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国际微生物学杂志
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国际微生物学杂志/2021年/文章

研究文章|开放获取

体积 2021年 |文章的ID 8868151 | https://doi.org/10.1155/2021/8868151

英迪拉·t·马修·r·莫罗·Robab Katani,丽贝卡象牙海岸,玲玲,特伦斯·m·亚瑟Vivek Kapur, ”Nonfimbrial Adhesin突变体揭示发散大肠杆菌O157: H7上皮细胞粘附机制对人类和牛”,国际微生物学杂志, 卷。2021年, 文章的ID8868151, 16 页面, 2021年。 https://doi.org/10.1155/2021/8868151

Nonfimbrial Adhesin突变体揭示发散大肠杆菌O157: H7上皮细胞粘附机制对人类和牛

马修·r·莫罗,1 英迪拉·t·库,2 Robab Katani,3,4 丽贝卡象牙海岸,1 玲玲李,3,4 特伦斯·m·亚瑟,5 和 Vivek Kapur3,4

1兽医部门和生物医学科学,宾州州立大学大学公园,美国宾夕法尼亚州

2食品安全及肠道病原体的研究单位,国家动物疾病中心,农业研究服务,美国农业部,埃姆斯IA,美国

3宾夕法尼亚州立大学动物科学系,大学公园,宾夕法尼亚州,美国

4哈克的生命科学学院,宾夕法尼亚州立大学,大学公园,美国宾夕法尼亚州

5罗马l .赫鲁斯卡对此美国意味着动物研究中心,农业研究服务,美国农业部,粘土中心,东北,美国

学术编辑器:托德·r·卡拉威
收到了 2020年9月13日
接受 2021年1月08
发表 2021年1月29日

文摘

志贺产毒,肠出血性大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌)O157: H7是主要食源性病原体导致从简单的肠道不适症状腹泻带血,在人类致命的溶血性尿毒症综合征。牛可以无症状地殖民O157: H7 rectoanal结(RAJ)为主。殖民的统治是高度相关的脱落O157: H7牛的粪便。Supershedding (SS)是一种现象,据报道一些牛,裁员逾104菌落的O57: H7每克粪便,100 - 1000倍或大于正常棚友。独特的牛RAJ细胞粘附模型显示O157: H7雇佣LEE-independent机制附件RAJ细胞类型之一,鳞状上皮(交易所)细胞。九nonfimbrial丰富的选择,以确定他们的角色在hyperadherent表型特征的党卫军O157牛证交所细胞,与人类相比HEp-2细胞。的单核苷酸多态性(snp)被发现在这些nonfimbrial丰富的SS隔离。在人类细胞中,删除yfaL减少EDL933和SS17的依从性。然而,删除运算单元导致重大损失的依从性同流合污而删除wzzB和宫内厅在EDL933导致相同的坚持HEp-2细胞的损失。在交易所细胞,这些nonfimbrial缺失突变体能够改变SS17的依从性表型。在EDL933,删除儿童和青少年卫生与发育司导致减轻依从性。令人惊讶的是,四个nonfimbrial adhesin基因缺失实际上是能够赋予hyperadherent交易所细胞表型。总的来说,这项研究表明,nonfimbrial的贡献的依从性机制和功能丰富的O157: H7是病毒和宿主细胞类型的依赖以及显示的可能角色nonfimbrial党卫军对证交所细胞表型表现出丰富的。

1。介绍

志贺产毒大肠杆菌是最普遍的6个主要致病型的大肠杆菌并且负责每年大约265000感染,仅在美国(1,2]。肠出血性的O157: H7血清大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌),40%的人的原因是感染的临床症状包括水样或血便、腹部绞痛肾损害和/或故障和潜在的致命的溶血性尿毒症综合征(HUS) (2- - - - - -4]。大多数人类感染O157: H7通过食用肉类或蔬菜的粪便污染与牛(3,5]。

尽管人类宿主引起疾病,牛殖民与O157: H7是无症状1- - - - - -3]。牛是主要的水库和殖民的主站点O157: H7在牛rectoanal结也被称为RAJ [2]。这个特殊的位置在胃肠道的终端(GIT)是由两个主要的细胞类型、follicle-associated上皮(身上)和rectoanal结鳞状上皮细胞(交易所)6- - - - - -8]。O157: H7的典型脱落率从RAJ 10 - 100菌落每克粪便(CFU / g) [8]。Supershedder (SS)牛,另一方面,≥104O157: H7 CFU /克(9]。数学建模的党卫军牛显示他们负责大于96%的O157: H7环境中发现尽管党卫军牛占不到10%的牲畜群(9- - - - - -11]。在苏格兰的另一项研究显示,80%的所有传输事件和其他牛在农场是由党卫军造成的大肠杆菌(10,12]。

大约300 CFU可能107需要O157: H7 CFU的殖民的小腿和牛只有10 - 100 CFU O157: H7需要感染人类[13,14]。因为党卫军牲畜棚两到三个数量级以上感染剂量对人类和牛每克粪便,它们的整体流行病学的重要驱动力O157: H7主机。党卫军现象是未知的,但很可能围绕三个主要部分:主机,细菌,和环境,所有这些都可以有一个重要的角色在这个表型(9,11]。有很多研究表明,应变之间的关系党卫军牛和其他各种条件(天气、时间和时间的年)均可导致流率的变化O157: H7 (15- - - - - -18]。鉴于这些因素剥离表型中扮演至关重要的角色,它是可能的,所有的牛可能有潜力成为一个supershedder,进一步发展我们需要理解的机制,推动这一进程。

拓殖主机,任何细菌需要找到一个利基,在那里他们可以争夺资源和可以锚定自己,进入利基市场为了不被剥夺了通过运动。为了连接到宿主细胞,大多数病原体表达丰富的开始接触表面(如真核细胞膜或细胞外基质)授予坚持这些表面,允许其他粘附分子的合成。肠上皮细胞的轨迹抹杀(李)是亲密的依恋轨迹编码adhesin, intimin,及其同源受体易位到和所表达的宿主细胞,行动(19]。附件是介导通过III型分泌系统操纵子(T3SS)编码,和效应器。所有这些因素创建基座形成与O157: H7 LEE-driven依从性以及调节免疫信号,肌动蛋白聚合和其他真核细胞通路(2,19,20.]。

O157: H7坚持后,产生毒素(志贺毒素、溶血素毒素等)导致损伤内皮和上皮细胞,释放关键营养物质的细菌生存需要(21- - - - - -23]。志贺毒素的原因大多数患者有O157: H7感染不能通过常规抗生素治疗。志贺毒素细菌所表达的是在一个基准面作为毒性因子,但感染的抗生素治疗可以刺激激活和释放的志贺毒性噬菌体和增加志贺毒素的合成和释放。一旦进入血液,志贺毒素结合Gb3受体主要表达的内皮细胞和肾(更具体地说24]。有趣的是,这就是为什么牛感染时不显示任何疾病迹象O157: H7;他们没有志贺毒素影响所需的Gb3受体细胞(25]。尽管没有主要的病理生理疾病的迹象,仍未得到解决的一个问题是为什么O157: H7能在牛在较长时间内持续。最近的证据来自各种研究表明,志贺毒素的等位基因可以绑定到CD77参与mitogen-activation响应。大多数牛细胞,包括上皮细胞和白细胞,有这种受体表达在不同的发展阶段和分化。在高密度,这种受体可以触发地图pathway-mediated凋亡,特别是对于完全分化隐窝细胞牛,可能影响流率(26]。如果志贺毒素通过non-Gb3-mediated被另一种细胞内吞作用,志贺毒素大多已经被证明可以减少或防止细胞生产功能性核因子k B, NFκB (24]。

除了等因素的重要性李操纵子和志贺毒素,O157: H7必须能够坚持通过最顶端细胞表面可能授予其他丰富的编码中的绑定。对许多细菌,丰富是放在两个不同的类别:fimbrial nonfimbrial。Fimbrial丰富很长,极地、改性扩展由一个终止针对受体adhesin [27]。Nonfimbrial丰富的通常是单个亚基蛋白类似于V型分泌系统也称为autotransporters。大多数autotransporters包含三个关键领域:β锚蛋白进入细菌膜桶,链接器领域flex臂效应的领域通常包含一个adhesin autotransported通过或效应β桶和与宿主细胞蛋白相互作用28,29日]。许多O157: H7隔离包括EDL933和supershedder菌株如SS17包含许多不同的位点都有fimbrial和nonfimbrial丰富(19,30.]。

O157: H7的许多丰富的发现已被证明为依从性是至关重要的。的儿童和青少年卫生与发育司钙离子结合蛋白(抗原43同族体)曾是重要的大肠杆菌细胞聚集和坚持人类细胞(31日,32]。宫内厅的蛋白都有双重目的的细菌作为运输车等含铁细胞enterochelin绑定到铁,以及Fur-regulated adhesin [33,34]。OmpA也被证明是重要的依从性在许多不同的表面,包括植物和动物(35,36]。最后两个例子的nonfimbrial autotransporter丰富yeeJ和yfaL增强O157: H7绑定真核细胞(29日,37]。有许多其他丰富的一些肠出血性大肠杆菌表达的是丰富的和其他人猜测这种基于其他丰富的序列同源性,如在产肠毒素的婚大肠杆菌(38,39]。

底层差异坚持机制受雇于肠出血性大肠杆菌感染,特别是O157: H7,遵守交易所细胞没有被定义,也没有丰富的使用之前李激活人类上皮细胞被确认。最大的原因是功能冗余O157: H7对其丰富的。之前报道,党卫军孤立SS17显示LEE-independent,强大,综合依从性对证交所细胞表型只有扩散和温和的坚持HEp-2细胞(40,41]。另一项研究显示,党卫军隔离不共享丰富的遗传相似性定义的亲缘但是脉冲场凝胶电泳的出现(9]。

我们以前有一个完全测序党卫军隔离(SS17,加入CP008805)及其基因组分析,以确定遗传差异特征明显比以前O157: H7菌株通过反向遗传方法(41]。在这项研究中,我们试图确定依从性的基因表型之前归因于SS17比较依从性分析进行定量和定性比较O157: H7隔离SS17和EDL933(作为参考)。这些研究提供证据表明,坚持机制受雇于SS和non-SS O157: H7隔离HEp-2细胞是不同的。O157: H7他们还建议最初的依从性菌株在牛证交所细胞是不同的比O157: H7菌株对人类上皮细胞,提供证据表明,最初的坚持O157: H7菌株对人类和牛上皮细胞需要不同的丰富。最后,这些分析表明一个错综复杂的和复杂的监管网络,参与的依从性表型的差异O157: H7菌株证交所细胞。

2。材料和方法

2.1。菌株

O157 SS17和所有supershedder隔离(魔法石,第1章,七号信令,SS12, SS27, SS42 SS52, SS67, SS77, SS131, RM11333,和RM11326)最初获得并以美国农业部肉类动物研究中心,粘土中心,东北。RM11333和RM11326环境隔离,被发现生物膜潜力高。收集分离和特征如前所述9]。EDL933隔离来自爱德华·达德利,宾夕法尼亚州立大学。EDL933最初获得的样本1982汉堡爆发O157: H7在密歇根42]。

2.2。确定感兴趣的丰富的

基因的选择过程,如图1,最初是由交叉基因编码丰富O157: H7基因有收购产生的单核苷酸多态性(nsSNPs)比EDL933同流合污。这些选择的基因相比,蛋白质组分析·库和他的同事们在EDL933遵守交易所提供的细胞(40]。Nonfimbrial基因共享的至少两三个标准被选为感兴趣的基因(GOI)和用于随后的系统发育和基因敲除的分析。


图1
基因选择的过程。整个基因组的SS17完全通过拉斯特和手工注释注释(5]。坚持基因与以前相比表现的蛋白质组和比较的基因包含nsSNPs比作non-SS EDL933隔离。任何nonfimbrial匹配两个这三个标准被认为是丰富的。
2.3。系统发育分析基于SS Nonfimbrial Adhesin snp

总之,甘油股票从原始的刺穿了12党卫军隔离到磅琼脂和同基因的殖民地和成长在磅,和DNA分离使用DNeasy血液和组织工具包(试剂盒,瓦伦西亚CA),在ddH筛选了2o .准备从DNA、2µl是添加到20µl与新建S1和S2引物PCR(表S1大约250个基点),退火序列侧翼的nsSNP(年代)。产品运行在1%琼脂糖凝胶体积(1/10),其余产品被过滤器清洗排斥和发送测序在正向和反向两个方向。使用猿质粒序列对齐的编辑器和SeqMan (DNASTAR麦迪逊WI;Lasergene v . 10)项目和分析特定nsSNP守恒或同一基因不同nsSNP当地原始nsSNP对齐EDL933和SS17引用。

系统发育分析使用MEGA5 [43]。基码包含9基因的单核苷酸多态性形成一致的FASTA格式生成大型对齐。删除在儿童和青少年卫生与发育司占了一个密码子编码的变化。27个核苷酸的排列是用于生成系统通过引导1000最大核苷酸所有SS分离的可能性。信心的百分比和序列比对被添加到系统发育树显示/ SNP检测与特定的基因序列和某些隔离。

2.4。淘汰赛中通过单步基因失活

细菌基因被淘汰单步失活如前所述[44]。简而言之,基因的引物设计兴趣聚集目标序列同源重组(表的取向S2)。的内在部分引物设计的同源性kanRpACYC177磁带。接下来,pKD119 (pBAD -λ红色)electroporated到EDL933 SS17;线性kanR磁带也electroporated后归纳的λ红色的葡萄糖在增长和复苏(41]。的kanR盒式重组到染色体被选为50磅+ Kan50(电镀µg / mL)其次是由内部和外部的菌落PCR引物(表中找到S3)和1%的琼脂糖凝胶分析。PCR结果然后送测序的宾夕法尼亚州立大学核心使用引物测序发现在表S3。SS17,运算单元也被选为LEE-mediated坚持控制(以前的数据获得了EDL933汇集李和抗体吗运算单元突变体的比例和HEp-2依从性;(40])。

2.5。交易所细胞粘附试验

证交所细胞粘附试验进行了如前所述[40,41]。短暂,EDL933 SS17(与完整的突变体)生长在杜尔贝科修改鹰中低葡萄糖(DMEM-LG;表达载体,宏伟的岛,纽约)在37°C没有颤抖。细菌是颗粒状,resuspended放入盐水中,加入1毫升DMEM包含105交易所细胞/毫升的比率10:1。细胞和细菌培养前4小时用颤抖的在37°C正在处理,放在polysine幻灯片(热科学,罗克福德,IL)如前所述[40,41]。固定的幻灯片也沾染了1%甲苯胺蓝荧光抗体O157和RSE-cytokeratins40,41]。坚持模式被光或荧光显微镜定性分辨和定量评分是由每个细胞计数细菌的数量在两个单独的盲目试验4技术复制每一个(40,41]。每个突变的依从性模式和效率随后回到亲本菌株相比。

2.6。HEp-2依从性分析

如前所述(执行HEp-2依从性分析40]。简而言之,O157: H7隔离(SS17和EDL933)及其突变体添加到HEp-2细胞室幻灯片的比率10:1。Postassay,幻灯片沾1%甲苯胺蓝和可视化40 x放大在幻灯片定性和定量识别模式和效率的变异测试其亲本菌株。

2.7。统计分析

依从性的统计分析化验使用Microsoft Excel和双尾t每个突变以及原始数据的平均值相比。统计上显著的差异计算 值< 0.05。

3所示。结果

3.1。基因的选择和系统发育分析SS隔离基于Nonfimbrial丰富

九nonfimbrial基因从图中所示的标准选择的坚持1。标准考虑感兴趣的基因是基因和/或产品必须与依从性相关,表现出一种产生的单核苷酸多态性(nsSNP)同流合污EDL933相比,蛋白质组中表达和/或数组由·库和他的同事们。的两个基因,宫内厅和ompA没有比EDL933 snp同流合污。的基因eivA,csgG,wzzB,婚都有一个nsSNP而EDL933和yfaL有3个nsSNPs基因。intimin基因测序(运算单元)并没有发现突变,预期一样重要的基因赋予亲密坚持人类上皮细胞。最后一个基因儿童和青少年卫生与发育司编码的无义突变删除最后∼850个碱基对的基因。为了证实先前的观察,intimin没有参与的坚持O157: H7证交所细胞,(我们淘汰intimin基因,实验性自身免疫性脑脊髓炎40,41]。表1显示所有选择的基因,氨基酸的变化结果的snp基因,和感兴趣的基因的功能。
基因 氨基酸的变化一个 描述
宫内厅 - - - - - - Fur-regulated adhesin enterobactin运输车
ompA - - - - - - 5型分泌系统autotransporter
csgG P76 T 柯林蛋白质生物合成部分
wzzB P136S 有限合伙人模态长度调节器参与依从性
婚 T1301 K Intimin-like同族体蛋白
eivA P33S 小蛋白参与T3SS针的生物合成
yfaL S23P D38 N T104I 5型分泌系统autotransporter
儿童和青少年卫生与发育司 836年蛋白石 5型分泌系统autotransporter
运算单元 - - - - - - Intimin (adhesin)
一个氨基酸的变化,在指定的上下文氨基酸位置和在基因单核苷酸多态性的结果。“-”表示没有氨基酸的变化。
表1
nonfimbrial的细节感兴趣的基因。

序列的丰富选择了其他11个党卫军隔离。这些序列是用来识别如果任何snp发现同流合污也发现在其他学生隔离,没有人完全守恒(表2)。使用最大似然网站27日(9码)的所有基因选择,系统地图创建(图2)。如图2表明,有明显的集群的党卫军隔离相关的血统,但是脉冲场凝胶电泳的出现之前确定类型。
O157隔离 感兴趣的基因/ SNP的位置
宫内厅 ompA csgG wzzB 婚 eivA yfaL 儿童和青少年卫生与发育司b 运算单元
226年 403年 3902年 97年 67年 112年 311年 2504年
EDL933 WT一个 WT 在20 有条件现金转移支付 ACA CCC TCT 手枪 ACC FL WT
魔法石,第1章 WT WT 在20 有条件现金转移支付 一个一个一个 CCC TCT 手枪 ACC FL WT
七号信令 WT WT 在20 有条件现金转移支付 一个一个一个 CCC TCT 手枪 ACC FL WT
SS12 WT WT 在20 有条件现金转移支付 ACA CCC TCT 手枪 ACC FL WT
SS17 WT WT 一个CG TCT 一个一个一个 TCC CCT 一个在 一个TC 删除 WT
SS27 WT WT 在20 有条件现金转移支付 一个一个一个 CCC TCT 手枪 ACC FL WT
SS42 WT WT 在20 有条件现金转移支付 ACA CCC TCT 手枪 ACC FL WT
SS52 WT WT 一个CG TCT 一个一个一个 CCC CCT 一个在 一个TC FL WT
SS67 WT WT 一个CG 有条件现金转移支付 一个一个一个 CCC CCT 手枪 ACC FL WT
SS77 WT WT 在20 有条件现金转移支付 一个一个一个 CCC TCT 手枪 ACC FL WT
SS131 WT WT 在20 有条件现金转移支付 ACA CCC TCT 手枪 ACC FL WT
RM11326 WT WT 在20 有条件现金转移支付 ACA CCC TCT 手枪 ACC FL WT
RM11333 WT WT 在20 有条件现金转移支付 ACA CCC TCT 手枪 ACC FL WT
一个WT:野生型。的宫内厅和ompA基因没有之前报道snp同流合污。b的儿童和青少年卫生与发育司基因包含一个蛋白石无义突变同流合污所表示的“删除”。FL:全长。
表2
SNP位置和核苷酸变化在党卫军隔离9基因的基因组相比,EDL933基因组。

图2
系统发育分析SS EDL933基于丰富的隔离。最大似然引导分析使用adhesion-related基因snp EDL933隔离相比显示。有其他11个隔离结合SS17和EDL933运行分析。这一分析表明,仅仅根据这些丰富,隔离集群接近他们的血统,但是脉冲场凝胶电泳的出现类型。右边的面板是与每个基因的核苷酸变化一致的核苷酸中找到相应的隔离。规模(0.05)表明基于变化的数量/站点的距离。
3.2。基因缺失确认

为了删除基因,kanR磁带从pACYC177扩增和两侧菌进行基因序列同源基因是有针对性的,匹配的基因的方向。使用内部和外部的引物kanR磁带和邻近的目标基因的序列,分别(表S3)、菌落PCR进行确认突变。这些基因的成功突变SS17和EDL933经凝胶电泳(图3)和突变株随后被使用的依从性与交易所和HEp-2细胞研究。


图3
凝胶电泳确认删除。以上是菌落PCR产物的琼脂糖凝胶图像获得单步后每个基因的失活。每个车道标志如下:m - 1 kb的标记(阶梯),1、2点SS17亲代菌株与引物方式和甲分别和3和4 SS17缺失突变体与引物方式和甲。引物的引物是显示表S3。特定基因引物方式显示在每个凝胶图像和底漆C是匹配的反向引物特定的菅直人盒与每个基因的引物。
3.3。SS17和EDL933 Adhesin HEp-2细胞突变体

的细菌粘附模式SS17 HEp-2细胞扩散和温和,这是综合形成了鲜明的对比,强烈的附着表型证交所细胞上展出。毫不奇怪,运算单元(intimin)删除显示缺乏坚持HEp-2细胞(图4)。另外两个突变,SS17ΔyfaL SS17Δ婚,也抑制的能力SS17坚持HEp-2细胞定量(图4(一)和表S4)和定性(图4 (b))。如图5模式显示,EDL933有同样的坚持HEp-2细胞SS17(扩散和温和的)和抗体李曾表现出严重减少依从性(40]。见图4,EDL933ΔyfaL显示一个不依从表型,但EDL933Δ婚没有干扰的能力EDL933坚持HEp-2细胞。然而,EDL933Δ宫内厅和EDL933ΔwzzB都不依从表型HEp-2细胞(图显示5和表S5)。现有的丰富的测试都没有显示任何差异的能力SS17或EDL933坚持HEp-2细胞。

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(b)
图4
SS17坚持HEp-2细胞突变表型。遵循父母的应变和随后的SS17 adherence-associated基因突变体检测坚持定性定量(a)和(b)。结果表明,SS17Δyfal,Δ婚,Δ运算单元都是缺乏坚持HEp-2细胞相比,父SS17应变。(a)条代表四个技术复制每张幻灯片,20个细胞/现货被数在两个试验。酒吧是附着细菌的平均百分比(> 10或1 - 10)/ HEp-2细胞在两个试验。(b)甲苯胺中使用幻灯片的“坚持形态”SS17 HEp-2细胞。每个面板的比例尺设置为100μm。星号表示 值< 0.05。
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(b)
图5
EDL933坚持HEp-2细胞突变表型。遵循父母的应变和随后的EDL933 adherence-associated基因突变体检测坚持定性定量(a)和(b),表明EDL933ΔyfaL,Δ宫内厅,ΔwzzB都是缺乏坚持比野生型EDL933 HEp-2细胞。(a)条代表四个技术复制每张幻灯片,20个细胞/现货被数在两个试验。酒吧是附着细菌的平均百分比(> 10或1 - 10)/ HEp-2细胞在两个试验。(b)甲苯胺中使用幻灯片的“坚持形态”EDL933 HEp-2细胞。每个面板的比例尺设置为100μm。星号表示 值< 0.05。
3.4。SS17和EDL933 Adhesin交易所细胞突变体

野生型SS17维护综合和强劲的依从性模式大约95%的证交所细胞取样大于10细菌/细胞(图6和表S4)。从九nonfimbrial adhesin突变体同流合污测试,没有显示任何变化在坚持效率(图6(一)(图)或依从性模式6 (b)与野生型相比。如图6显示所有基因淘汰赛中显示无显著差异,在交易所细胞的数量大于10细菌/细胞(表S4)。

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(b)
图6
SS17坚持在交易所细胞突变表型。亲代菌株和SS17 adherence-associated基因突变的检测坚持定性定量(a)和(b)在交易所细胞。结果显示,所有的突变显著改变SS17绑定交易所细胞以其独特的综合的能力,强烈的坚持。(a)条代表四个技术复制每张幻灯片,20个细胞/现货被数在两个试验。酒吧是附着细菌的平均百分比(> 10或1 - 10)/交易所细胞在两个试验。模式(b)的免疫荧光SS17坚持证交所细胞。细菌用绿色标记,与红色交易所细胞细胞角蛋白,证交所细胞核与DAPI荧光染色法(蓝色)。每个面板的比例尺设置为100μm和白色的箭头显示O157交易所细胞。

与野生型EDL933,大约一半的证交所每细胞和细胞大于10细菌相似数量的证交所细胞每细胞(图1 - 10的细菌7(一)),和一个综合,温和的依从性表型观察(图7 (b))。EDL933Δ儿童和青少年卫生与发育司和EDL933Δ宫内厅变得不那么有效地绑定到交易所细胞更多的比例在1 - 10 /细胞(Δ细菌儿童和青少年卫生与发育司)或整体亏损的依从性(Δ宫内厅)。有趣的是,EDL933Δyfal,EDL933ΔeivA,EDL933ΔompA,EDL933ΔwzzB所有显示的变化野生型EDL933坚持模式从综合适度综合强,相同的表型SS17展出的隔离(图7 (b)和表S5)。如图7(一)显示,这些结果符合交易所细胞> 10 EDL933细胞的百分比/交易所细胞与SS17看到。

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(b)
图7
EDL933坚持在交易所细胞突变表型。亲代菌株和EDL933 adherence-associated基因突变的检测坚持定性定量(a)和(b)在交易所细胞。结果表明,突变体的EDL933相比有很多依从性差异父母的压力。这些差异是依从性(EDL933Δ的损失宫内厅和Δ儿童和青少年卫生与发育司)和表型从综合适度坚持相同的综合强烈坚持在证交所细胞(ΔEDL933展出yfaL,ΔwzzB,ΔompA,ΔeivA)。(a)条代表四个技术复制每张幻灯片,20个细胞/现货被数在两个试验。酒吧是附着细菌的平均百分比(> 10或1 - 10)/交易所细胞在两个试验。模式(b)的免疫荧光EDL933坚持证交所细胞。细菌用绿色标记,与红色交易所细胞细胞角蛋白,证交所细胞核与DAPI荧光染色法(蓝色)。每个面板的比例尺设置为100μm和白色的箭头显示O157交易所细胞。黑色的星号表示 值< 0.05增加依从性和红色的依从性的损失。

4所示。讨论

肠出血性大肠杆菌特别是,O157: H7,仍然是一个主要关心的食源性疾病,因为许多阻碍其传播的努力已经成功(13]。是无症状的牛的主要水库O157: H7、supershedding牛最影响细菌对环境的负担(12]。有史以来最有效的方式,以防止疾病发生在人类是防止的殖民和传播O157: H7通过其来源(41]。殖民统治的能力是非常相关的能力O157: H7坚持牛,因此,这个殖民事件似乎是重要的影响变化O157: H7脱落,如supershedding [8,11]。

前面分析的RAJ透露,这个区域是由两个细胞形态不同的人口等follicle-associated上皮细胞(身上)和rectoanal结鳞状上皮细胞的比例);这两个已经被证明与O157: H7 (2,6,40]。综上所述,数据表明,理解的复杂本质O157: H7与RAJ上皮细胞的交互可能有助于阐明条件所需的党卫军表型的坚持。进一步了解所涉及的微生物组成的依从性和/或SS依从性表型作为一个整体,我们执行一个代表的基因和表型分析SS隔离,SS17 [40,41]。分析揭示了60多个毒力基因可能参与hyperadherent表型SS17展出证交所细胞(40,41]。尽管这种表型的保护在所有SS隔离,一项研究表明,没有一个基因组成通过各种类型的方法可以从non-SS单独的党卫军隔离隔离的研究表明,党卫军隔离单独显示大基因组异质性(9]。研究集中在nsSNPs坚持效率的差异和依从性的模式SS17在交易所细胞明显不同于EDL933 [41]。SSS17之间比较基因组学和EDL933显示4847个snp比较SS17 EDL933,表明有大量的基因变化,可能扮演了一个重要的角色在以前报道的依从性模式,没有特别丰富,作为我们的序列数据显示在表2和图2(40,41]。

同样的研究也显示(这一)的坚持O157: H7证交所细胞是独立于李操纵子(40,41]。两个SS17Δ运算单元和SS17汇集打倒李明博血清的存在,能够保持党卫军坚持证交所细胞表型(40,41),这表明微生物因素在这坚持必须包括non-LEE-regulated丰富或其他因素。在这项研究中,这些丰富的针对试图找到依从性的因素和机制的差异比EDL933 SS17证交所细胞。通过结合基因数据会议三个标准(编码一个LEE-independent adhesin,包含一个nsSNP和之前定义的蛋白质组的一部分),基因选择删除。九丰富或adherence-related基因符合这些标准,覆盖了大部分的non-LEE-regulated nonfimbrial丰富(19,30.(表)被选中作进一步分析1)。

大多数微生物显示基因与宿主共同进化,正如O157: H7能感染牛和人类,可以预见,不同微生物因素参与的殖民化每个主机(主机微环境是不同的)保持健康;然而,没有工作我们已经完成知识向这45,46]。同样,有能力和表型差异的党卫军O157: H7隔离遵守交易所的细胞,但什么因素推动这一变化以及它们如何可能会影响分离附着在人体细胞的能力还不是很清楚。

SS17和EDL933表明坚持HEp-2细胞,模式和效率,相对相同的两个不变异之间的隔离,尽管两者之间的大量snp(数字4和5)。然而,adhesin缺失突变分析表明,粘附和聚集的潜在机制是依赖于应变和宿主细胞的。鉴于遗传异质性的党卫军隔离测序为本研究的初步分析和这些菌株的差异从一个经典应变(EDL933),这可能是一个函数的适应性突变和监管职能之间的界面的时候O157: H7和主机。如图4所示,EDL933Δ宫内厅和EDL933ΔwzzB不依从表型HEp-2细胞而SS17Δ显示婚(图5)显示不依从HEp-2细胞表型。其余部分和相应的突变体EDL933和SS17没有改变其他隔离的依从性。这两个wzzB和婚包含nsSNPs EDL933和SS17之间,这样看来,这些基因及其单核苷酸多态性可能扮演一个角色在这个分歧在坚持HEp-2细胞的机制。它是可能的wzzB单核苷酸多态性导致的形成变化的有限合伙人同流合污,从而允许SS17丰富的访问宿主细胞受体没有干扰。这些观察表明,EDL933和SS17有两个不同的初始坚持HEp-2细胞的潜在机制wzzB,婚,宫内厅O157: H7扮演关键角色在坚持人类上皮细胞,但他们的贡献可能依赖于应变机制。

数据4和5表明,ΔyfaL突变在两个隔离坚持HEp-2细胞减少,表明nsSNPsyfaLO157: H7的能力并不影响隔离坚持人类上皮细胞或影响的整体机制。这也表明YfaL不可或缺的一部分是守恒的依从性机制O157: H7人类上皮细胞。据我们所知,这是第一次yfaL和婚已被证明是至关重要的依从性O157: H7人类上皮细胞。综上所述,这些数据表明,坚持人类上皮细胞的能力(如涉及中央因素yfaL),但是维护,坚持将取决于不同的因素,可以具体。这些数据还表明,nsSNPs婚和wzzB可能会改变整个函数与这些基因或监管机制,使他们更重要的某些坚持人类上皮细胞的能力。

尽管SS17Δ婚显示不依从HEp-2细胞表型,相同的突变没有带来损失甚至改变坚持SS17证交所细胞。事实上,所有的突变可能导致改变坚持SS17证交所细胞的突变体都能够保持强劲,综合坚持超过85%的证交所细胞> 10 O157: H7每个细胞。前面的工作,展示了依从性表型SS17依从性之间的差异HEp-2细胞(扩散和温和的)和证交所(强和综合)不建议改变整体的依从性机制,但在这里,我们表明,实际上是有区别的因素(41]。我们可以得出结论,没有一个nonfimbrial丰富本研究选择单独负责hyperadherent表型SS17证交所细胞上展出。

EDL933突变体的证据发现进一步支持这一观点。EDL933Δ儿童和青少年卫生与发育司显示减少的依从性模式和不那么坚持效率低于细胞与野生型EDL933相比,指示是很重要但不是必不可少的EDL933坚持这种细胞类型的能力。EDL933Δ宫内厅显示相同的依从性表型和聚合连接到交易所细胞缺陷的能力,但EDL933完全不依从HEp-2细胞。这些数据表明,宫内厅和Cah扮演关键角色的依从性EDL933和其他类似的O157: H7交易所细胞,但它们不是必要的。然而,宫内厅是必不可少的坚持人类上皮细胞的能力。他们都是必不可少的综合表型,单独为每个基因突变造成的损失聚合表型。这些数据都是在反对SS17,删除儿童和青少年卫生与发育司或宫内厅没有造成表型差异坚持细胞类型。

这是特别有趣,因为在EDL933儿童和青少年卫生与发育司假字,都是全身的基因而儿童和青少年卫生与发育司同流合污丢失一半的锚定β由于蛋白石桶移码突变(32,41]。尽管如此,SS17仍坚持交易所细胞能够赋予强于EDL933全身儿童和青少年卫生与发育司(两份),当删除,EDL933证交所细胞抑制综合坚持,坚持表型也变化。这个建议SS17有功能冗余,甚至更合适adhesin坚持这两个细胞类型,综合和强烈坚持独立的交易所细胞儿童和青少年卫生与发育司或宫内厅。

在交易所细胞,EDL933ΔyfaL,EDL933ΔompA,EDL933ΔeivA,EDL933ΔwzzB显示一个强大和综合表现型相同而缺乏依从性(Δ突变体yfaL和ΔwzzB对依从性(Δ)或没有影响ompA和ΔeivA)HEp-2细胞。这不仅继续在依从性机制,建议分歧似乎依赖于应变和主机,但这些基因参与党卫军的过程坚持证交所细胞表型。这是因为这些突变体及其对交易所产生的表型细胞特定于EDL933 (non-SS隔离);相同的突变SS17没有影响。两个分离株之间的差异的原因和坚持他们的能力不同的细胞类型可以由任意数量的机制包括基因表达的改变引起的相互作用与膜结合遗传监管元素(图8(一个)),这些基因的表观遗传调控(图的变化8 (b)),改变了氨基酸之间的相互作用(图的变化8 (c)),甚至潜在的多种因素的结合。

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图8
提出了模型驱动SS-RSE表型的坚持。根据我们的数据EDL933突变体和SS17 SNP数据,我们提出以下模型开始解释所展现出来的独特的依从性表型党卫军隔离在证交所细胞。目前,我们没有足够的数据来缩小的机制,但是我们提出三种可能的机制可能参与这些现象。(a)的变化与膜结合转录监管机构(MBTR)等监管机构或法定人数σ因素为例。许多全球监管机构位于膜大肠杆菌他们最有可能与外膜蛋白质和丰富的交互。左侧面板描述EDL933遵守交易所的遗传状态细胞的外膜蛋白(例如,YfaL)可以与MBTR交互。然而,在右侧面板显示SS17交易所细胞,突变,运输车(或与OmpA示例,突变MBTR)扰乱这个常规连接允许下游upregulation的目标基因,包括那些参与遵守交易所的细胞和聚合O157: H7细胞。(b)表观遗传变化也会发生由于遗传密码的变化。在这个例子中,左边的面板显示了EDL933突变体和SS17提出的基因组景观与表观遗传调控的网站。的吧,上面板,在EDL933亲本菌株,表观遗传活动分布表达所示的转运蛋白。然而,其他丰富和聚合蛋白基因序列可能没有偏好由于这些酶的亲和力。当SS17收购snp在这些基因或基因被删除(与EDL933Δ一样ompA),优先切换到低亲和力网站,因此移植这些其他丰富的基因和聚合。(c)最终的模式,我们建议改变周边的功能蛋白质或蛋白质的合作伙伴这些基因和基因产物。在这个例子中,一个autotransporter可以与另一个adhesin /聚合膜蛋白质。这给两个独立但丰富的一个特定的函数作为他们共同行动。这种相互作用的变化,然而,可能推动改变通用功能和表型的变化,在这个例子中从一个分散但强烈坚持更综合、更强的依从性。这种变化可能导致另一个adhesin或两种丰富的协调变得更强大,从而推动更高的依从性和聚合,就像将如果这些基因被删除(如EDL933突变体)。选择同样的假设之一是改变另一个adhesin我们没有测试与测试的受体之一,但并不表现出nsSNP(比如OmpA)。如果其他受体变化导致了离解同流合污,删除ompA(在这个例子中)会导致同样的离解EDL933,导致EDL933依从性表型的变化。

snp可能导致蛋白质功能的改变(或蛋白的伴侣函数),甚至规定其他蛋白质(41]。例如,yfaL有三个nsSNPs效应的领域,非保守的是两个方面的变化:S23P D38N。丝氨酸脯氨酸的变化会导致一个扭结的α螺旋部分蛋白质,放松与丝氨酸(47- - - - - -49]。也可以磷酸化丝氨酸作为化学改性,使脯氨酸不能(50]。这可能会改变可用磷酸盐在细胞可能会改变蛋白质的相互作用参与。

snp的另一个后果是一个改变在整个遗传密码,这可能影响表观遗传的功能独联体和反式效应器(47]。在表型的基因改变了EDL933坚持证交所细胞,表现出三种基因snp同流合污(wzzB,yfaL,eivA)[41)可能影响表观遗传效应物的绑定。这些感受器,同流合污,可以绑定到类似的网站上其他驱动党卫军表型的基因。交易所细胞EDL933突变依从性,等ompA突变体,可以解释另一个可能性,基因表达的变化。OmpA是广泛表达的外膜O157: H7,这也是很多外膜转录监管机构居住(35]。这些监管机构可能会有变化,防止OmpA等适当的与蛋白质相互作用,因此,删除ompA会导致EDL933党卫军表型。

总的来说,这项研究揭示了一些重要的新信息的机制在决定坚持牛和人类上皮细胞。我们已经确定,坚持SS17 EDL933证交所和HEp-2细胞是通过不同的因素和机制介导的。在一个小的方式,这些发现表明,因素和机制,从根本上提高依从性和聚合时O157: H7肠出血性大肠杆菌接口与应变不同的宿主细胞和宿主细胞类型的依赖。其他党卫军菌株都需要进一步的研究来确定是否这些发现可以推断是党卫军状态的函数。

因为坚持对HEp-2细胞表型大约是相同的,不同的因素表明高水平的功能冗余编码由O157: H7菌株和他们所使用的基因和基因产物(即使它们是不同的)。没有nonfimbrial基因,本研究选择在单独负责的强劲,综合依从性表型展出SS17和其他党卫军菌株测序研究。尽管如此,EDL933缺失突变体的耦合的结果HEp-2依从性实验带来了一个基因,应该考虑进行进一步分析,yfaL。删除adhesin导致了消融的坚持SS17和EDL933 HEp-2细胞,但这同样删除导致赋予党卫军坚持EDL933坚持证交所细胞表型。

这些研究将需要进一步的分析和补充研究,以确定这些基因发挥实际的作用在各自的表型,尤其是对那些参与纳粹党卫军表型(如发现蛋白质伙伴和发生在这些基因的表观遗传变化)。缩小这些基因可能帮助开发新的疗法和更好地理解复杂的和复杂的监管途径和交互参与坚持O157: H7各种细胞类型。总的来说,这些研究强烈建议的初始粘附模型O157: H7是极其复杂的,分层,应变依赖,更独特的依从性表型的党卫军O157: H7。

数据可用性

支持所有数据可以在补充信息或通过请求相应的作者。

信息披露

本文中提到的贸易名称或商业产品是专为提供具体信息,并不意味着美国农业部推荐或认可。美国农业部是一个平等机会提供者和雇主。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢我们其他的合作者在美国农业部的生产安全与微生物学研究单位(动物研究中心在奥尔巴尼,CA)和玛丽亚Brandl博士和米歇尔·卡特的深刻的对话,与这个项目的建议。作者感谢Deb Grove博士和宾夕法尼亚州立大学设施SS17序列的基因组测序和基因序列的系统发育分析。大感谢博士是由于Subhashinie Kariyawasam博士和夫人环球Wijetunge pKD119质粒和帮助协议。作者感谢布莱恩·惠勒先生国家动物疾病中心(NADC),埃姆斯IA,因为他的特殊技术援助与真核细胞化验的坚持。动物资源单位人员在NADC感激地承认的协助收集牛rectoanal结组织和棉签。这个项目是由USDA-ARS短剑项目5030 - 32000 - 100 - 00 - d和5030 - 32000 - 112 - 00 - d。

补充材料

表S1:测序引物对SS17丰富。表S2:kanR盒式生成PCR引物。表S3: PCR引物筛选单基因失活kanR插入。表S4:百分比和依从性表型SS17和SS17 HEp-2和证交所细胞突变体。表S5:百分比和依从性表型EDL933和EDL933 HEp-2和证交所细胞突变体。(补充材料)

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