超过阈值水平时才会出现表型表现，这种现象被称为“表型阈值”，因此对其余无复合I缺陷的高度怀疑患者必须进行随访[16］．

目前的研究表明，与SSNS组相比，SRNS组复合物I活性有统计学上的显著差异( ）.计算所有样本活动的平均活性、标准差(SD)和Z-score，因此，在SRNS组(41.6%)的25/60例患者中验证了复合物I缺陷，其中17/25为FSGS, 4/25为MCGN, 3/25为非特异性病理发现。关于血缘关系，19/25为阳性血缘关系，6/25为阴性血缘关系，这一发现加强了对常染色体隐性遗传模式的关注，以进一步对最常见的基因变异进行分子研究或全外显子测序。

SSNS组中5/60例患者(8.3%)，4/5例患者表现为FSGS, 1/5患者病理研究中有轻微病变。所有患者均为阳性血亲。

根据我们的结果，复合物I在肾组织中的活性范围高于其在骨骼和肝脏组织中的对应范围(0.104-0.268;分别为0.054 -0.22 nmol /毫升/分钟);这与Ghose等人的工作一致[14，15研究人员报告了相同的发现，尽管复合物I的活动范围比我们的研究具有可变性[12］．这可以用种族差异和样本大小的差异来解释。

据我们所知，这是埃及首次在肾活组织检查中测量线粒体复合物I的研究，尽管常染色体隐性线粒体疾病的高患病率可能是由于近亲结婚的高比率。

目前研究的不足之处在于不能确定来自肾髓质或皮质的组织是否具有不同的复合物I活性，这可以通过从不同部位进行肾活检来测量复合物I和评估它们之间的活性差异来克服。

5.结论

线粒体复合物I缺乏可能在肾病综合征的发病机制和类固醇治疗的反应性中发挥作用。

数据可用性

可根据要求提供数据。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

补充材料

人口统计学，临床，病理和生化数据可在补充表。（补充材料）

参考文献

L. El Bakkali, R. Rodrigues Pereira, D. J. Kuik, J. C. F. Ket, J. a . E. Van Wijk，“荷兰肾病综合征:一项基于人群的队列研究和文献综述，”小儿肾脏学第26卷第2期8, pp. 1241-1246, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
R. Chanchlani和R. S. parkh，《儿童肾病综合征的种族差异》，在儿科领域，第4卷，第2-7页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
D. Mekahli, a . Liutkus, B. Ranchin等，“特发性类固醇耐药肾病综合征的长期结局:一项多中心研究，”小儿肾脏学，第24卷，第2期8, pp. 1525-1532, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
K. Nakanishi, K. Iijima, K. Ishikura等，“ISKDC方案的两年预后和特发性肾病综合征儿童的频繁复发风险，”美国肾病学会临床杂志，第8卷，第2期5, pp. 756-762, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
M. A. Saleem，《类固醇抵抗性肾病综合征的新进展》，小儿肾脏学第28卷第2期5, pp. 699-709, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
P. Niaudet和A. Rötig，《线粒体细胞病变中的肾脏》肾脏国际第51卷第1期4, pp. 1000-1007, 1997。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
S. R. Lederer, T. Klopstock, H. Schiffl，“MELAS:成人肾脏移植患者的线粒体疾病”，维纳Klinische Wochenschrift第122卷11-12，页363-365,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
R. J. T. Rodenburg，《线粒体疾病的生化诊断》，遗传代谢疾病杂志第34卷第3期2, pp. 283-292, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
E. Fassone和S. Rahman，“复合体I缺陷:临床特征、生物化学和分子遗传学”，医学遗传学杂志，第49卷，第49期。9，第578-590页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
M. Mimaki, X. Wang, M. McKenzie, D. R. Thorburn，和M. T. Ryan，“理解健康和疾病中的线粒体复合物I组装，”生物化学与生物物理学报-能量学(一九一七卷第一八二期)6，第851-862页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
A. J. Howie, M. A. S. Ferreira，和D. Adu，“肾脏活检标本中简单测量慢性损伤的预后价值”，肾脏透析移植，第16卷，第5期。6，页1163-1169,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
I. P. Hargreaves，《线粒体疾病的生化诊断和监测的当前策略》，临床微生物学杂志, 2018年。视图:谷歌学术搜索
J. A. Mayr, T. B. Haack, P. Freisinger et al.，“综合呼吸链缺陷的频谱”，遗传代谢疾病杂志第38卷第2期4, pp. 629-640, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
A. Ghose, C. Taylor, A. Howie, A. Chalasani, I. Hargreaves, D. Milford，“人类肾脏活检标本中呼吸链酶活性的测量”，临床医学杂志，第6卷，第2期第9页，2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
D.克雷蒂安，P. Rustin, T. Bourgeron, A. Rötig, J. M. Saudubray，和A. Munnich，“人体组织中呼吸链活动的参考图表”，我们共同Chimica学报第228卷，第228号1，页53-70,1994。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
S. Parikh, A. Goldstein, M. K. Koenig等人，“来自线粒体的共识声明，”社会医学，第十七卷，第二期9，第689-701页，2016。视图:谷歌学术搜索

国际肾脏病杂志

摘要