根据五种尿毒症溶质对肾小管细胞的影响进行分类

摘要

背景/目的．已知存在于慢性肾病患者体内的尿毒症溶质被认为对疾病进展有有害影响。在这些尿毒症溶质中，吲哚羟基硫酸盐(indoxyl sulfate, IS)得到了广泛的研究，而对其他溶质的研究较少。我们进行了一项比较研究，以检验IS、p硫酸甲酯(PCS)，硫酸苯酯(PhS)，马尿酸(HA)和吲哚乙酸(IAA)。方法．我们使用LLC-PK1细胞来评估这些溶质对活细胞数量、细胞周期进展和细胞死亡的影响。结果．在48小时的培养后，所有溶质均减少活细胞数量。n -乙酰半胱氨酸抑制了除HA外所有溶质诱导的这种效应。在将细胞数量减少到50%的浓度下，IAA诱导细胞凋亡，而不是细胞周期延迟，而其他溶质诱导细胞周期延迟，对细胞凋亡影响甚微。在IS-、PCS-和phs处理的细胞中检测到p53和Chk1的磷酸化以及ATF4和CHOP基因的表达，而在iaa处理的细胞中检测不到。结论综上所述，PCS和PhS对肾小管细胞的不良影响与IS相似，而HA和IAA的不良影响不同。

1.介绍

尿毒症溶质是大量残留在慢性肾脏疾病(CKD)中的化合物，特别是在终末期肾脏疾病中，导致与正常状态相比血清浓度升高[1］．这些溶质尿液中排泄的健康人，但积累的CKD进展[2，3.］．超过一百名尿毒症溶质已报告的日期，而这些溶质根据大小和蛋白质结合特性[分为三组4- - - - - -6］．蛋白质结合的溶质在过去的十年中引起了广泛的关注，因为透析不能有效地去除它们[7]，可能与ckd相关并发症有关[8］．

吲哚酚硫酸盐(IS)是一种典型的蛋白结合溶质，其有害作用已在包括肾小管细胞在内的各种细胞中进行了研究[9，系膜细胞[10]，血管内皮细胞[11，血管平滑肌细胞[12),破骨细胞(13]，成骨细胞[14),红细胞(15和单核细胞[16］．此外，一些研究表明对肾脏的不利影响[17，18]血管系统[19，20.的动物模型。在人类中，一些报告表明IS与CKD患者的肾功能损害和心血管疾病发展相关[21- - - - - -23］．虽然这些研究暗示IS和CKD和/或CKD相关并发症的发展之间的因果关系，有必要澄清其他尿毒症溶质是否有类似的效果。

我们之前的研究表明CKD大鼠血清中几种溶质水平升高[24］．大多数这些溶质在血液透析患者中也被发现增加[25].在这些溶质中，我们重点研究了五种溶质，它们是，p硫酸甲酯、硫酸苯酯、马尿酸和吲哚乙酸。这些溶质的选择标准是它们在血液透析患者中的高血清浓度和它们对猪肾小管细胞活细胞数的影响(未发表的观察)。

肾小管细胞是肾小管的细胞成分，肾小管损伤被认为是导致CKD进展的关键事件之一[26］．因此，我们评估了五种尿毒症溶质对肾小管细胞活细胞数的影响，并探讨了其潜在的机制。

2.材料和方法

2．1．细胞培养

LLC-PK1，猪肾小管上皮细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，马纳萨斯，VA，USA）获得。LLC-PK1细胞维持在培养基199（Mediatech公司，马纳萨斯，VA，USA），补充有10％FBS（BioWest，尼艾莱，法国）。

2．2.试剂

硫酸吲哚酚从BIOSYNTH（全面推广，瑞士）购得。p-甲酰硫酸酯和苯基硫酸酯在日本静冈县Eiweiss合成。马尿酸和吲哚乙酸购自日本东京化学工业公司。n -乙酰半胱氨酸购自Sigma (St. Louis, MO, USA)。

2．3.活细胞计数

根据制造商的说明书，使用cell Counting Kit-8 (Dojindo, Wako, Tokyo, Japan)测定尿毒症溶质对活细胞数量的影响，该试剂盒是甲基噻唑四唑分析的一种水溶性版本。LLC-PK1细胞悬浮在含有2%胎牛血清的Medium 199中，并分装到试管中。将每种尿毒症溶质加入细胞悬浮液中，并将细胞密度调整为1.6 × 10⁴细胞/毫升。1毫升/孔细胞悬液接种于24孔培养皿中，培养48小时。孵育后，将培养基更换为含有Cell Counting Kit-8试剂的培养基。细胞再孵育30分钟，使用酶标仪(iMark酶标仪，Bio-Rad, Hercules, CA, USA)测量450nm光密度(OD450)。测量不含细胞的含有Cell Counting Kit-8试剂的培养基的OD450，并从每个样品的OD450中减去。

2.4。细胞周期分析

在G1/S或G2/M边界处调整细胞周期后，评估尿毒症溶质对生长速率的影响。在G1/S边界处使用双胸腺嘧啶核苷阻断剂进行同步。细胞在含有2.5%的无血清培养基中培养过夜 mmol/L胸腺嘧啶核苷，改为添加10%FBS的培养基，培养7小时，然后再次在含胸腺嘧啶核苷的培养基中培养过夜。对于G2/M同步化，细胞在含1.0%FBS的无血清培养基中培养过夜 μ诺考达唑mol / L。同步后，用如上所述的尿毒症溶质处理细胞4或6小时。然后将细胞固定在乙醇中，用碘化丙啶染色(碘化丙啶/RNase染色液，Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)。流式细胞仪(FACS Calibur, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)检测染色细胞，使用Flowjo软件(Tomy Digital Biology, Tokyo, Japan)分析数据。

2．5．细胞凋亡

如上所述，用尿毒症溶质处理细胞48小时。处理后，收集可能含有非贴壁细胞和贴壁细胞的培养基。用fitc标记的annexin V和丙啶对细胞进行染色(TACS annexin V- fitc凋亡检测试剂盒，Trevigen, Gaithersburg, MD, USA)。流式细胞仪(FACS Calibur)检测染色细胞，Flowjo软件分析数据。

2.6。西方墨点法

如上所述，用尿毒症溶质处理细胞5小时。处理后，用RIPA裂解缓冲液(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)裂解细胞。使用了针对磷酸化p53(在Ser15)和Chk1(在Ser345)的抗体(这两种抗体都应该是活性形式，并从Cell Signaling Technology购买)。使用ECL选择Western印迹检测系统(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)产生的化学发光信号由光捕捉II冷却CCD相机系统(ATTO, Tokyo, Japan)检测。抗体β-actin作为负载对照(Biolegend, San Diego, CA, USA)。

2.7。实时聚合酶链反应

如上所述，用尿毒症溶质处理细胞5或24小时。处理后，细胞在ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan)中裂解。按照厂家说明书分离总RNA，用分光光度计(Gene Spec V, Hitachi High-Tech Manufacturing & Service Corporation，茨城县，Japan茨城县)测量260 nm处的光密度。使用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takarabio，志贺，日本)对RNA (300 ng)进行逆转录μL反应体积。使用0.6 μSYBR Premix Ex Taq II Tli RNaseH Plus (Takarabio)，各引物各10 pmol(表1)1)，在25μL反应体积，并使用热循环骰子实时系统(TP800, Takarabio)在以下热循环条件下进行分析:在95°C变性30秒，接着是40个循环，95°C变性5秒和60°C退火/延伸30秒。

2.8.统计分析

由Student 's进行统计分析-测试，以及被认为是重要的。

3.结果

3.1。对细胞活性的影响

所有五个尿毒症溶质在用LLC-PK1细胞培养48小时（图剂量依赖性地降低活细胞数1）.为了比较这五种溶质的作用机制，在随后的实验中使用了每一种溶质的浓度，使细胞数量减少近50%。对于IAA，通常使用两到三种不同的浓度，因为在不同的实验中还原速率不同。在一些实验中，出于同样的原因，使用了两种浓度的IS。为验证目的，在每次实验中评估活细胞数。各种实验条件下的活细胞数量的结果显示在补充图中http://dx.doi.org/10.1155/2014/512178．

3．2.对细胞周期进程的影响

活细胞数量的减少可能是由于生长速度的降低或细胞死亡的诱导。为了探讨这两种可能性，我们评估了尿毒症溶质对生长速率和细胞凋亡的影响。

首先，为了确定对生长速率的影响，将细胞在G1/S边界同步化，并释放同步化的细胞在有或没有尿毒症溶质的情况下生长。在本实验设置中，细胞计数直方图根据DNA含量的增加，呈时间依赖性从左向右移动(图)2(一个)）.因此，延迟生长将作为对应控件左侧直方图的滞后出现。在这些实验条件下，IS，p -甲酚硫酸盐(PCS)和苯基硫酸盐(PhS)延缓了生长速率(图2 (b))，而马尿酸（HA）和IAA（图2 (c))对增长率没有影响。在本实验中，0.25和0.5 mmol/L IAA分别使活细胞数减少了26和84%(补充图1)。

接下来，细胞在G2/M边界同步，然后释放细胞，使其在有或无尿毒症溶质的情况下生长。在此实验设置中，0小时未处理对照细胞的直方图显示右侧的主要细胞群（G2期细胞，图1）3(一个))，左侧为G1期细胞，数量可忽略不计。随着有丝分裂的进行，G2期细胞减少，G1期细胞增多。数据显示为G1和G2期细胞的百分比。IS、PCS、PhS和HA均能延缓G2期细胞的减少和G1期细胞的增加(图3 (b)）.与这四种溶质形成鲜明对比的是，IAA对G2 - G1转变速率没有影响(图4)3 (c)）.在本实验中，0.25、0.5和1 mmol/L IAA分别使活细胞数减少12、42和79%(补充图2)。

3.3.对细胞死亡的影响

由于IAA对上述生长速率没有影响，因此我们检测了其对细胞死亡的影响。用Annexin V-FITC和碘化丙啶分别检测死亡和死亡细胞。因此，只有IAA诱导死亡细胞显著增加(图)4)而在PCS或HA处理组中观察到死亡细胞的边际增加(和0.021,分别地)。IAA还能引起死亡细胞的边缘增加(）.

3.4。细胞活力降低的抑制抗氧化

既往研究报道IS诱导活性氧(ROS)， ROS可能参与IS诱导的几种细胞类型的细胞增殖抑制[27，28］．因此，我们检测了n -乙酰- l-半胱氨酸(一种抗氧化剂)对每种溶质诱导的活细胞数量减少的影响。n -乙酰- l-半胱氨酸孵育可部分抑制IS、PCS或PhS组活细胞数量的减少，而完全抑制IAA组的减少(图)5）.同时，n -乙酰- l-半胱氨酸对HA的作用没有抑制作用。

3.5.p53和Chk1的磷酸化

据报道，IS在HK-2(一种人近端小管细胞系)中以p53依赖的方式抑制细胞增殖[29］．因此，我们检测了p53的磷酸化。我们还检测了Chk1的磷酸化，它也参与了DNA损伤反应，如p53。结果显示，IS和PCS可诱导p53磷酸化(图)6)，而IS、PCS和PhS诱导Chk1磷酸化。IAA和HA对这些蛋白的磷酸化没有影响。在本实验中，0.25和0.5 mmol/L IAA分别使活细胞数减少30和55%，5和10 mmol/L IS分别使活细胞数减少42和76%(补充图4)。

3.6。与生长延迟或细胞死亡有关的基因表达

为了进一步探索尿毒症溶质诱导的细胞周期延迟和/或细胞死亡相关的分子，我们检测了已知在这些过程中起重要作用的基因的表达（图1）7）.在治疗24小时后，IS和PCS显著诱导了p21 mRNA的表达。IS (10 mmol/L)、PCS和HA在治疗后5小时显著诱导Puma (p53上调凋亡调节因子)mRNA表达。PCS和PhS在处理24小时后抑制Cdc20和Skp2 mRNA的表达。IS、PCS、PhS和HA诱导ATF4和CHOP mRNA的表达。另一方面，IAA在所有检测浓度下均不影响这些基因的表达。在本实验中，0.25、0.5和1 mmol/L IAA分别使活细胞数减少了16、49和72%(补充图5)。

4.讨论

据我们所知，这是第一个系统比较五种尿毒症溶质对猪肾小管细胞影响的研究。我们的结果如图所示8．本研究评估的五种溶质根据48小时处理后减少活细胞数量的机制的差异分为三组。

第一组由is、PCS和PhS组成。这组溶质诱导细胞周期进展的延迟而不是细胞死亡，以减少活细胞数量。氧化应激可能参与了这些过程，因为n -乙酰- l-半胱氨酸孵育可部分恢复活细胞数量。此外，据报道IS可诱导多种细胞类型的氧化应激，包括肾小管细胞[27- - - - - -32］．这种氧化应激会引起DNA损伤，随后是Chk1和p53的激活[33］．随后对其下游靶点的调节或调节将最终延迟细胞周期的进展[31，32，34- - - - - -38］．同时，内质网应激(内质网应激)反应的三种途径之一，ATF4和CHOP的上调也被观察到。内质网应激反应本质上是一种适应性反应，但内质网应激时间过长会压倒适应性反应，最终通过CHOP上调导致细胞凋亡[39］．因此，这些基因的上调可诱导细胞凋亡，但与本组的溶质观察到死亡细胞的仅少量增加。一个可能的原因是，培养时间太短，观察细胞凋亡。在另一方面，据报道，CHOP诱导在人近端小管细胞抑制细胞增殖[40］．因此，除了激活p53通路外，ATF4和CHOP的上调也可能有助于延缓细胞周期进展。

IS已经通过诱导氧化应激，p53活化，与ER应力[报道的人近端肾小管上皮细胞的抑制增殖29，32，40］．本研究在猪管状细胞中证实了这些现象，并揭示了PCS和PhS以与IS相似的方式诱导生长迟缓。研究表明，对CKD大鼠模型给予PCS可导致进一步的肾小管损伤，其机制与IS类似[41］．此外，另一篇报道显示，IS和PCS在肾小管细胞中诱导相似的炎症基因表达[42］．因此，IS、PCS和PhS可能通过p53激活和内质网应激加重肾功能。有人提出，p53的激活和由此导致的细胞衰老会增加对损伤的敏感性，降低肾脏系统的修复能力，进一步损害肾功能[43]内质网应激也与肾脏疾病的进展有关[44]未来的研究有必要澄清这些溶质在临床环境中诱导细胞衰老和/或内质网应激中的作用。

IS还通过内皮细胞等其他细胞类型的p53激活来诱导细胞衰老[30和血管平滑肌细胞[31，这表明IS参与了CKD患者心血管疾病(CVD)的进展，正如几项流行病学研究所提出的[22，23］．PCS与CVD的关系也有报道[45- - - - - -47］．因此，这将是有趣的，以评估血管细胞PCS和小灵通的影响。

第二组仅包括IAA，但本研究未检测的其他溶质也可能属于这一组。与IS形成鲜明对比的是，IAA通过诱导细胞死亡而不是延缓细胞周期进程来减少活细胞数量。虽然IAA和IS的作用似乎都是由ROS介导的，但结果是不同的。这可能是由于产生ROS的亚细胞细胞器的不同。然而，需要进一步的研究来详细阐明其机制。有趣的是，衰老的内皮细胞更容易受到凋亡刺激[48］．因此，可以认为IS(一种细胞衰老诱导溶质)和IAA(一种细胞死亡诱导溶质)可能以合作的方式影响某些细胞类型的活力。

第三组包括HA，但再次其它溶质也可以属于这个组。HA轻微诱导细胞周期进展和细胞死亡延迟两者，其不同于其他两组。N-乙酰基-L-半胱氨酸不抑制HA的效果，进一步支持了HA形成另一基团的概念。虽然p53基因的磷酸化HA处理的细胞中没有观察到，HA做的p53-调节基因的（PUMA）调制的表达[49在某种程度上。因此，HA可轻微诱发p53活化。此外，HA还会引起内质网应激，这可以从标记基因ATF4和CHOP的上调看出。这些结果表明，HA可能以某种重叠的方式影响细胞系统与第一组。

本研究有一些局限性。首先，本实验中检测的尿毒症溶质浓度远高于CKD患者的血清浓度[2，5，25].在临床环境中，存在多种尿毒症溶质，可能以相加或协同方式影响生物系统。但是，每次实验中仅测试一种溶质。因此，需要高浓度以获得对细胞功能的可测量影响，并评估每种溶质的机制。

总之，这项研究表明尿毒症溶质可以根据其对细胞的作用机制进行分类。我们推测，同一组内的溶质以相加的方式发挥作用，而不同组内的溶质则以合作的方式发挥作用。需要进一步的研究来验证这些可能性。

利益冲突

所有四位作者都是吴羽化学工业公司的员工。

补充材料

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