潜在毒力因子的鉴定弧菌mimicus从渔业产品和水中分离

摘要

弧菌mimicus与革兰氏阴性菌有密切关系吗霍乱弧菌并因食用受污染的鱼类和海鲜而导致人类患上肠胃炎。该细菌从238份海水、牡蛎和鱼类的分析样本中分离并鉴定。20株被鉴定为V. MIMICUS.根据放大的vmhA基因，这是一个有用的标记鉴定的物种。检测脂肪酶、蛋白酶和核酸酶的产生;45%的菌株能产生热裂解酶，40%的菌株能产生羟肟酸型铁载体IUT基因被放大了V. MIMICUS.菌株。百分之七十五V. MIMICUS.在HEp-2细胞系上，100%的菌株均以聚集粘附方式贴壁。毒性因子的存在V. MIMICUS.从渔业产品获得的菌株表明另一个成员弧菌属可能代表一个风险的消费者，由于生产不同的代谢物，允许它在宿主中生存。

1.介绍

弧菌mimicus与革兰氏阴性菌有密切关系吗霍乱弧菌并会因食用受污染的鱼类及海鲜而引致胃肠炎，症状包括腹泻、恶心、呕吐、腹痛及发烧[1，2］.感染剂量未知，但据信与霍乱弧菌，从10个⁴到10⁶细胞 [3.］.这种细菌已经从水和各种渔业产品中分离出来，如牡蛎、海龟蛋、虾、螃蟹和鱼[4］.

致病机制V. MIMICUS.是未知的;然而，据报道V. MIMICUS.产生多种毒性因子，包括黏附素、溶血素和各种类型的蛋白酶(胶原酶和金属蛋白酶)、铁载体、细胞溶血素、脂肪酶和dna酶[5，6］.这种细菌产生一种不耐热的溶细胞/溶血毒素，称为弧菌mimicus溶血素编码在vmhA在环境和临床菌株中发现的[7，8］.因此,vmhA基因是鉴定该物种的有用标记[7］.

据报道了这一点V. MIMICUS.与…有某些基因型特征霍乱弧菌如ctx编码胆毒素的AB操纵子，其基因在噬菌体基因组中发现CTXΦ和感染霍乱弧菌，表明该噬菌体在霍乱弧菌和V. MIMICUS.［9，10］.

有几份关于感染的报告V. MIMICUS.在其他国家，认为毒株必须含有因食用生的或未煮熟的渔业产品而导致感染的基因;然而，目前还没有关于野生型菌株中毒性标记物的研究。我们发现从环境样本中分离出的菌株中存在一些毒力因子。

2。材料和方法

2017年6月至12月，在韦拉克鲁斯州Pueblo Viejo泻湖(México)的12个不同地点(11个牡蛎、11个鱼类和12个海水样本每月)共采集238份样本。

捕获的品种是白鲻鱼(Mugil curema)及美洲牡蛎(Crassostrea virginica）.鱼和牡蛎样品在单独标记和密封的塑料袋中运输。海水样品被收集在标记的塑料罐中。在收集后立即将样品在4℃下冷却并运输到实验室进行分析。

2．1．分离和表型鉴定V. MIMICUS.

V. MIMICUS.已按照食物及药物管理局的细菌分析手册所述分离及鉴定[11］.每个样品均质(Stomacher®400)循环器)，取50 g放入装有碱性蛋白胨水(APW, pH 8.8)的450ml烧瓶中，从1:10,1:100,1:1000重复稀释，37℃和42℃孵育6-24 h。水样中25 mL在225 mL碱性蛋白胨水中均质，37℃孵育至少6 h [12］.将稀释后的稀释液涂布于硫代硫酸钠-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板上，37℃孵育18-24 h;三个疑似V. MIMICUS.从每个板中选择菌落。对含有0,3,6,8和10％NaCl的胰蛋白琼脂进行嗜睡剂。API 20E系统（BioMerieux™）和vmhA利用扩增技术进行鉴定。

本研究使用的对照菌株为弧菌mimicus写明ATCC 33653,创伤弧菌ATCC 29307，霍乱弧菌O1小川,Vibrio Cholerae O1 Inaba,霍乱弧菌没有O1 CLBM-ENCB。

2．2．测定蛋白水解，脂解和溶血活性以及核酸酶和热核酸酶的生产

细胞在胰蛋白酶大豆琼脂中生长过夜，在37℃下，在37℃下，如García和Landgraf所描述的那样，接种到电镀的测定培养基上[13］.以酪蛋白(2%脱脂乳)为底物测定蛋白酶活性，以含10% (v/v)蛋黄乳剂的营养基础琼脂测定脂肪酶活性。将菌株分别用5%绵羊红细胞和5%兔红细胞在血琼脂上划线检测溶血情况。为了评估核酸酶的存在，200μ.l一夜之间文化V. MIMICUS.接种在dna酶琼脂上[14］.热切酶测定需要新鲜培养物V. MIMICUS.置于100°C水浴10分钟后，200μ.L用甲苯胺蓝接种于琼脂DNA孔上，37℃孵育6h [15］.

2.3。施工小球的存在

V. MIMICUS.菌体于营养液中37℃孵育18-24 h后接种于铬蓝酚S (CAS)琼脂上[16］.V．mimicus以ATCC 33653为阳性对照。

２.４.对中国仓鼠卵巢细胞的细胞毒作用评价

V. MIMICUS.将菌株接种于AKI肉汤(蛋白胨15 g/L，酵母膏4 g/L，氯化钠5 g/L pH 7.4)中，37℃摇瓶(5 g)培养18 h。培养物500 g离心10 min，上清液用0.22-μ.米孔膜。霍乱弧菌O1血清型小川和稻叶为阳性对照，未接种AKI肉汤为阴性对照。总计200μ.在ELISA板的96个孔中的每一个中，将C CHO悬浮液中的C CHO悬浮液置于胎儿牛血清（SFB）中。将板在37℃下在5％CO中孵育₂直到它们完全合流。孵育时间过后，弃去培养基，用无菌磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)冲洗3次。100年μ.L 1: 1, 1: 3, 1: 9日1:27岁,1:81年,1:253年,1:729年,每一式三份,1:2187稀释F12滤液的媒体,每一株都添加到每个盘子是35°C和5%孵化有限公司₂．倒置显微镜每隔60分钟观察一次，直至观察50%单层细胞的变化。当超过50%的细胞表现出形态的破坏或改变时，细胞病理和细胞毒性作用为阳性[5］.

2．5．HEp-2细胞系的粘附实验

粘附试验在24孔微滴度板上生长的人喉癌细胞(HEp-2)单层细胞中进行，并在37°C 5% CO中生长至融合₂．细胞单层用25份接种一式三份 μL的细菌悬液。培养皿在37°C和5% CO下孵育₂然后用PBS洗涤3次，去除未粘附的细菌，然后用甲醇固定细胞1分钟，用无菌PBS洗涤3次，giemsa染色20分钟。用蒸馏水冲洗井，用丙酮-二甲苯脱水，用Permount树脂滴密封。细胞在100倍显微镜下观察。当超过40%的细胞有粘附细菌时，粘附试验为阳性[5］.

2.6。遗传分析

使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)获得DNA。反应混合物的浓度为34.95μL蒸馏水，5μL 10倍缓冲液(200 mM Tris-HCl pH 8.4和500 mM KCl)， 2.5μl mgcl.₂50毫米,0.25μL的dNTP混合物(10毫米)，2.5μl每个底漆（1nm），0.3 μL (Taq聚合酶(5 U /μL), 2μ最终体积为50μL. PCR在多庚烷梯度DNA热循环仪中，具有桌子中报告的引物和条件1和2．获得的碎片在琼脂糖凝胶上检测，在Bio-Imagen Systems®上观察。使用MBE-IMG®(Mayor Science®)项目对图像进行数字化。

3.结果与讨论

在238分析的样品中，共有1455个菌落，具有该属的特征弧菌表型鉴定，只有20例被确认为V. MIMICUS.(6个从海水样品中分离，10个从牡蛎中分离，4个从鱼类中分离vmhA放大(图1）.V. MIMICUS.由于在不同的国家，在海鲜摄入后感染与肠胃炎有关，因为在不同的国家，习惯性地，牡蛎是直接从阀门吃掉[18］.事实上，几乎所有已报告的个案都与食用双壳类动物有关，这是直接污染源，而/或甲鱼蛋是交叉污染源[19，20.］.此外，鱼类被消耗，没有像“Ceviche”这样的热处理，典型的原料海鲜盘，其中只有柠檬;在假期季节进行的这些文化传统是与这种细菌属相关的疾病的危险因素。

所有分析的菌株都产生了β绵羊和兔红细胞溶血情况(表3.）;阿拉姆(21]和Beshiru [22]获得80%的溶血菌株。同样,三好(23)报道,V. MIMICUS.溶解马、羊和人的红细胞。该物种主要存在VMH溶血素，其同源性为76%hlyA的霍乱弧菌el Tor;VMH能够在细胞表面形成气孔，并促进cAMP的产生，导致腹泻[24，25］.

vmhA基因被认为是一种特定的基因，在野生型和临床菌株中都发现了它[7］.Wei等人[26]，表明基因扩增与脂肪酸谱、16S谱等其他鉴定技术相关DNAr，oriC，pyrH，recA,rpoA基因序列比较。在这项研究中，VMH.在所有工作菌株中扩增基因（表3.）.

在酶学检测方面，所有菌株都能产生脂肪酶和蛋白酶，只有45%的菌株能产生热切酶。这些结果与Alam的报告相似[20.，显示95%的V. MIMICUS.菌株产生蛋白酶呈阳性。Beshiru [21显示他们90%的V. MIMICUS.均为蛋白酶活性阳性。据报道，细菌蛋白酶是一种广泛的酶的集合，在致病性、应激反应和细胞活力中发挥重要作用[27- - - - - -29］.

本研究中所有分离的菌株都有脂肪分离活性。这些结果与Beshiru报告的结果类似[22］.戴维斯(30.]表明，在48小时内只有10％的脂肪酶活性阳性，并且填充[31]表示95％的V. MIMICUS.菌株具有脂肪酶活性。45%的分离菌株中存在dna酶V. MIMICUS。Beshiru [22报告说，他们的菌株100%产生dna酶。病原体产生的核酸酶可以降解细胞外DNA，作为逃逸和在组织中传播的手段。目前，大多数V.Vulnificus.和霍乱弧菌菌株的DNA破坏呈阳性[32，33］.众所周知霍乱弧菌dna酶被分泌到周围环境中[34］.

３．１．ctxA、tcpA、toxR基因检测

的片段ctxA和TCPA基因不能在任何被研究的菌株中被放大V. MIMICUS.(表3.）.这两种基因元素的缺失与Shinoda的报告一致[7，这表明在V. MIMICUS.环境起源的菌株低于1％[20.，34］.有V. MIMICUS.菌株，其中VPI1不完整;这些菌株缺乏编码TCP菌毛结构蛋白的基因(tcpA)或不拥有toxT调节剂基因[7，24］.

在所有被研究的菌株中toxR基因扩增(表3.） （数字2）.Shinoda [7]及普罗文扎诺[35表明该基因存在于所有的物种中弧菌属。该基因编码一种跨膜蛋白，该蛋白调节机体的许多毒力功能V. MIMICUS.和霍乱弧菌；它的存在使V. MIMICUS.调节自身毒力功能，改变外膜蛋白表达模式，响应环境刺激，有利于肠道定植、溶血素表达和鞭毛移动[36］.这种蛋白质能够调节存在于致病性岛和噬菌体中的基因[17］.

３．２．含铁细胞

在CAS琼脂中，40%的菌株能产生羟基酸盐型铁载体，且所有工作菌株均含有羟基酸盐Iutt.基因(表3.） （数字3.）.据报道了这一点V. MIMICUS.在缺铁时产生有氧肌动蛋白，以及操纵子iucABCD iutA参与了这个羟基酸盐型铁载体的合成[37］.

尽管我们发现Iutt.在100%的菌株中，并不是所有菌株都能产生铁载体。CAS培养基中某些成分的毒性已被报道，可以抑制某些微生物的生长[38］.关于艾滋病的流行程度还没有足够的报道Iutt.基因V. MIMICUS.；然而,月球(39在临床和环境中发现了有氧肌动蛋白操纵子V. MIMICUS.菌株。此外，这些作者认为这些基因位于细菌染色体上，并广泛分布于该物种的菌株中。

值得一提的是，铁载体作为毒性因子的作用在其他物种中受到质疑，如肺炎克雷伯菌，志贺氏杆菌spp和入侵大肠杆菌当有氧肌动蛋白操纵子消失时，它们就失去了致病性。这一事实表明铁摄入机制是宿主感染过程中的关键因素[40］.

３．３．无细胞滤液对CHO细胞系的影响

百分之七十五V. MIMICUS.菌株(15/20)3 h内出现细胞病变，6 h后出现单层破坏(图4）.其余(25%)仅表现出以细胞结构丧失为特征的细胞病变效应。滤液的滴度V. MIMICUS.范围从1:3到1:81，并且没有估计它们活动的先例。然而,Baffone [5)发现,V.Alginolyticus，V.Parahaemolyticus,霍乱弧菌O1滤液滴度均为1:4 ~ 1:10，因为后者具有较高的细胞毒性。袋(41据报道，孤立的霍乱弧菌no O1/no O139滴定度为1:4 ~ 1:128。

在我们的研究中，我们发现低于1：9的滴度导致细胞病表型，而具有更高的滴度，效果是细胞毒性达到1：81.滴度的差异可能是由表达的变化引起的血溶素是最常见的破坏和细胞损伤效果的原因弧菌属(41］.

3．4．依从性分析

我们发现100%(20/20)的菌株是粘附的(图5）.这些结果与以往的报告一致[21，42，43),描述V. MIMICUS.在小鼠肠细胞表面的多因子粘附过程中[43］.

4.结论

在本研究中，我们发现了毒力因子V. MIMICUS.如其他弧菌菌株所示。这些决定因素可能使微生物侵入宿主并造成组织损伤，以获得其生长和繁殖所需的营养来源。被污染的水产品V. MIMICUS.生食或未煮熟的食物可能有风险，因为可能引致肠胃炎爆发;它适应环境变化的能力和不同代谢物的产生使它能够在宿主中生存。这一发现促使我们建议进一步研究，以确定是否存在其他潜在因素V. MIMICUS.毒力因子。对其他种毒力因子的研究弧菌属提供信息，可以用来了解这种细菌的致病性。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Instituto Politécnico national和Universidad Autónoma Metropolitana的财政支持。

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