1.介绍
弧菌mimicus与革兰氏阴性菌有密切关系吗
霍乱弧菌并会因食用受污染的鱼类及海鲜而引致胃肠炎，症状包括腹泻、恶心、呕吐、腹痛及发烧[
1，
2］.感染剂量未知，但据信与
霍乱弧菌，从10个4到106细胞(
3.］.这种细菌已经从水和各种渔业产品中分离出来，如牡蛎、海龟蛋、虾、螃蟹和鱼[
4］.
病毒的致病机制
诉mimicus不明;但是，已经报告了
诉mimicus产生多种毒性因子，包括黏附素、溶血素和各种类型的蛋白酶(胶原酶和金属蛋白酶)、铁载体、细胞溶血素、脂肪酶和dna酶[
5，
6］.这种细菌产生一种不耐热的溶细胞/溶血毒素，称为
弧菌mimicus溶血素编码在
vmhA在环境和临床菌株中发现的[
7，
8］.因此,
vmhA基因是鉴定该物种的有用标记[
7］.
据报道
诉mimicus与…有某些基因型特征
霍乱弧菌如
ctx编码胆毒素的AB操纵子，其基因在噬菌体基因组中发现
CTXΦ和感染
霍乱弧菌，表明该噬菌体在
霍乱弧菌和
诉mimicus［
9，
10］.
有几份关于感染的报告
诉mimicus在其他国家，由于食用生的或未煮熟的渔业产品，建议菌株必须含有可导致感染的基因；然而，没有对野生型菌株中含有的毒力标记进行研究。我们表明，从环境样本中分离的菌株中存在一些毒力因子。
2.材料和方法
2017年6月至12月，在韦拉克鲁斯州Pueblo Viejo泻湖(México)的12个不同地点(11个牡蛎、11个鱼类和12个海水样本每月)共采集238份样本。
被捕获的物种是白人mullet（
木瓜)及美洲牡蛎(
Crassostrea virginica）.鱼和牡蛎样品都装在分别贴上标签并密封的塑料袋中运输。海水样本在贴有标签的塑料瓶中收集。样品采集后立即在4°C下冷却，并运送到实验室进行分析。
2．1．<斜体>V的分离与表型鉴定。mimicus < /斜体>
诉mimicus已按照食物及药物管理局的细菌分析手册所述分离及鉴定[
11］.每个样品均质(Stomacher®400)
循环器)，取50 g放入装有碱性蛋白胨水(APW, pH 8.8)的450ml烧瓶中，从1:10,1:100,1:1000重复稀释，37℃和42℃孵育6-24 h。水样中25 mL在225 mL碱性蛋白胨水中均质，37℃孵育至少6 h [
12].将各稀释液划线至硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂平板上，并在37℃下培养18-24小时 h、 三名嫌疑犯
诉mimicus从每个培养皿中选择菌落。在含0、3、6、8和10% NaCl的胰蛋白胨琼脂上进行嗜盐试验。API 20E系统(BioMerieux™)和
vmhA利用扩增技术进行鉴定。
本研究使用的对照菌株为
弧菌mimicus写明ATCC 33653,
创伤弧菌写明ATCC 29307,
霍乱霍乱O1 ogawa，
稻叶霍乱弧菌O1,
霍乱霍乱没有O1 CLBM-ENCB。
2．2．测定蛋白水解，脂解和溶血活性以及核酸酶和热核酸酶的生产
细胞在37℃、2% NaCl的胰蛋白酶大豆琼脂中培养过夜，并按García和Landgraf所述将细胞点接种到培养液上[
13］.以酪蛋白(2%脱脂乳)为底物测定蛋白酶活性，以含10% (v/v)蛋黄乳剂的营养基础琼脂测定脂肪酶活性。将菌株分别用5%绵羊红细胞和5%兔红细胞在血琼脂上划线检测溶血情况。为了评估核酸酶的存在，200
µ一夜之间的文化
诉mimicus接种在DNase琼脂上[
14］.对于热核酸酶测定，新鲜培养物
诉mimicus被置于100°C水浴中10分钟，然后，200
µ将该培养物的L接种在带有甲苯胺蓝的琼脂DNA孔上，并在37℃下培养6小时 h[
15］.
２．３．含铁细胞的存在
诉mimicus菌株在37℃下培养18-24小时 h在营养肉汤上接种，然后接种在铬天青S（CAS）琼脂上[
16］.
V．
mimicusATCC 33653作为阳性对照。
２.４.对中国仓鼠卵巢细胞的细胞毒作用评价
诉mimicus在AKI肉汤（蛋白胨15g / L，酵母提取物4g / L和氯化钠5g / L pH 7.4）中接种菌株，并在37℃下振荡（5g）温育18小时。将培养物离心为500g 10分钟，使用0.22-过滤上清液
µm孔膜。
霍乱弧菌O1血清型ogawa和Inaba被用作阳性对照，并且使用含有接种物的Aki肉汤作为阴性对照。总共200
µL CHO悬液在含15%胎牛血清(SFB)的F12培养基中，分别置于96孔ELISA板上。培养皿在37°C的5% CO中培养2直到它们完全合流。孵育时间过后，弃去培养基，用无菌磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)冲洗3次。100年
µ第1页，共1页 : 1, 1 : 3, 1 : 9, 1 : 27, 1 : 81, 1 : 253, 1 : 729和1 : 将每种菌株滤液的F12培养基上每三份2187份稀释液添加到每个孔中，并在35°C下用5%的CO培养板2．每60分钟在倒置显微镜下观察板在倒置显微镜下观察到50％单层细胞的改变。当大于50％的细胞显示出在其形态学的破坏或改变时，细胞病变和细胞毒性效应是阳性的[
5］.
2．5．HEp-2细胞系的粘附实验
粘附试验在24孔微滴度板上生长的人喉癌细胞(HEp-2)单层细胞中进行，并在37°C 5% CO中生长至融合2．单层细胞接种25
μ.L的细菌悬液。培养皿在37°C和5% CO下孵育2大气温度为1.5 h、 然后用PBS清洗单层细胞三次以去除非粘附细菌，然后用甲醇固定细胞1小时 min，用无菌PBS洗涤3次，Giemsa染色20分钟 用蒸馏水冲洗微孔，用丙酮-二甲苯脱水，用一滴Permount树脂密封。在100倍显微镜下观察细胞。当超过40%的细胞有粘附细菌时，粘附试验呈阳性[
5］.
2.6。基因分析
使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊Promega）获得DNA。反应混合物的制备浓度为34.95%
μ.l蒸馏水，5
μ.L个10倍缓冲区（200 mM Tris-HCl pH值8.4和500 毫米KCl），2.5
μ.L (MgCl250毫米，0.25
μ.L的dNTP混合物(10毫米)，2.5
μ.L的引物(1 nM)， 0.3
μ.L of
Taq聚合酶(5 U /
μ.l）和2
μ.最终体积为50
μ.L. PCR在多基因梯度DNA热循环器MIDSCI上进行，引物和条件如表所示
1和
2．在Bio-ImageSystems®上观察到的琼脂糖凝胶上检测获得的片段。使用MBE-IMG®（MayorScience®）程序以图像数字化。
:本研究使用的引物。
| 目标 |
底漆（5'⟶3′) |
参考 |
|
vmhA |
Fwd GGTAGYCATCAGTCTCATCACGrev tcrtstcccaatacttcaccg. |
当前研究 |
|
CTXA. |
FWD CTCAGAGGGGATTTGTTAGGCACG.牧师TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG |
［
7］ |
|
tcpA |
Fwd GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC牧师GAAAGGACCTTCTTTCACGTTG |
［
17］ |
|
弓形虫 |
Fwd ACAACAGCGACTCCTCAGAA牧师ACACACAGTTCTATCGAGGG |
［
7］ |
|
iut |
Fwd AACCGCTACCAATCAATCACAGAT牧师CAAAACCGGCGACAGAACCTACTT |
当前研究 |
用于基因检测的条件。
| 基因 |
vmhA |
CTXA. |
tcpA |
弓形虫 |
iut |
| 最初的变性 |
95°C / 5分钟 |
95°C / 5分钟 |
95°C / 5分钟 |
95°C / 5分钟 |
95°C / 5分钟 |
| 变性 |
95年45°C / s |
95年45°C / s |
95年45°C / s |
95年45°C / s |
95年45°C / s |
| 退火 |
58 45°C / s |
55°C / 30年代 |
57°C/40 s |
51°C / 45秒 |
62摄氏度/1 闵 |
| 扩展 |
72年45°C / s |
72年45°C / s |
72年45°C / s |
72年45°C / s |
72°C / 1分钟 |
| 放大子大小（bp） |
389 |
301 |
472 |
221 |
1573. |
3.结果与讨论
在238个分析样本中，共有1455个具有该属特征的菌落
弧菌表型鉴定，只有20例被确认为
诉mimicus（6份来自海水样本，10份来自牡蛎，4份来自鱼类）通过API 20E进行分离，并通过
vmhA放大(图
1）.
诉mimicus由于在不同的国家，人们习惯直接食用牡蛎的阀门，因此食用海鲜后会引致肠胃炎[
18］.事实上，几乎所有已报告的个案都与食用双壳类动物有关，这是直接污染源，而/或甲鱼蛋是交叉污染源[
19，
20.］.此外，吃鱼时不需要任何热处理，比如“酸橘汁腌鱼”，这是一种典型的生海鲜菜，只添加柠檬;这些在节日期间进行的文化传统是感染这种细菌属相关疾病的危险因素。
电泳凝胶的
vmhA基因扩增产物。Lanes (M): 100 bp分子量标记;Lanes 1-15:分离菌株
诉mimicus；巷16:
诉mimicus写明ATCC 33653;巷17:
创伤弧菌写明ATCC 29307;雷恩(O):
霍乱弧菌O1 Ogawa;雷恩(I):
霍乱弧菌O1稻叶型。
![]()
所有分析的菌株都产生了
β绵羊和兔红细胞上的溶血（表
3.）;阿拉姆(
21]和Beshiru [
22]获得了80%的溶血菌株。同样，三好[
23]报道说
诉mimicus裂解马、羊和人的红细胞。该物种的主要溶血素是VMH，与
Hlya.的
霍乱弧菌el Tor;VMH能够在细胞表面形成气孔，并促进cAMP的产生，导致腹泻[
24，
25］.
工作菌株的基因型和表型结果。
| 应变 |
起源 |
β−溶血 |
vmh |
含铁细胞 |
iut |
ctx |
tcpA |
弓形虫 |
细胞毒性 |
滤液的效价 |
依从性 |
| VM. |
写明ATCC |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 1 |
W |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 2 |
W |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 3. |
O |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 4 |
O |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 5 |
F |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
− |
1：9 |
+ |
| 6 |
F |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
− |
1：3 |
+ |
| 7 |
F |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 81 |
+ |
| 8 |
W |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 81 |
+ |
| 9 |
W |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 81 |
+ |
| 10 |
W |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
− |
1：3 |
+ |
| 11 |
W |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
− |
1：3 |
+ |
| 12 |
O |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 13 |
O |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 81 |
+ |
| 14 |
O |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 81 |
+ |
| 15 |
O |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
− |
1：9 |
+ |
| 16 |
O |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 17 |
F |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 18 |
O |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 19 |
O |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
| 20. |
O |
+ |
+ |
− |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
1: 27 |
+ |
W=海水;
O = 牡蛎；
F=鱼。
vmhA基因被认为是一种特定的基因，在野生型和临床菌株中都发现了它[
7］.Wei等人[
26]表明基因扩增与脂肪酸谱和16S等其他鉴定技术相关
DNAr，
oriC，
pyrH，
recA,
rpoA基因序列比较。在这项研究中,
vmh基因在所有工作品系中扩增
3.）.
在酶学检测方面，所有菌株都能产生脂肪酶和蛋白酶，只有45%的菌株能产生热切酶。这些结果与Alam的报告相似[
20.]，这表明95%的
诉mimicus菌株产生蛋白酶呈阳性。Beshiru [
21]显示他们90%的
诉mimicus分离为蛋白酶活性阳性。据报道，细菌蛋白酶是具有致病性，应力反应和细胞活力的重要作用的广泛收集酶[
27- - - - - -
29］.
本研究分离的菌株均具有脂解活性。这些结果与Beshiru的报告相似[
22］.戴维斯(
30.表明48小时脂肪酶活性只有10%呈阳性，Fiore [
31]表明95%的
诉mimicus菌株具有脂肪酶活性。在45%的分离菌株中观察到DNA酶的存在
诉mimicus。Beshiru [
22报告说，他们的菌株100%产生dna酶。病原体产生的核酸酶可以降解细胞外DNA，作为逃逸和在组织中传播的手段。目前，大多数
创伤弧菌和
霍乱弧菌菌株的DNA破坏呈阳性[
32，
33］.众所周知
霍乱弧菌DNA酶被分泌到周围环境中[
34］.
３．１．ctxA、tcpA、toxR基因检测
的片段
CTXA.和
tcpA在任何研究的菌株中不能扩增基因
诉mimicus(表
3.）.没有这两个遗传元素与Shinoda的报告一致[
7，这表明在
诉mimicus来自环境的菌株低于1% [
20.，
34］.有
诉mimicus菌株，其中VPI1不完整;这些菌株缺乏编码TCP菌毛结构蛋白的基因
（tcpA））或者没有拥有
弓形虫调节基因(
7，
24］.
在100％的学习菌株中，
弓形虫基因扩增(表
3.)(图
2）.信田(
7]还有普罗文萨诺[
35]表明该基因存在于所有物种中
弧菌属。该基因编码一种跨膜蛋白，该蛋白调节机体的许多毒力功能
诉mimicus和
霍乱弧菌
；它的存在允许
诉mimicus调节自身毒力功能，改变外膜蛋白表达模式，响应环境刺激，有利于肠道定植、溶血素表达和鞭毛移动[
36］.这种蛋白质能够调节存在于致病性岛和噬菌体中的基因[
17］.
电泳凝胶的
弓形虫基因扩增产物。Lanes (M): 100 bp分子量标记;巷1:
诉mimicus写明ATCC 33653;Lanes 2-20:分离菌株
诉mimicus；雷恩(O):
霍乱弧菌O1 Ogawa;雷恩(I):
霍乱弧菌O1群;莱恩(Vv):
创伤弧菌写明ATCC 29307。
![]()
3.2.铁载体
在CAS琼脂中，40%的菌株能产生羟基酸盐型铁载体，且所有工作菌株均含有羟基酸盐
iutT基因(表
3.)(图
3.）.据报道
诉mimicus产生aerobactin以应对缺铁和操纵子
宫内节育器参与该型羟肟酸酯的合成[
37］.
电泳凝胶的
iuT基因扩增产物。Lanes (M): 100 bp分子量标记;Lanes 1-20:分离菌株
诉mimicus；雷恩(Vm):
诉mimicus写明ATCC 33653;莱恩(O)
霍乱弧菌O1 Ogawa;莱恩(Vv):
创伤弧菌写明ATCC 29307。
![]()
尽管我们发现
iutT在100%的菌株中，并不是所有菌株都能产生铁载体。CAS培养基中某些成分的毒性已被报道，可以抑制某些微生物的生长[
38］.关于艾滋病的流行程度还没有足够的报道
iutT基因
诉mimicus尽管如此，月亮[
39在临床和环境中发现了有氧肌动蛋白操纵子
诉mimicus此外，这些作者认为这些基因位于细菌染色体上，广泛分布于该物种的菌株中。
值得一提的是，施工团作为毒力因子的作用质疑其他物种如
肺炎克雷伯菌，
志贺氏杆菌spp和入侵
大肠杆菌当有氧肌动蛋白操纵子消失时，它们就失去了致病性。这一事实表明铁摄入机制是宿主感染过程中的关键因素[
40］.
３．３．无细胞滤液对CHO细胞系的影响
百分之七十五
诉mimicus菌株（15/20）在3小时内表现出细胞病变效应 h和6天后的单层破坏 h（图
4)其余（25%）仅表现出细胞病变效应，其特征是细胞结构丧失
诉mimicus范围为1 : 三比一 : 没有先例来估计它们的活动。然而，巴芬[
5]发现了
溶藻弧菌，副溶血性弧菌,
霍乱弧菌考虑到后一种菌株是高度细胞毒性的，NO O 1滤液的滴度为1：4至1：10。包 [
41]报告说分离的
霍乱弧菌NO O1 / NO O139呈滴度为1：4至1：128。
CHO细胞株的细胞毒性试验。(a) CHO细胞对照。(b)阳性对照
霍乱弧菌O1血清型小川滤液。(c)由
诉mimicus暴露三小时后的滤液。（d）由细菌引起的细胞单层破坏
诉mimicus曝光6小时后过滤(倒置显微镜40X)。
![]()
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在我们的研究中，我们发现滴度低于1:9的结果是细胞病理表型，而滴度较高的结果是细胞毒性达到1:81。不同滴度之间的差异可能是由于溶血素表达的变化造成的，溶血素是最常见的破坏原因和产生的细胞损伤效应
弧菌属[
41］.
3．4．依从性分析
我们发现100%（20/20）的菌株是粘附的（图
5）.这些结果与以往的报告一致[
21，
42，
43),描述
诉mimicus在小鼠肠细胞表面的多因子粘附过程中[
43］.
坚持
诉mimicusHEp-2细胞。(a)阴性对照，HEp-2细胞。(b)附着模式
诉mimicus(光学显微镜100X)。
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