1。介绍
尿毒症溶质保留大量的化合物在慢性肾脏疾病(CKD),尤其是终末期肾病,导致升高的血清浓度比正常状态(
1 ]。这些溶质积累,健康人尿液中排泄,但随着CKD的发展(
2 ,
3 ]。超过一百名尿毒症溶质已报告到目前为止,这些溶质分为三组根据大小和蛋白质绑定属性(
4 - - - - - -
6 ]。蛋白结合的溶质吸引了太多的关注在过去的十年中,因为他们更有效地通过透析(
7 和与CKD-related可能相关的并发症
8 ]。
硫酸吲哚酚(是)是一个代表蛋白结合的研究了溶质及其有害的影响在不同的细胞类型包括肾小管细胞(
9 ),系膜细胞(
10 ),血管内皮细胞(
11 ),血管平滑肌细胞(
12 ),破骨细胞(
13 ),成骨细胞(
14 ),红细胞(
15 ),和单核细胞(
16 ]。此外,一些研究证明在肾脏的不良反应(
17 ,
18 )和血管系统(
19 ,
20. 的动物模型。在人类中,几个协会报告显示与肾功能损害和慢性肾病患者心血管疾病的发展
21 - - - - - -
23 ]。尽管这些研究意味着因果关系和慢性肾病和/或CKD-related并发症的发展,有必要澄清是否其他尿毒症溶质也有类似的效果。
我们之前的研究表明,一些溶质的血清水平升高在慢性肾病大鼠(
24 ]。大多数这些溶质也发现增加在血液透析患者
25 ]。在这些溶质中,我们专注于五溶质是,
p 甲苯基硫酸、硫酸苯、马尿酸、吲哚乙酸。这些溶质的选择标准都是他们的高血清浓度在血液透析病人和他们的影响活细胞数量的猪肾小管细胞(未发表的观察)。
肾小管细胞肾小管细胞的组成部分,和管状损伤被认为是一个关键的事件引起慢性肾病的进展
26 ]。因此我们评估五个尿毒症溶质的影响活细胞肾小管细胞的数量和调查底层机制。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
LLC-PK1,猪肾小管上皮细胞株,来自美国类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。LLC-PK1细胞维持199年媒介(Mediatech马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)补充10%的边后卫(擤鼻涕、Nuaille、法国)。
2.2。试剂
硫酸吲哚酚是从Biosynth购买(Staad、瑞士)。
p 甲苯基硫酸和硫酸苯是合成Eiweiss(静冈市,日本)。马尿酸和吲哚乙酸从东京购买化工(日本东京)。N-Acetyl-L-cysteine购买从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。
2.3。活细胞计数
尿毒症溶质对活细胞数的影响测定使用细胞计数Kit-8(和光,Dojindo, kouichi日本东京)的水溶性版本甲基噻唑基四唑试验,根据制造商的指示。LLC-PK1细胞悬浮在培养基199补充2%的边后卫,成管状。每个尿毒症溶质被加入到细胞悬液和细胞密度调整到1.6×104 细胞/毫升。一毫升/细胞悬液被播种的24-well板和孵化48小时。孵化后,媒介被更改为一个包含细胞计数的培养基Kit-8试剂。另一个30分钟的细胞被孵化和光学密度在450 nm (OD450)测量使用微型板块阅读器(iMark微型板块读者,Bio-Rad,大力神,CA,美国)。中包含细胞计数的OD450 Kit-8试剂没有细胞测量和从每个样本的OD450减去。
2.4。细胞周期分析
尿毒症溶质对增长率的影响进行评估调整后的细胞周期G1 / S或G2 / M边界。双胸苷块用于同步在G1 / S边界。采用无血清细胞培养在一夜之间包含2.5更易/ L的胸苷,改为中补充10%的边后卫和孵化7小时然后再thymidine-containing中过夜。G2 / M同步,细胞在无血清培养基孵化包含1.0
μ 诺考达唑mol / L。同步后,细胞治疗尿毒症的溶质为4或6小时如上所述。然后,这些细胞被固定在乙醇和沾propidium碘(碘化propidium /核糖核酸酶染色方案,细胞信号技术,丹弗斯马,美国)。染色细胞被流式细胞分析仪检测(流式细胞仪石中剑,正欲,富兰克林湖,新泽西,美国)和数据分析使用Flowjo软件(数字生物学多美,东京,日本)。
2.5。细胞凋亡
细胞治疗尿毒症的溶质为48小时如上所述。治疗后,培养基可能包含不依从细胞和贴壁细胞收获。这些细胞被沾FITC-conjugated膜联蛋白V和propidium (tac膜联蛋白V-FITC凋亡检测装备,Trevigen,盖瑟斯堡,医学博士,美国)。染色细胞被流式细胞分析仪检测(流式细胞仪石中剑)使用Flowjo软件和数据进行了分析。
2.6。西方墨点法
细胞治疗尿毒症溶质如上所述5小时。治疗后,细胞是细胞溶解里帕裂解缓冲(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。磷酸化抗体p53 (Ser15)和Chk1 (Ser345)使用(应该是活跃的形式,并从细胞信号技术购买)。化学发光信号生成使用ECL选择免疫印迹检测系统(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)检测到Light-Capture II冷却CCD相机系统(阿、东京、日本)。抗体
β 肌动蛋白作为加载控制(Biolegend、圣地亚哥、钙、美国)。
2.7。实时聚合酶链反应
细胞治疗尿毒症的溶质为5或24小时如上所述。治疗后,细胞细胞溶解等基因(日本东京日本基因)。总RNA分离根据制造商的指示,和光学密度在260 nm使用分光光度计测量(基因规范V,日立高科技制造业和服务公司、茨城、日本)。RNA (300 ng)是使用PrimeScript reverse-transcribed RT试剂盒(Takarabio、志贺、日本)10
μ L反应体积。使用0.6
μ L互补DNA, SYBR预混料交货Taq II RNaseH Tli + (Takarabio)和10 pmol每个引物(表设置为不同的目标基因
1 25),实时PCR进行
μ L反应体积和热循环仪使用骰子实时分析系统(TP800 Takarabio)下面的热循环条件:变性在95°C,持续30秒,紧随其后的是40 95°C的周期变性5秒和60°C退火/扩展为30秒。
表1
实时PCR引物。
目标
监管
向前
反向
p21
p53-regulated
5′-catgtggacctgttgctgtc-3′
5′-cctcttggagaagatcagcc-3′
ATF4
ER应激反应
5′-ggtcagtgcctcagacaaca-3′
5′-tctggcatggtttccaggtc-3′
切
ER应激反应
5′-cttcaccactcttgaccctg-3′
5′-gagctctgactggaatcagg-3′
Cdc20
p53-regulated
5′-aatgtcctggcaactggagg-3′
5′-tgagctccttgtagtgggga-3′
Skp2
p53-regulated
5′-acctccacccagatgtgact-3′
5′-gtgctgtacacgaaaagggc-3′
彪马
p53-regulated
5′-gatctcaacgcgctgtacga-3′
5′-caggcacctaattaggctcc-3′
GAPDH
辅助基因
5′-ccatcaccatcttccaggag-3′
5′-gagatgatgaccctcttggc-3′
2.8。统计分析
统计分析是由学生的
t
以及,
P
<
0.01
被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。影响细胞的生存能力
所有五个尿毒症溶质减少活细胞数量存在剂量依赖的相关性在孵化LLC-PK1细胞(图48小时
1 )。比较五溶质的行动的机制,每个溶质的浓度,降低了细胞数量近50%被用于后续的实验。IAA,两个或三个不同浓度总是使用,因为减少利率不同在不同的实验。在一些实验中,两个浓度的被用于同样的原因。活细胞数在每个实验进行评估确认的目的。活细胞数的结果对各种实验条件在网上补充数据所示
http://dx.doi.org/10.1155/2014/512178 。
图1
5尿毒症溶质在活细胞数的影响。猪肾小管细胞治疗尿毒症溶质48小时。使用Kit-8细胞计数活细胞数量是评价。光密度在450纳米测量和计算的值的控制。数据显示为均值±S。D (
n
=
4
)。星号指示活细胞显著减少人口相比,控制(
P
<
0.01
)。控制器,控制;是,硫酸吲哚酚;电脑,
p 甲苯基硫酸;小灵通,硫酸苯;哈,马尿酸。
![]()
3.2。对细胞周期进程的影响
活细胞数量的减少是由于降低增长率或诱导细胞死亡。调查这两个可能性,尿毒症溶质增长率和细胞凋亡的影响。
首先,确定对增长率的影响,在G1 / S边界细胞同步,同步的细胞生长有或没有尿毒症溶质发布。在本实验设定,细胞血细胞计数直方图变化时间的方式从左到右,根据DNA含量的增加(图
2(一个) )。因此,延迟增长将出现滞后的直方图左边相应的控制。在这些实验条件下,
p - 甲苯基硫酸(pc)和苯硫酸(小灵通)延迟增长率(图
2 (b) ),而马尿酸(HA)和IAA(图
2 (c) )没有对经济增长率的影响。在这个实验中,更易与0.25和0.5 L的IAA活细胞数量降低了26个和84%,分别为(补充图1)。
尿毒症的影响溶质在猪肾小管细胞后细胞周期进程同步在G1 / S边界。(一)时间直方图的未经处理的控制细胞的转变。每一行表示一次又释放同步。实线:0小时,虚线:4小时,和虚线:6小时。每个时间点重复数据显示除了0小时。(b)和(c)直方图尿毒症solute-treated细胞和相应的控制细胞在表示时间点。同步后,细胞生长与发布(虚线)或没有(实线)尿毒症溶质表示时间。控制器,控制;是,硫酸吲哚酚;电脑,
p 甲苯基硫酸;小灵通,硫酸苯;哈,马尿酸;IAA,吲哚乙酸。溶质的浓度(更易/ L)括号中所示。重复的数据显示。数据是代表两个独立的实验。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
接下来,在G2 / M细胞同步边界,然后被释放的细胞生长有或没有尿毒症的溶质。在本实验设定,未经处理的控制细胞在0小时的柱状图显示了一个主要的细胞群在右边(G2期细胞,图
3(一个) 左边)微不足道(G1期细胞)。有丝分裂过程,G2期细胞减少,G1期细胞增加。数据显示为G1和G2阶段细胞的百分比。电脑,小灵通,HA弱智G2期细胞的减少和增加细胞G1期(图
3 (b) )。在这四个溶质形成鲜明对比,IAA对G2的速度没有影响到G1过渡(图
3 (c) )。在这个实验中,0.25,0.5,1更易/ L的IAA活细胞数减少12,42岁,分别为和79%(补充图2)。
尿毒症的影响溶质在猪肾小管细胞后细胞周期进程同步在G2 / M边界。(一)时间直方图的未经处理的控制细胞的转变。每一行表示一次又释放同步。实线:0小时,虚线:4小时,和虚线:6小时。每个时间点重复数据显示除了0小时。(b)和(c) G1和G2期细胞的百分比。同步后,细胞生长有或没有公布尿毒症溶质表示时间。细胞的百分比在每个阶段进行了分析和计算。控制器,控制;是,硫酸吲哚酚; PCS,
p 甲苯基硫酸;小灵通,硫酸苯;哈,马尿酸;IAA,吲哚乙酸。数据显示为均值±道。
n
=
4
)。星号显示显著差异相比,相应的控制(
P
<
0.01
)。溶质的浓度(更易/ L)括号中所示。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.3。对细胞死亡的影响
因为IAA没有影响增长率如上所述,对细胞死亡的影响研究。膜联蛋白V-FITC和碘化propidium用来检测死和死细胞,分别。结果,只有IAA诱导细胞死亡的显著增加(图
4 ),而边际增加死亡的细胞中观察到pc或HA-treated组(
P
=
0.044
和0.021,分别地)。IAA也引起边际增加的死细胞(
P
=
0.013
)。
图4
尿毒症溶质对细胞死亡的影响。48小时后孵化与每个尿毒症的溶质,猪肾小管细胞沾膜联蛋白V-FITC和propidium碘(π)。膜联蛋白的百分比V-positive细胞和膜联蛋白V / PI-positive细胞进行了分析和计算。控制器,控制;是,硫酸吲哚酚;电脑,
p 甲苯基硫酸;小灵通,硫酸苯;哈,马尿酸;IAA,吲哚乙酸。数据显示为均值±道。
n
=
4
)。星号显示显著差异相比,相应的控制(
P
<
0.01
)。锋利的标志(#)表示
P
<
0.05
。
![]()
3.4。抑制细胞的生存能力降低,抗氧化剂
先前有研究报道,诱导活性氧(ROS), ROS可能参与诱导细胞增殖的抑制多种细胞类型(
27 ,
28 ]。因此,我们研究了N-acetyl-L-cysteine的影响,一种抗氧化剂,在每个溶质减少引起的活细胞数。孵化与N-acetyl-L-cysteine部分抑制活细胞数量的减少,个人电脑,或小灵通组和完全抑制IAA组减少(图
5 )。与此同时,N-acetyl-L-cysteine没有抑制的效果哈。
图5
N-acetyl-L-cysteine效果(NAC)在尿毒症solute-induced活细胞数量减少。猪肾小管细胞治疗NAC(0, 0.1或1更易/ L) 20分钟和进一步治疗尿毒症溶质48小时。使用Kit-8细胞计数活细胞数量是评价。光密度在450纳米测量和计算的值的百分比相应的控制。控制器,控制;是,硫酸吲哚酚;电脑,
p 甲苯基硫酸;小灵通,硫酸苯;哈,马尿酸;IAA,吲哚乙酸。数据显示为均值±道。
n
=
4
)。星号表示每个对这图中描述显著差异(
P
<
0.01
)。含硝酸钠意味着不重要的区别。
![]()
3.5。磷酸化的p53和Chk1
据报道是抑制细胞增殖在HK-2 p53-dependent方式中,一个人近端肾小管细胞线(
29日 ]。因此,我们研究p53的磷酸化。我们还研究了磷酸化Chk1还参与像p53 DNA损伤反应。结果表明,pc p53诱导磷酸化(图
6 ),而电脑是和小灵通诱导Chk1磷酸化。IAA和HA没有对这些蛋白质的磷酸化的影响。在这个实验中,更易与0.25和0.5 L的IAA活细胞数量下降了30 - 55%,分别为5和10更易/ L的活细胞数减少了42个和76%,分别为(补充图4)。
图6
尿毒症溶质对p53和Chk1磷酸化的影响。猪肾小管细胞治疗与每个尿毒症的溶质为5个小时。细胞溶解产物获得和接受西方墨点法。控制器,控制;是,硫酸吲哚酚;电脑,
p 甲苯基硫酸;小灵通,硫酸苯;哈,马尿酸;IAA,吲哚乙酸。图片是代表两个独立的实验。
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3.6。相关基因的表达在生长延迟或细胞死亡
进一步探索分子参与了尿毒症solute-induced细胞周期延迟和/或细胞死亡,我们对基因的表达在这些过程扮演着重要角色(图
7 )。p21和pc显著诱导mRNA表达在24小时后治疗。(10更易/ L),电脑,和HA显著诱导彪马(p53调节细胞凋亡的调制器)mRNA表达在5小时后治疗。个人电脑和小灵通抑制Cdc20和Skp2 mRNA表达在24小时后治疗。电脑,小灵通,HA诱导ATF4砍mRNA。另一方面,IAA并不影响这些基因的表达检测浓度。在这个实验中,0.25,0.5,1更易/ L的IAA活细胞数减少16,49岁,分别为和72%(补充图5)。
图7
尿毒症溶质对基因表达的影响。猪肾小管细胞治疗尿毒症溶质5和24小时。总RNA提取并进行实时PCR。基因表达水平相对于GAPDH表达式计算
Δ
Δ
Ct
方法。数据表示为相对的值对应的控制。控制器,控制;是,硫酸吲哚酚;电脑,
p 甲苯基硫酸;小灵通,硫酸苯;哈,马尿酸;IAA,吲哚乙酸。数据显示为均值±道。
n
=
6
)。星号表示超过1.5倍增加或减少相应控制相比有统计学意义(
P
<
0.01
)。
![]()
4所示。讨论
我们所知,这是第一个研究,系统地比较了五个尿毒症溶质对猪的影响肾小管细胞。我们的结果在图如图
8 。五溶质评估在这项研究被分为三组的差异减少活细胞数在48小时的治疗机制。
图8
原理图的影响尿毒症溶质在猪肾小管细胞。
组1 专门诱发细胞周期延迟,这将是由氧化应激和ER应激。据报道,诱导氧化应激(
27 - - - - - -
32 )和ER应激(
40 ]。氧化应激可引起DNA损伤,其次是Chk1和p53激活(
33 ]。激活Chk1可以逮捕细胞周期进展(
34 ]。激活p53的也报道[
29日 - - - - - -
32 ]。激活p53可以抑制转录Cdc20 [
38 ]和Skp2 [
36 ,
37 ]。因为Cdc20和Skp2有重要的作用在细胞周期进程
35 ),他们的压迫可能延迟细胞周期。另一个下游的目标p53、p21、也是一个重要的细胞周期的监管机构,据报道也引起的是
31日 ,
32 ,
40 ]。同时,ER应激可以诱导ATF4和切表达,这是紧随其后的是细胞凋亡
39 ]。然而,也报道,诱导砍表达和砍介导的抑制增殖,而不是诱导细胞凋亡在人类肾小管细胞
40 ]。因此,观察ATF4和切信使rna诱导可能参与细胞周期延迟,而不是细胞凋亡。
组2 完全凋亡,但其作用机制在很大程度上是未知的。
组3 略微诱发延迟细胞周期和细胞凋亡,这可能是部分由p53和ER应激。更详细的解释
4 。控制器,控制;是,硫酸吲哚酚;电脑,
p 甲苯基硫酸;小灵通,硫酸苯;哈,马尿酸;IAA、吲哚乙酸;南汽,N-acetyl-L-cysteine。括号中的数字对应于参考文献的数量。
![]()
第一组是由电脑和小灵通。这群溶质诱发延迟细胞周期进展而不是细胞死亡减少可行的细胞数量。氧化应激参与这些过程,可能是由于活细胞数量在一定程度上恢复了与N-acetyl-L-cysteine孵化。据报道,而且是诱导氧化应激在几个细胞类型包括肾小管细胞(
27 - - - - - -
32 ]。这种氧化应激诱导的DNA损伤,其次是激活Chk1和p53 [
33 ]。随后调制或调节下游目标最终会延迟细胞周期进展(
31日 ,
32 ,
34 - - - - - -
38 ]。同时,upregulation ATF4和排骨,称为标志的三个途径之一的内质网应激(ER应激)反应,也观察到。ER应激反应本质上是一种适应性反应,但长期ER应激了适应性反应,最终导致细胞凋亡在砍upregulation [
39 ]。因此,upregulation这些基因可以诱导细胞凋亡,但只有边际增加死亡的细胞观察这群溶质。一个可能的原因是,观察细胞凋亡的孵化时间太短。另一方面,据报道,砍感应是抑制细胞增殖的人近端肾小管细胞(
40 ]。因此upregulation ATF4和排骨也可能导致延迟细胞周期进展除了p53通路的激活。
据报道是抑制人类近端小管细胞扩散通过诱导氧化应激激活p53, ER应激(
29日 ,
32 ,
40 ]。目前的研究证实了这些现象在猪肾小管细胞,此外显示,电脑和小灵通以类似的方式诱导生长迟缓。电脑管理慢性肾病大鼠模型进一步被证实引起肾小管损伤的机制类似于(
41 ]。此外另一份报告显示,和pc诱发类似炎症基因表达在肾小管细胞(
42 ]。因此,电脑是通过激活p53和小灵通可能加重肾功能和ER应激添加剂。激活p53和合成细胞衰老已经提出增加敏感性侮辱和减少肾系统的修复能力,进一步损害肾脏功能(
43 ]。ER应激也被认为与肾脏疾病的进展
44 ]。未来的研究是必要的澄清这些溶质的参与诱导细胞衰老和/或ER应激在临床的设置。
也通过激活p53诱导细胞衰老在其他类型的细胞,如内皮细胞(
30. )和血管平滑肌细胞(
31日 ),这意味着是参与心血管疾病(CVD)的进展在CKD患者中,在几个流行病学研究已经表明了(
22 ,
23 ]。电脑协会与心血管疾病也被报道(
45 - - - - - -
47 ]。因此这将是有趣的评估个人电脑和小灵通在血管细胞的影响。
第二组只包含IAA,但其他溶质不测试在这项研究中也属于这个组。形成鲜明对比的是,IAA诱导细胞死亡而不是延迟细胞周期进展减少可行的细胞数量。尽管IAA和的影响似乎是由活性氧,结果是不同的。这可能是由于不同的亚细胞细胞器ROS生产。然而,未来的研究需要明确详细的机制。有趣的是,衰老内皮细胞更容易受到凋亡刺激(
48 ]。因此一个可以考虑的可能性(细胞senescence-inducing溶质)和IAA(细胞death-inducing溶质)可能会影响某些细胞类型以合作的方式的可行性。
第三组包括哈,但是其他溶质也属于这个组。HA略微诱发延迟在细胞周期进程和细胞死亡,这不同于其他两组。N-Acetyl-L-cysteine没有抑制的影响哈,进一步支持了这种观点,即形式另一组。虽然p53 HA-treated中没有观察到细胞磷酸化,HA并调节p53-regulated基因的表达(Puma) [
49 在某种程度上)。因此公顷可能稍微p53诱导激活。此外,HA诱导ER应激,upregulation表示的标记基因ATF4和排骨。这些结果表明,HA有所重叠的方式可能会影响细胞系统与第一组。
这项研究有一些局限性。首先,尿毒症的溶质浓度的测试在这个实验中是远远高于慢性肾病患者的血清浓度(
2 ,
5 ,
25 ]。在临床环境中,存在多个尿毒症溶质和可能影响生物系统添加剂或协同的方式。然而,只有一个溶质在每个实验测试。因此,高浓度有必要获得可衡量的影响细胞功能,并评估每个溶质的机制。
总之,这项研究表明,尿毒症溶质可以分为组取决于它们对细胞作用的机制。我们推测,溶质在一组以添加剂的方式施加其影响溶质在不同群体合作的方式行动。未来的研究是必要的,以验证这些可能性。