紧密连接蛋白Claudin-1在人新月体性肾小球肾炎中的表达

摘要

人类肾小球肾炎（GN）中新月形细胞的起源尚不清楚。一些动物研究表明，鲍曼囊壁上皮细胞（PECs）是增殖细胞的主要成分，PEC特异性紧密连接蛋白claudin-1在新月体病变中表达。我们研究了人类肾小球肾炎中claudin-1的表达。对17例新月形肾活检标本进行claudin-1免疫组织化学检测。免疫荧光双染色法检测claudin-1与细胞内紧密连接蛋白ZO-1的共定位。Claudin-1主要表达于这些人类GN患者细胞新月体病变中增殖细胞的细胞间接触部位。少量新月形细胞显示claudin-1的连接外定位。claudin-1与ZO-1共定位于相邻增殖细胞的细胞间接触部位。在对照样本中，PEC中的claudin-1染色呈阳性，但足细胞中的claudin-1染色呈阴性。我们的研究结果表明，claudin-1作为包括ZO-1在内的紧密连接蛋白复合物的一个组成部分参与新月形的形成。claudin-1与ZO-1共定位意味着在新月体病变中形成功能性紧密连接复合物，以防止过滤分子从Bowman间隙穿透引起的间质损伤。

1.导言

毛细血管外增生性细胞病变或细胞新月形是肾小球严重炎症反应的标志，已在各种形式的肾小球肾炎(GN)中被证实[1.]。在各种形式的肾小球肾炎中可以观察到新月形，包括迅速进展的肾小球肾炎、感染后肾小球肾炎、IgA肾病、紫癜性肾炎和系统性红斑狼疮。虽然这些新月形病变的起源仍有争议，但最近的研究表明，不仅炎性细胞，而且固有肾小球上皮细胞(即鲍曼囊壁上皮细胞(PECs)和肾小球上皮细胞或足细胞)对这些新月形病变的发展也有贡献[2.]。Smeets等利用遗传细胞系追踪方法证实，PECs是新月体动物模型细胞新月体的主要成分，尤其是在早期[3.]。

Claudin是一种四跨膜蛋白，是上皮细胞和内皮细胞紧密连接复合物的关键成分[4.,5.]在claudin亚型中，claudin-1在GN小鼠模型和人类患者的PEC紧密连接处表达，因此被视为PEC的标志物[3.,6.,7.]。

考虑到这些观察，很可能PECs是各种形式的人类GN细胞新月的主要成分，而claudin-1通过在增殖细胞之间形成紧密连接参与细胞新月的形成。我们的目的是研究紧密连接蛋白claudin-1在人类GN新月体病变中的表达和定位。

2.材料和方法

2.1。主题

对17例新月型患者的肾活检标本进行了研究。作为对照，我们选取了5例接受了肾切除术的非侵袭性肾肿瘤患者的4个肾活检标本，其中没有新月状形成(轻微肾小球异常、微小肾炎综合征、IgA肾病和膜性肾病)和肾脏形态正常的部分。在那些提供新月形组织活检样本的患者中，5例有IgA肾病，2例有紫癜性肾炎，7例有髓过氧化物酶(MPO)抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关血管炎，1例有蛋白酶3 (PR3-) ANCA相关血管炎，一个有抗肾小球基底膜(GBM)抗体与快速进展的肾小球肾病相关，一个有狼疮肾炎。根据Dokkyo医科大学Koshigaya医院使用的常规诊断和治疗适应症方案进行肾活检或肾切除术。获得的样品要么立即用福尔马林固定，然后包埋在石蜡中，要么在−80°C快速冷冻。细胞新月形被定义为鲍曼氏空间中至少存在两层细胞。两位肾病医生确认了月牙的存在。本研究纳入患者的临床特点见表1.。本研究中的所有程序均按照赫尔辛基宣言指南进行。多库医学大学Koshigaya医院的机构审查委员会（IRB）批准了本研究（IRB批准号：1206），并获得了所有参与患者的书面知情同意。

2．2．免疫组织化学

手术切除肾脏形态学正常部分的肾活检标本或组织块立即用福尔马林固定并包埋在石蜡中。三个μm组织切片在分级乙醇系列中脱蜡和再水化。抗原回收通过高压灭菌进行10分钟 用3%过氧化氢酶阻断内源性过氧化物酶活性，并使用无蛋白封闭血清（日本达科）防止非特异性蛋白结合。在达科真抗体稀释液（Dako）中稀释克劳丁-1的兔多克隆抗体（英国剑桥ab15098，Abcam）或兔多克隆抗ZO-1（Invitrogen）用作一级抗体（稀释度为1 : 切片与一抗孵育1小时 然后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗载玻片三次，并按照制造商的说明用Histofine简单染色MAX-PO（多）二级抗体（日本日立生物科学公司）孵育切片。用苏木精复染进行核染色。

2.3. 免疫荧光

三个μm冷冻切片在−20℃甲醇中固定10分钟，用7.4%的PBS洗涤3次，用蛋白块无血清处理30分钟，用PBS洗涤3次。然后，在室温下用小鼠单克隆抗claudin 1抗体(1:100)(ab56417, Abcam)孵育2小时，用PBS洗涤3次，用Alexa Fluor 488标记的抗小鼠IgG(1:1000)孵育30分钟(Cell Signaling Technology, Inc, Danvers, MA, USA)。再次用PBS洗涤3次，蛋白Block无血清处理30 min, PBS洗涤3次，与兔多克隆抗zo -1 (1: 400) (Invitrogen)在4℃下孵育过夜。样本用PBS洗涤3次，用Alexa Fluor 555偶联抗兔IgG (1:10 00) (Cell Signaling Technology)孵育30分钟。用DAPI进行核染色。使用兔多克隆抗occludin抗体(Cat. 71-1500, Invitrogen，美国)(1:200)和Alexa Fluor 555偶联抗兔IgG进行occludin免疫染色。阴性对照用PBS代替一抗。用激光扫描共聚焦显微镜(OLYMPUS BX-51, OLYMPUS, Tokyo, Japan)检测免疫荧光。

２.４.透射电子显微镜法

小块肾活检标本(约0.5 - 1mm)^3.)用2.5%戊二醛固定在0.05 M磷酸盐缓冲液（pH7.4）过夜。戊二醛固定的活检标本在1%OsO中后固定_4.在0.05 磷酸缓冲液30分钟 最小，嵌入环氧树脂中。超薄切片（约100 纳米）通过铜栅制备，然后用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在透射电子显微镜下观察（日本东京日本密度公司JEM-1010）。

2．5．的形态学分析

在每个活组织检查样本中，用新月体GN ()．用ImageJ v. 1.47软件追踪肾小球和claudin-1阳性区域的边界，测量肾小球中claudin-1阳性区域的百分比(http://rsb.info.nih.gov/ij). 2 × 5 取肾切除后的组织块（mm大小）作为对照()．采用Stata版本13 (Stata Corporation, College Station, TX)的wilcoxon秩和检验分析对照样本和新月体GN之间的差异。统计学显著性水平设为.

3.结果

3．1.免疫组织化学

Claudin-1沿着相邻PEC的细胞膜显示出强烈、尖锐的染色模式。在对照样品中，染色信号主要在细胞间接触部位检测到（图1（a）,1（b）)在细胞新月体中，claudin-1信号主要在所有检查样本中相邻增殖细胞的细胞膜中检测到（图2（a）,2（b）,2（c）,2（d）).偶尔，我们观察到连接外细胞膜和细胞质中的细胞对claidin-1呈阳性（图2（d）如箭头和箭头)。纤维状新月形或坏死性肾小球中未检测到claudin-1阳性细胞(图2（e）)．细胞新月形中也检测到ZO-1阳性细胞(图)2（f），箭头）。

3.2. 免疫荧光

Claudin-1只表达于肾小球中没有新月形形成的邻近PECs的细胞与细胞接触部位(图)3（a）).信号明显集中在点模式中。在相邻PEC的紧密连接复合体和足细胞的足突中观察到ZO-1染色（图3（b）).Claudin-1和ZO-1被共定位（图3（c）)在细胞新月体中，表达claudin-1的细胞为少数（图3（d）)，而ZO-1表达细胞(图3（e）)，但观察到反claudin-1和反zo -1双阳性(图3 (f))闭塞素是紧密连接复合体的另一种基本细胞间成分，在新月体病变中也有表达（图3 (g))．

3.3.透射电子显微镜

在电子显微镜下，新月形成细胞证实了紧密的连接结构(相邻细胞的细胞膜紧密接触)(图)4.，来自IgA肾病患者的活检样本）。

3.4.形态计量分析

对照组共59个肾小球(43例新月体性肾小球肾炎()进行评估。新月体肾小球中claudin-1阳性面积的中位数百分比(四分位数范围)分别为0.12(0.85-0.22)%和0.056 (0.34-0.88)%5.)．两组间差异有统计学意义()．

4.讨论

在本研究中，我们研究了claudin-1在各种人类肾小球疾病中的表达及其与ZO-1的共定位，包括IgA肾病、紫癜性肾炎、ANCA相关血管炎(MPO-ANCA和PR-3 ANCA)、抗gbm - rpgn和狼疮肾炎。我们得到了3个重要的发现。首先，claudin-1主要表达于新月体病变增生细胞的细胞间接触部位。其次，clodin -1的非交界性定位错误偶尔在新月形成细胞中被发现，但在对照肾脏样本的PECs中没有发现。第三，claudin-1与ZO-1共定位，ZO-1是上皮细胞紧密连接复合物的基本胞内成分[8.]，位于相邻新月形细胞的细胞间接触部位。

克劳丁-1最初是由Furuse等人于1998年发现的，当时为22岁 具有四个假定跨膜结构域的kD蛋白[9].将claudin-1引入成纤维细胞导致在这些本质上缺乏紧密连接的细胞中形成紧密连接链[10]在Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞中过度表达claudin-1可增加跨上皮电阻并降低细胞旁流量，因此claudin-1被认为有助于上皮细胞的屏障功能[11]。Claudin-1不仅对紧密连接的形成至关重要，而且对丙型肝炎病毒的细胞内进入也至关重要[12]作为四倍体蛋白CD81的辅受体[13]。到目前为止，至少有24个克劳丁家族的成员，具有组织特异性分布，已经在小鼠和人类中被确认。精确研究小鼠肾元片段中claudin亚型的表达模式[14]还有兔子[15].肾小球中，claudin-1[14,15]还有克劳丁-5[16]Kirk等人对人类肾皮质中的claudin表达进行了免疫组化分析，发现claudin-1在Bowman囊壁上皮、远端卷曲小管和集合管中表达[7.]。Smeets等人利用遗传细胞谱系追踪方法证实，在小鼠新月体性肾小球肾炎模型(注射抗小鼠肾毒血清诱导)中，新月体病变中的大部分细胞群来自PECS，这些病变中cladin -1呈阳性[3.]。他们的发现，结合我们的研究结果，提示在人肾小球肾炎的新月体病变中，claudin-1有助于相邻增殖细胞之间紧密连接的形成。

我们还发现，claudin-1的表达并不局限于相邻细胞的细胞间接触部位。在新月体性肾小球肾炎中，我们检测到组成细胞新月体的非连接细胞膜和细胞质中有claudin-1染色。在免疫荧光研究中，并非所有claudin-1都与ZO-1共定位。这些表达非连接claudin-1的细胞可能是浸润性免疫细胞，因为有报道称claudin和其他紧密连接蛋白在免疫细胞中表达[17]另一方面，众所周知，claudin的表达并不局限于上皮细胞中的紧密连接链。claudin-5可在嘌呤霉素氨基核苷（PAN）诱导的肾病大鼠足细胞的顶膜上发现[16]大鼠附睾基底外侧膜可见claudin-1[18]。各种因素，比如白细胞介素-1β[19]，幽门螺杆菌[20.]，地塞米松[21]，已知会影响claudin的表达和定位。此外，Dhawan等人证明了claudin-1在人类结直肠癌组织中的高表达，并且与正常粘膜相比，claudin-1的核和细胞质定位错误是常见的[22]他们通过免疫印迹证实，与RIE细胞（来源于非癌大鼠肠细胞）相比，克劳丁-1在SW480细胞（来源于原发性结直肠癌）和SW620细胞（来源于转移性病变）的核和细胞质部分的表达占优势。他们还利用这两种来自人类结直肠癌的细胞系证明，claudin-1表达的调节导致了被称为上皮-间充质转化（EMT）的表型变化，并提示β-catenin信号转导和E-cadherin表达可能是claudin-1诱导表型变化的机制。连接蛋白的错误定位可能参与了EMT, Reichert等研究发现MDCK细胞中ZO-1突变体被激活，该突变体由ZO-1的PDZ结构域组成，主要定位于细胞质中β-连环蛋白信号传导，降低上皮标记物表达[23]Bariety等人发现EMT发生在人类pauci免疫新月体肾炎的早期阶段[24]。由此可见，非交界性claudin可能存在于人肾小球新月中，并发挥着一些新的功能。有人提出，非连接细胞膜上的claudin可能是连接膜上claudin的储存库[25]然而，在本研究中，claudins在非连接细胞膜和细胞质中的作用仍不确定。最近，Ohse等人建立了条件性永生化小鼠肾小球壁上皮细胞[26]。使用pecs -specific细胞系可能有助于进一步阐明连接外claudin-1及其相关信号通路在新月形成中的作用。这个问题需要在以后的研究中加以阐明。

ZO-1是一个225 kD细胞内蛋白，是紧密连接复合物不可或缺的组成部分[8.]。ZO-1通过PDZ1结构域直接与claudin-1的cooh末端结合[27]。claudin-1的PDZ1结构域在正常紧密连接配合物的形成和发挥选择性分子通透性即屏障功能中起着关键作用[28]。在正常肾小球中，ZO-1在足细胞的横隔膜中表达[29]。在这项研究中，我们证实了ZO-1和claudin-1在人肾小球新月状细胞的增殖细胞中共定位。实际上，ZO-1信号的强度比claudin-1强，因此claudin-1部分与ZO-1共定位(图)3 (f))．各种各样的细胞包括免疫细胞和肾小球上皮细胞(即PECs和足细胞)有助于细胞新月形的形成。众所周知，不仅PECs，足细胞和免疫细胞也表达ZO-1 [17]。虽然claudin-1阳性的壁上皮细胞已被证明是新月细胞的主要群体，在月牙性肾小球肾炎小鼠模型中[3.]人类肾小球新月体中的ZO-1阳性和claudin-1阴性细胞可能是浸润性免疫细胞或足细胞。在我们的研究中，人类肾小球新月体中的少数claudin-1阳性细胞可能表明PEC对cre形成的贡献与新月体肾小球肾炎的小鼠模型相比，嗅觉损伤相对较小。Ohse等人提出在抗GBM肾小球肾炎的实验模型中使用低分子量和高分子量示踪剂，不仅显示Bowman囊中的基底膜，而且还显示PEC中的紧密连接，可能作为第二个肾小球屏障预防肾小球疾病过滤分子从鲍曼空间穿透引起的间隙损伤[30.]因此，在人肾小球肾炎中，毛细血管外增生病变中与claudin-1和ZO-1形成紧密连接复合物有可能通过赋予新月体屏障特性，有助于最小化溶质渗漏引起的间质损伤。进一步的实验，如使用PEC特异性细胞lin进行通透性分析e将有助于验证这一假设。

总之，我们的结果表明，claudin-1在人肾小球肾炎的细胞新月形中表达。Claudin-1主要分布于新月体病变增生细胞的细胞间接触部位。这种分子在交界外细胞膜和细胞质中轻微但显著的分布表明claudin-1的非交界作用。claudin-1与ZO-1的共定位提高了在新月体病变中形成功能性紧密连接复合物的可能性，该复合物旨在通过从Bowman空间渗透过滤分子来防止间质损伤。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Takuya Okamura提供了免疫组化，Kazunori Fukuda提供了免疫荧光，Mutsuo Jinnai提供了电子显微镜，以及Dokkyo医科大学Koshigaya医院泌尿科的成员，他们获得了接受肾切除术患者的肾脏样本。

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