IJN 国际肾脏病学会杂志 2090 - 2158 2090 - 214 x Hindawi出版公司 598670年 10.1155 / 2014/598670 598670年 研究文章 紧密连接蛋白的表达在人类新月形Claudin-1肾小球肾炎 幸田来未 良 1 吉野 Atsunori 1 Imanishi Yuji 1 川 山中 1 建筑师 日本财务大臣 2 Yaoita Eishin 3 Kazama 小泉纯一郎詹姆斯 4 成田机场 Ichiei 4 武田 Tetsuro 1 Anglani 语言 1 美国肾脏学 Dokkyo医科大学Koshigaya医院 没有,1-50 2-Chome Minami-Koshigaya Koshigaya-shi,埼玉县343 - 8555 日本 dokkyomed.ac.jp 2 病理学系 Dokkyo医科大学Koshigaya医院 没有,1-50 2-Chome Minami-Koshigaya Koshigaya-shi,埼玉县343 - 8555 日本 dokkyomed.ac.jp 3 结构病理学系 肾脏学研究所 新泻大学研究生院医学和牙科 951 - 8510 1 - 757 Asahimachi-dori,新泻 日本 niigata-u.ac.jp 4 临床肾脏病学会分工和风湿病 新泻大学研究生院医学和牙科 951 - 8510 1 - 757 Asahimachi-dori,新泻 日本 niigata-u.ac.jp 2014年 27 4 2014年 2014年 01 01 2014年 02 03 2014年 03 04 2014年 27 4 2014年 2014年 版权©2014年坂幸田来未等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

新月形成的起源细胞在人类肾小球肾炎(GN)仍然是未知的。一些动物研究表明,壁的上皮细胞,肾小球囊(胸大肌)增殖细胞的主要成分和PEC-specific claudin-1紧密连接蛋白表达在新月形的病变。我们研究了人类GN claudin-1的表达。免疫组织化学为claudin-1 17日进行肾活检样本与新月的形成。Colocalization claudin-1与细胞紧密连接蛋白ZO-1也评估了免疫荧光双重染色。Claudin-1主要表达在细胞细胞接触网站在细胞增殖细胞的新月形病变患者的人类GN的这些形式。少量的新月形成细胞显示claudin-1 extrajunctional本地化。Colocalization claudin-1 ZO-1被发现在细胞相邻增殖细胞的细胞联系网站。控制样品,在佩奇染色claudin-1是积极的,但不是在足细胞。我们的研究表明,claudin-1有助于新月形成紧密连接蛋白的成分复杂,包括ZO-1。 Co-localization of claudin-1 with ZO-1 implies the formation of functional tight junction complexes in crescentic lesions to prevent the interstitial damage caused by penetration of filtered molecules from Bowman’s space.

 1。介绍

Extracapillary增殖细胞病变或细胞新月的标志在肾小球严重的炎症反应,被记载在各种形式的肾小球肾炎(GN) [ 1]。新月在各种形式的GN包括迅速进步GN,传染病后GN, IgA肾病,紫癜性肾炎和系统性红斑狼疮。尽管这些新月形病变的起源仍然是有争议的,最近的研究已经阐明,不仅炎症细胞,而且内在的肾小球上皮细胞(即。壁的上皮细胞,肾小球囊(胸大肌)和肾小球上皮细胞和足细胞)这些新月的发展做出贡献 2]。史密兹等人证明,使用遗传细胞谱系追踪方法,,胸大肌细胞新月体构成的主要组成部分,特别是在早期阶段,在动物模型中新月形GN [ 3]。

Claudin tetraspan-transmembrane蛋白质和是一个至关重要的组成部分在上皮和内皮细胞紧密连接复合体 4, 5]。claudin亚型,claudin-1表达紧密连接的佩奇在小鼠模型和人类患者GN,因此被视为佩奇的标志( 3, 6, 7]。

考虑这些观察,可能佩奇的主成分是细胞在各种形式的人类GN新月,claudin-1参与细胞的形成新月体形成增殖细胞之间的紧密连接。我们旨在调查claudin-1紧密连接蛋白的表达和定位人类GN的新月形的病变。

 2。材料和方法 2.1。主题

肾活检样本17新月形成的患者进行了研究。没有新月形成的四个肾活检样本(小肾小球异常,最小改变肾病综合症,IgA肾病,和膜性肾病),形态正常的肾脏从5非侵入性肾肿瘤,患者接受切除,被用作控制样本。那些为活检样本提供新月形成,五个病人IgA肾病,两人紫癜性肾炎,七个有髓过氧化酶(MPO) anti-neutrophil胞质抗体(ANCA)相关的血管炎,一个蛋白酶3 (PR3) ANCA相关血管炎,有anti-glomerular基底膜(GBM)抗体相关的快速进步GN,和一个有红斑狼疮肾炎。肾活检或根据常规切除进行诊断和治疗指示Dokkyo医科大学Koshigaya医院所使用的协议。获得样本要么立即浸泡在福尔马林溶液之后,在石蜡包埋,或临时冻结在−80°C。细胞新月被定义为至少两个细胞层的存在鲍曼空间。新月被确认由两位研究者的存在。临床特征的患者纳入本研究总结在表 1。所有程序在本研究中进行了符合赫尔辛基宣言的指导方针。的机构审查委员会(IRB) Dokkyo医科大学Koshigaya医院批准这项研究(IRB批准号:1206)和书面知情同意是来自所有参与的病人。

本研究患者的临床特征。

没有 年龄(年) 性 疾病 Cr (mg / dL) 血尿(/ μ L) /加州大学(g / gCre) U - β 2毫克( μ g / L) CRP (mg / dL) 治疗
1 25 F IgA肾病 10.4 381年 3所示。8 31510年 0.07 高清,PSL LKT
2 57 米 IgA肾病 5.4 149年 7.6 13185年 0.35 mPSL、口腔PSL
3 32 米 IgA肾病 0.9 140年 2。5 95.6 0.11 mPSL、口腔PSL
4 20. F IgA肾病 1.0 60 8.2 48.6 0.06 mPSL、口腔PSL
5 38 F IgA肾病 1.7 1708年 3所示。4 9378.5 5.09 mPSL、口腔PSL
6 20. F 紫癜性肾炎 0.7 162年 1.1 182.1 0.06 没有一个
7 39 F 紫癜性肾炎 0.7 212年 2。1 74.2 0.06 口服PSL
8 63年 米 MPO-AAV 9.0 140年 0.5 22370年 3.43 mPSL、口腔PSL
9 39 米 MPO-AAV 13.1 208年 3所示。8 226.8 13.37 mPSL、口腔PSL
10 61年 米 MPO-AAV 2。9 130年 0.8 8471.9 2.82 mPSL、口腔PSL
11 68年 米 MPO-AAV 2。3 1030年 3所示。8 3064.3 3.83 mPSL、口腔PSL
12 77年 米 MPO-AAV 3所示。1 243年 3所示。3 90.6 5.73 mPSL、口腔PSL
13 70年 米 MPO-AAV 2。3 193年 1.3 164.9 5.37 mPSL、口腔PSL
14 71年 米 MPO-AAV 9.1 457年 0.4 47683年 2.75 mPSL、口腔PSL
15 64年 米 PR3-AAV 2。8 285年 1.7 523.3 23.55 mPSL, CY
16 64年 米 Anti-GBM展 15.4 420年 2。4 70121年 6.40 mPSL、PE、高清
17 63年 F 狼疮肾炎(IV + V) 1.3 281年 7.0 337.2 2.03 mPSL

克雷格:肌酐;CY:环磷酰胺;“绿带运动”:肾小球基底膜;高清:血液透析;IgA:免疫球蛋白;LKT:活体肾移植;MPO-AAV:髓过氧物酶anti-neutrophil胞质抗体相关血管炎;mPSL: methyl-prednisolone脉冲疗法;体育:血浆置换;PR3-AAV:蛋白酶3 anti-neutrophil胞质抗体相关血管炎; PSL: prednisolone; RPGN: rapidly progressive glomerulonephritis; UP/UCr: urine protein to creatinine ratio; U- β 2 mg:尿beta2-microglobulin。

2.2。免疫组织化学

肾活检标本或组织块形态正常的手术切除部分肾脏被立即用福尔马林固定石蜡和嵌入。三个 μm组织部分deparaffinized和水化不同乙醇系列的信息。抗原检索是由高压灭菌法10分钟。内源性过氧化物酶活性被3%的氢过氧化物酶和蛋白质块无血清(Dako、日本)是用于防止非特异性蛋白质绑定。claudin-1兔多克隆抗体(ab15098 Abcam,剑桥,英国)或兔多克隆anti-ZO-1(表达载体)稀释在Dako真正的抗体稀释剂(Dako)和用作主要抗体(1:200稀释)。部分是孵化主要抗体在室温下1 h。然后,幻灯片与磷酸盐缓冲盐水洗(PBS)三次,部分是孵化Histofine简单染色MAX-PO(多)二级抗体(Nichirei生物科学、日本)根据制造商的指示。与苏木精复染色进行核染色。

 2.3。免疫荧光

三个 μm cryosections固定在−20°C甲醇10分钟,用PBS 3 * 7.4%,蛋白质块血清处理30分钟,与PBS洗3次。然后,样本孵化与鼠单克隆抗体anti-claudin 1 (1: 100) (2 h ab56417 Abcam)在室温下,用PBS 3次,和孵化Alexa萤石488共轭anti-mouse免疫球蛋白g(1: 1000)(细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,妈,美国)30分钟。再次,样本与PBS洗3次,蛋白处理块无血清为30分钟,与PBS洗3次,和孵化兔多克隆anti-ZO-1(1: 400)(英杰公司)在一夜之间在4°C。样本与PBS洗3次,和孵化Alexa萤石555共轭anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 1000)(细胞信号技术)30分钟。核用DAPI染色了。occludin疣也使用兔多克隆抗体anti-occludin执行(猫。71 - 1500年,英杰公司、美国)(1:200)和Alexa萤石555共轭anti-rabbit免疫球蛋白。消极的控制,PBS代替主要的抗体。免疫荧光和激光扫描共焦显微镜检查(奥林巴斯BX-51,奥林巴斯、东京、日本)。

 2.4。透射电子显微镜法

小块的肾活检标本(大约0.5到1毫米3)被固定在2.5%戊二醛在0.05 M磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)过夜。glutaraldehyde-fixed活检标本后缀OsO在1%4在0.05 M磷酸盐缓冲剂30分钟和嵌入在环氧树脂。超薄部分(大约100海里)是由铜网格,然后沾醋酸双氧铀及柠檬酸铅,和透射电子显微镜下观察(jem - 1010,日本Densi、东京、日本)。

 2.5。的形态学分析

整个肾小球拍摄每一个新月形GN的活检样本( N = 17 )。肾小球和claudin-1正区域的边界跟踪和claudin-1积极总面积的百分比在肾小球测量使用ImageJ v . 1.47软件( http://rsb.info.nih.gov/ij)。2×5毫米大小的组织块进行肾切除手术肾脏被用作控制( N = 5 )。控制样品和新月形的区别分析了GN wilcoxon rank-sum测试使用占据版本13(占据公司,大学城,TX)。统计学意义是水平 P < 0.05 。

 3所示。结果 3.1。免疫组织化学

Claudin-1显示一个强大的、尖锐的染色模式沿着相邻佩奇的细胞膜。控制样品,染色信号主要是检测到细胞细胞接触网站(数据 1(一), 1 (b))。在细胞新月,claudin-1信号主要是在相邻的增殖细胞的细胞膜中发现所有样品检查(数字 2(一个), 2 (b), 2 (c), 2 (d))。偶尔,我们观察到细胞阳性claidin-1 extrajunctional细胞膜和细胞质(图 2 (d)箭和箭头)。未发现claudin-1阳性细胞在纤维性新月体或坏死性肾小球(图 2 (e))。ZO-1阳性细胞也发现在细胞新月(图 2 (f)箭头)。

肾切除术Claudin-1染色((a)×200)和最小变化肾病综合症((b)×200)样本所示。在肾小球,claudin-1展示了一个强大的、锋利的染色模式以及细胞膜的相邻佩奇(放大视图(a))。染色信号主要是检测到细胞,细胞接触网站。远端小管也表达claudin-1 ((b)箭头)。

在细胞新月,claudin-1信号主要是邻增殖细胞的细胞膜中发现(MPO-AAV ((a)×200), IgA肾病((b)×200),狼疮肾炎((c)×200和(d)×400)。Extrajunctional细胞膜(箭头)和胞质染色(箭头)claudin-1发现在某些新月形成细胞((d)箭头)。几个claudin-1阳性细胞被发现在坏死性肾小球((e)×200)。ZO-1阳性细胞也在细胞中发现新月(箭头所指)((f)×200年,样本病人MPO-AAV)。

 3.2。免疫荧光

Claudin-1表达只在相邻细胞,细胞接触网站佩奇在肾小球新月形成(图 3(一个))。信号集中在独特点模式。ZO-1染色观察紧密连接复合体的相邻佩奇和脚足细胞(图的过程 3 (b))。Claudin-1 ZO-1与(图 3 (c))。在细胞的新月,claudin-1表达细胞被少数(图 3 (d)(图)相比ZO-1表达细胞 3 (e)),但线路,双阳性anti-claudin-1和anti-ZO-1观察(图 3 (f))。Occludin,另一个基本细胞间紧密连接的复杂,也表达了新月形的病变(图 3 (g))。

免疫荧光的claudin-1(绿色)((a)、控制和3 e, MPO-AAV)和ZO-1(红色)((b)控制和(e) MPO-AAV)。合并图像((c)和控制(f) MPO-AAV)表明claudin-1主要表达在细胞细胞接触网站的相邻的胸大肌。信号集中在独特点模式控制样本(c), ZO-1是细胞内的主要组件紧密连接复合体,是可视化使用anti-ZO-1抗体。塔夫茨也显示肾小球ZO-1染色的积极性。Colocalization claudin-1和ZO-1检测到共焦激光扫描显微镜(放大视图(c)和(f))。在细胞的新月(f),行双阳性anti-claudin-1和anti-ZO-1观察(箭头);然而,积极性claudin-1 ZO-1相比不太强烈。细胞核与DAPI染色。(g) Occludin(红色)也表达了新月形的病变(箭头)。

 3.3。透射电子显微镜法

在电子显微镜下,紧密连接结构(相邻细胞的细胞膜之间的密切接触者)被证实在新月形成细胞(图 4从IgA肾病患者,活检样本)。

透射电子显微镜。观察细胞膜相邻细胞之间的密切联系,确认紧密连接形成的新月形的病变在人类肾小球肾炎((b)箭头,样本IgA肾病患者)。图(b)的放大视图框架区域(一个)。

 3.4。的形态学分析

共有59肾小球控制样品( N = 5 进行肾切除手术样本)和43个新月形的肾小球肾炎( N = 17 )进行评估。百分比中位数(四分位范围)肾小球的新月形GN claudin-1积极的地区和控制是0.12(0.85 - -0.22)%,0.056(0.34 - -0.88)%,分别(图 5)。这两组之间的差异具有统计学意义( P < 0.01 )。

claudin-1正面面积的百分比在肾小球。肾小球claudin-1正面面积的比例是衡量使用ImageJ软件。百分比中位数(四分位范围)肾小球的新月形GN claudin-1积极的地区和控制是0.12(0.85 - -0.22)%,0.056(0.34 - -0.88)%,分别。 P * < 0.01 。

 4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查了claudin-1的表达及其与ZO-1 colocalization在各种人类肾小球疾病包括IgA肾病、紫癜性肾炎,ANCA相关血管炎(MPO-ANCA和PR-3 ANCA), anti-GBM-RPGN,狼疮肾炎。我们获得了三个重要的发现。首先,claudin-1主要表达在细胞增殖细胞中细胞接触网站新月形的病变。第二,nonjunctional定位错觉claudin-1偶尔承认在新月形成细胞,而不是胸大肌的控制肾样本。第三,claudin-1与ZO-1与,在上皮细胞紧密连接复合体的基本细胞内成分( 8),相邻细胞,细胞接触网站的新月形成细胞。

Claudin-1最初是1998年由Furuse等人发现与四个假定的22 kD蛋白跨膜域( 9]。claudin-1引入成纤维细胞导致形成紧密连接链在这些本质上缺乏细胞紧密连接( 10]。过度的claudin-1 Madin-Darby狗肾细胞(MDCK) transepithelial电阻,降低paracellular通量增加,和claudin-1因此被认为造成上皮细胞屏障功能( 11]。Claudin-1不仅对紧密连接形成至关重要,而且对细胞内的丙型肝炎病毒( 12]的coreceptor tetraspanin研究[ 13]。到目前为止,至少24 claudin家族的成员,组织特殊分布,已确定在老鼠和人类。claudin亚型的表达模式在肾元段精确调查在老鼠 14和兔子 15]。在肾小球,claudin-1 [ 14, 15]和claudin-5 [ 16)被确定为紧密连接蛋白在胸大肌和足细胞,分别。柯克等人进行免疫组织化学分析claudin表达在人类肾皮质和发现claudin-1表示肾小球囊壁的上皮细胞,远曲小管和集合管 7]。 史密兹等人证明,使用遗传细胞谱系追踪方法,,在一个小鼠模型的新月形的肾小球肾炎(肾毒性anti-mouse诱发的小鼠血清),大多数的新月形病变的细胞群是来源于佩奇和这些病变阳性claudin-1 [ 3]。他们的研究结果,结合我们的研究结果表明,claudin-1导致相邻的增殖细胞中紧密连接形成新月形人类肾小球肾炎病变。

我们还发现表达claudin-1并不局限于相邻细胞的细胞,细胞接触网站。我们发现claudin-1 nonjunctional细胞膜和细胞质染色的细胞组成的细胞在新月形肾炎新月。在免疫荧光研究中,并不是所有与ZO-1 claudin-1与。这些细胞表达nonjunctional claudin-1可能是免疫细胞浸润,自从claudin和其他紧密连接蛋白的表达在免疫细胞被报道( 17]。另一方面,众所周知,表达claudin并不局限于上皮细胞紧密连接链。Claudin-5可以发现在大鼠足细胞的顶端膜嘌呤霉素aminonucleoside (PAN)诱发肾病( 16],可以找到claudin-1鼠附睾的基底膜( 18]。各种因素,如interleukin-1 β( 19],幽门螺杆菌[ 20.)和地塞米松 21),是影响claudin的表达和定位。此外,Dhawan等人证明了高表达claudin-1人类大肠癌组织和核和细胞质定位错觉claudin-1经常被视为比正常粘膜( 22]。他们证实,通过免疫印迹,表达claudin-1主要集中在核和细胞质分数SW480细胞(来源于主结直肠癌)和SW620细胞(来自转移病变)相比RIE细胞(来自非癌变鼠肠细胞)。他们还证明,使用这两个从人类结肠癌细胞系,调制claudin-1表达导致表型变化称为上皮间充质转变(EMT)和建议 β连环蛋白信号和钙粘蛋白表达可能机制这些claudin-1引起表型变化。联接的蛋白可能参与EMT的定位错觉Reichert MDCK细胞突变ZO-1等人表明,组成ZO-1 PDZ域的定位主要在细胞质中,激活 β连环蛋白信号,降低上皮标记表达式( 23]。Bariety等人透露,EMT在早期阶段发生在人类pauci-immune新月形的肾小球肾炎( 24]。考虑到这些观察,可能nonjunctional claudin存在于人类肾小球新月和一些新奇的功能。提出,nonjunctional细胞膜claudins可能代表一个水库交界claudins [ 25]。然而,claudins nonjunctional细胞膜和细胞质的作用仍不确定。最近,Ohse等人建立了有条件地永生的小鼠肾小球壁上皮细胞( 26]。它可能是有用的使用PEC-specific细胞系进一步澄清的角色extrajunctional claudin-1及相关信号通路在新月的形成。这个问题需要在未来的研究阐明。

ZO-1 225 kD细胞内蛋白质,是紧密连接复合体(不可或缺的组成部分 8]。ZO-1直接结合的COOH-terminus claudin-1通过其PDZ1域( 27]。PDZ1 claudin-1领域扮演一个关键的角色在正常紧密连接复合体的形成和发挥选择性分子渗透,也就是说,屏障功能( 28]。在正常肾小球,ZO-1 slit-diaphragms表达的足细胞( 29日]。在这项研究中,我们演示了colocalization ZO-1和claudin-1相邻增殖细胞在人类肾小球新月。实际上,比claudin-1 ZO-1信号强度更强,因此claudin-1部分与与ZO-1(图 3 (f))。各种各样的细胞包括免疫细胞和肾小球上皮细胞(即。,佩奇和足细胞)细胞新月的形成做出贡献。不仅胸大肌,还足细胞和免疫细胞表达ZO-1 [ 17]。尽管claudin-1壁的上皮细胞正被认为是主要的人口的细胞新月在小鼠模型中新月形的肾小球肾炎( 3),目前尚不清楚这是真的在人类疾病的细胞新月。人类肾小球新月ZO-1正面和负面claudin-1细胞可能是免疫细胞和足细胞浸润。的少数claudin-1阳性细胞在人类肾小球新月在我们的研究可能表明,佩奇的贡献形成新月形的损伤相对较小而新月形GN的小鼠模型。Ohse等人提出使用低和高分子量anti-GBM肾小球肾炎的示踪剂实验模型不仅显示肾小球囊的基底膜,而且紧密连接在佩奇可能充当第二个肾小球屏障防止间隙渗透过滤分子造成的损害肾小球空间( 30.]。因此,有可能形成紧密连接复合体claudin-1和ZO-1 extracapillary增生病变导致最小化solute-leakage诱导间质损害赋予新月屏障属性在人类肾小球肾炎。进一步的实验如渗透率测定使用PEC-specific细胞系将有助于验证这一假设。

总之,我们的结果表明,claudin-1是表达人类肾小球肾炎细胞新月。Claudin-1主要分布在细胞增殖细胞的细胞接触网站新月形的病变。轻微的但重要的分子分布在extrajunctional细胞膜和细胞质表明nonjunctional claudin-1的角色。Colocalization的claudin-1 ZO-1提出了复杂功能紧密连接形成的可能性新月形病变旨在预防间质损害的分子从肾小球过滤空间的渗透。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

作者感谢Takuya冈免疫组织化学,其它福田免疫荧光,Mutsuo Jinnai电子显微镜,以及泌尿系的成员,Dokkyo医科大学Koshigaya医院,获得肾脏接受肾切除术的患者样本。

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