文摘
志贺产毒大肠杆菌(STEC)血清型O157 O26、O103 O111, O121 O145, O45指定为食品添加剂由美国农业食品安全及检验局。牛是这些人类病原体的主要储集层。在这项研究中,59安格斯杂交小母牛进行专门为这七个STEC血清组使用标准的结合文化、血清学、PCR和细胞细胞毒性的方法来确定获得类似的结果。动物粪便取样时,大约2岁,体重1000 - 1200磅。37%的饮食由地面苜蓿干草,25%地面苏丹干草,38%地玉米补充微量元素和瘤胃素随意进入水。Non-O157 STEC隔绝25%(15/59)的动物测试使用EC肉汤、CHROMagar STECTM,彩虹琼脂O157。有趣的是,O157血清组从任何的动物并不是孤立的。Non-O157 STEC隔离于六掺杂物的被证实是一个通过血清学和/或菌落PCR在10/15动物主要的可行,O103血清组。使用从粪便中提取DNA PCR验证大多数殖民地PCR结果还发现额外的毒性和o抗原基因样本没有相关文化的结果。志贺毒素——(Stx)相关的细胞病变效应在维洛细胞动物粪便提取物55/59只能与Stx基因相关资料通过粪便DNA PCR和没有文化的结果。文化之间的差异和粪便DNA PCR和细胞毒性试验结果表明,后两个化验反映不能存活的STEC的存在或感染STEC不属于七个掺杂物血清型。本研究进一步支持使用组合文化、血清学和PCR方法分离出可行的STEC食品安全构成更大的威胁。
1。介绍
志贺产毒大肠杆菌(STEC)是第三个后食源性疾病的主要原因弯曲杆菌和沙门氏菌与265000年在美国和全球2.8感染疾病(1- - - - - -3]。总经济损失对公共卫生、农业、和肉类行业估计为每年9.93亿美元归因于STEC的污染食品和人类感染促使宣言通常涉及STEC血清型(O157、O26 O103, O111, O121, O145,和O45)农业部食物安全及食品添加剂的检验服务(FSIS) [2,4- - - - - -9]。STEC感染是通过粪口途径获得后摄入的bacteria-contaminated食物或水或接触受感染的动物和人类(后10- - - - - -13]。感染后,一些人仍无症状,而另一些开发水性腹泻HC,可能会加剧常常致命的二级后遗症如溶血性尿毒综合征或血栓性血小板减少性紫癜(14]。没有特定的治疗方法可用于治疗STEC感染人类。STEC可以在低剂量感染(∼10可行的细菌)由于多个酸宽容和群体感应机制(11,12,15,16]。毒性等因素phage-encoded志贺毒素(Stx) [17),Stx1 Stx2, plasmid-encoded溶血(HlyA) [18),和各种依从性因素包括intimin、编码的运算单元肠上皮细胞的基因在致病性岛轨迹抹杀(李),扮演了一个重要的角色在人类疾病(17]。
牛被认为是主STEC水库大多数暴发是直接或间接地与牛有关19,20.]。牛仍无症状由于缺乏Gb3 Stx受体;没有吸收的毒素,就没有产生的系统性失败中观察到人类(21- - - - - -23]。尽管STEC可以隔绝各种胃肠道网站,他们坚持rectoanal结(RAJ) [24,25]。牛O157马车的平均持续时间是30天,尽管殖民的1年据报道(26- - - - - -28]。牲畜棚STEC的季节性模式,增加脱落在温暖的冬天月和减少脱落(20.]。动物脱落大于104CFU / g粪便,称为“super-shedders”导致群STEC[患病率29日,30.]。Postweaned小腿和牛往往更容易STEC殖民(31日- - - - - -34]。
研究人员使用不同的文化,immunomagnetic分离(IMS)和PCR方法,单独或组合,提高STEC野外样品的检测虽然不同成功(35- - - - - -44]。例如,当实时PCR用于屏幕573牛的粪便样本在屠杀Stx基因(417/573)和STEC Stx-positive样本血清型,结果并不总是符合可行STEC的文化相同的样本使用IMS,孤立,殖民地没有携带所有目标毒性基因(45]。类似的基于ims的比较文化和传统和多路复用定量PCR,用于分析576牛的粪便样本,表明这些技术检测到所有六个non-O157血清型负样本的其他方法从而强调对粪便样本的重要性两个文化和PCR的准确检测六non-O157 STEC [46]。维洛细胞细胞毒性实验被用来预测存在STEC粪便Stx结合细胞毒性;然而,与PCR,结果并不总是导致可行STEC的隔离(47-49)。改进的选择和分化前6 non-O157 STEC血清型,显色琼脂媒体发达,使隔离于这些的从114年的1897牛的粪便样本测试47]。同样,在120年一项研究评估肉牛,MacConkey和修改彩虹®琼脂O157琼脂的复苏频率增加non-O157 STEC菌株从动物粪便48]。
根据这些报道,在这项研究中,我们评估相结合的方法来确定O157的发生和“六大”non-O157 STEC奶牛STEC-susceptible。我们比较简单的粪便培养技术紧随其后的血清学和菌落PCR直接粪便DNA PCR和维洛细胞细胞毒性实验,以确定变化/相似的结果当使用这些方法来确定可行的O157和牛的“六大”non-O157 STEC粪便样本。
2。材料和方法
2.1。动物和抽样
畜牧兽医护理标准提供了在这项研究中,使用的动物和抽样进行批准的新墨西哥州立大学(NMSU)机构的动物保健和使用委员会。收集粪便样本(50 g /动物)通过直肠触诊总共59安格斯杂交小母牛,设在NMSU克莱顿畜牧中心2017年1月(冬季)和运输在冰NADC,埃姆斯IA,进行处理。所有样本被收集到无菌猎鹰管(热科学,罗克福德,IL)使用适当的无菌技术改变手套样品之间。抽样时,动物是大约2岁,体重1000−1200磅的体况评分6 (BCS范围1 - 9,9极为脂肪)。所有小母牛被人工受精。2016年10月导致52/59(88%)的牛怀孕由BioPRYN测试措施怀孕特有蛋白B血清(Biotracking、莫斯科、ID)。动物们汇合时,安置在单一土壤表面笔与部分阴影覆盖。37%的饮食由地面苜蓿干草,25%的地面苏丹干草,和38%的地面用随意访问水玉米。
2.2。控制细菌菌株
后菌株被用作控制验证文化、乳胶凝集,和/或PCR协议:(i) O157菌株EDL933(写明ATCC 43895:stx1+,stx2+,运算单元+,hlyA+)(美国类型文化收藏/写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州),(2)O26: U (NADC 3108: O26+,stx1+,stx2−,运算单元+,hlyA+)(国家动物疾病中心/ NADC,艾姆斯,IA), (iii) O45: U (NADC 3802: O45+,stx1+,stx2−,运算单元+,hlyA+),(iv) O103: U (NADC 3358: O103+,stx1+,stx2−,运算单元+,hlyA+),(v) O111: U (NADC 3309: O111+,stx1+,stx2- - - - - -,运算单元+,hlyA+),(vi) O121:段H19(写明ATCC BAA2221: O121+,stx1+,stx2+,运算单元+,hlyA+),(七)O121 (ATTC BAA2190: O121+,stx1−,stx2−,运算单元−,hlyA−)、(八)O145: U (NADC 3196: O145+,stx1−,stx2−,运算单元+,hlyA+)。
2.3。STEC隔离
2.3.1。O157文化
以前标准化nonenrichment和选择性富集培养协议被用来隔离O157用细微的修改(49- - - - - -51]。简单地说,根据协议,10 g粪便样本添加到50毫升Trypticase酱油汤(BD生物科学,圣何塞Ca)头孢克肟补充(50μ克/升;美国药典,华盛顿特区)、亚碲酸钾(2.5毫克/升;Sigma-Aldrich Corp .,圣路易斯,密苏里州),万古霉素(40毫克/升;阿尔法蛇丘,哈佛希尔,Ma) (TSB-CTV)和混合。用无菌盐水连续稀释的样本准备(0.15 M氯化钠)之前和之后都在一夜之间TSB-CTV-fecal悬挂的孵化与曝气37°C。镀前稀释准备孵化流传到山梨糖醇MacConkey包含4-methylumbelliferyl -琼脂(BD生物科学)β-d-glucuronide(100毫克/升;σ)(SMAC-MUG) (nonenrichment文化)。头孢克肟SMAC-MUG补充(50μ克/升),亚碲酸钾(2.5毫克/升),和万古霉素(40毫克/升)(SMAC-CTMV)是用于板稀释后准备过夜孵化(选择性培养文化)。SMAC-MUG和SMAC-CTMV盘子都读隔夜孵化后37°C,和殖民地,没有发酵山梨糖醇或利用4-methylumbelliferyl -β在紫外线下-d-glucuronide (nonfluorescent O157血清学进一步评估。
2.3.2。“六大”Non-O157文化
六大non-O157血清型、O26 O45, O103, O111, O121,和O145专门针对使用之前报道文化的组合方法(41,52- - - - - -55]。根据这些协议,5克的粪便被添加到50毫升大肠杆菌(EC)肉汤(σ)和混合。从每个EC系列稀释broth-fecal用无菌盐水悬架准备(0.15 M氯化钠)隔夜孵化后42°C与曝气。稀释是镀到CHROMagar STEC传播TM补充了一个10毫升/ L专有选择性混合提供的琼脂(CHROMagar微生物学、巴黎、法国)。STEC种形式mauve-colored CHROMagar STEC的殖民地TM(CHROMagar) [41,52,54]。因此,在37 post-overnight孵化oC, 15 - 20 mauve-colored和well-isolated殖民地分别镀上彩虹琼脂O157(生物测井,海沃德,Ca)。此外,荧光CHROMagar STEC的殖民地TM板观察紫外线照射下区分nonfluorescent,淡紫色O157荧光,淡紫色non-O157 STEC。一夜之间,彩虹琼脂O157盘子被孵化37°选择C和殖民地基于颜色的进一步血清学和/或PCR验证血清组如下:O157,黑色;O26、O113 O145, O121:段H19,紫色;O45,淡紫色;O103,灰色/灰色紫色;O111,灰色绿色(41,54,55]。
2.3.3。STEC血清学
乳胶凝集试验是用于血清学证实O157 (大肠杆菌O157乳胶,Oxoid诊断试剂,Oxoid有限公司,英国汉普郡)和“六大”non-O157 (大肠杆菌加拿大安大略省non-O157鉴定装备,Pro-Lab诊断)血清型。
2.4。血清组和毒力基因分析
2.4.1。殖民地溶解产物
菌落PCR(控制和粪便分离)都是选亚文化从选择性盘子上磅盘子和准备殖民地悬浮液用于无菌蒸馏水。悬浮液煮10分钟,冷却,离心机,溶解产物用作模板PCR反应。
2.4.2。粪便DNA提取
Postincubation 5毫升每个EC broth-fecal悬挂过滤是40μ过滤,滤液离心机(5000转/ 10分钟/ 4oC)收集200 - 250毫克的粪便。从粪便中提取DNA是使用标准的指令提供QIAmp DNA凳子工具包(试剂盒,日耳曼敦,MD)。Nanodrop DNA产量和纯度进行评估(生命技术公司,大岛,纽约)和4%的琼脂糖凝胶电泳验证了。
2.4.3。PCR条件
先前描述的引物(56- - - - - -58)被用来放大wzxnon-O157集群o抗原的血清型和基因毒性基因如表所示1。简并引物针对所有的变体stx和运算单元基因还包括(表1)[56,58]。PCR进行9700年GeneAmp PCR系统热循环(应用生物系统公司)使用10μ200年殖民地溶解产物l pmol每个引物,800年μM deoxynucleoside三磷酸腺苷,1 x稀释前Taq酶缓冲区,和2.5 U(豆类Taq DNA聚合酶。热启动PCR技术是降落PCR结合使用配置文件(59]由20周期从73°C的退火温度降落在53°C这些周期的结束。额外的10个周期放大段设置,使用最后的退火温度53°C。
2.5。维洛细胞细胞毒性试验
2.5.1。维洛细胞培养
维洛细胞(非洲绿猴肾细胞,写明ATCC ccl - 81),从写明ATCC获得,马纳萨斯,弗吉尼亚州是生长在杜尔贝科修改鹰的葡萄糖,较低的介质DMEM-LG(表达载体,卡尔斯巴德,CA)额外的10%胎牛血清。
2.5.2。粪便中提取制备
5毫升的EC broth-fecal悬挂过滤是40μ过滤,滤液离心机(1000 xg / 20分钟/ 4oC)收集debris-free上层清液/粪便提取物。
2.5.3。分析缺乏抗血清的细胞毒性
轻微的细胞毒性试验是如前所述进行修改(60]。维洛细胞被播种在105细胞/在24-well微量滴定板(合演,康宁,Ma)和孵化公司的5%2在37°C 24 h直到confluency达成。连续稀释(1:2比1:64)的粪便提取物在DMEM-LG准备,和100年μ每个稀释了的l /微量滴定板。盘子被孵化2天在37°C公司为5%2。细胞在显微镜下检测细胞毒性每天最后一个读第二天。细胞病变效应(可视化为分离,圆形细胞)数值得分1到4对应< 25%、50%、75%和> 90%的细胞的影响。控制井只有媒体包括在每一个测试板来验证,观察到的细胞病变效应与粪便中提取或纯化毒素。连续稀释(1:2比1:256)纯化志贺毒素(Stx-1 Stx-2;每50 ng / 100的浓度μl) NADC股票(NADC,艾姆斯,IA)维洛细胞分别进行测试,以验证过程。
2.5.4。细胞毒性抑制的Anti-Stx1或Anti-Stx2抗血清
如前所述执行毒素中和试验(61年)与轻微的修改是否观察到的CPE是由Stx1和/或Stx2或其他未定义的因素。简而言之,与维洛细胞微量滴定板和连续稀释粪便中提取的设置如上所述。然而,在这种情况下,100年μl与100年每个粪便提取物稀释混合μl多克隆牛anti-Stx1或兔子anti-Stx2抗血清(NADC股票)和孵化在37°C / 110 rpm之后,一夜之间潜伏在4°C没有颤抖。最后的稀释粪便提取物生产CPE在维洛细胞,在缺乏抗血清,选择中和试验。一个100μl样本每好每一个“稀释extract-antisera”混合添加的微量滴定板孵化和得分保护(细胞缺乏CPE)或没有保护(细胞继续显示CPE)。控制井只有媒体或粪便提取物稀释包括在每一个测试板来验证的中和效果extract-antisera混合,如果任何。此外,纯化志贺毒素(如上所述),稀释的1:256年在维洛细胞分别与抗血清混合和测试验证过程。
3所示。结果与讨论
运输到加工厂和禁食STEC粪便脱落增加殖民牛(26,62年,63年]。STEC上隐藏了采后(屠宰后)是最常见的尸体污染;如果STEC殖民的动物未被发现,这些食源性病原体可能容易扩散到包装工厂,食品加工厂,因此进入我们的食物供应64年]。为了防止这种农场到餐桌的传播病原体,USDA-FSIS建立危害分析关键控制点(HACCP)计划要求屠宰设施净化在关键的尸体处理点(65年]。然而,高效STEC控制牛可以提高HACCP计划的成功(64年,66年敏感,为此,需要技术来检测这些食源性病原体存在于变量浓度在收获前牛的粪便。考虑到一些已发表的研究(35- - - - - -40,42- - - - - -48,60,61年,67年),我们选择了选择性的结合文化,血清学,传统的菌落PCR,粪便直接PCR方法和细胞细胞毒性试验检测STEC 59牛的粪便样本,确定这些会产生类似的结果。
我们从粪便培养假定的non-O157 STEC 15/59(25%)的动物(表进行测试2)使用EC肉汤,CHROMagar STECTM,彩虹琼脂O157板(41,52- - - - - -55在这项研究中。利用两种不同的选择性琼脂媒体允许STEC的两极分化背景植物。第一步EC接种粪便样品浓缩的肉汤CHROMagar STECTM板允许荧光non-O157 STEC的识别。的选择,第二步荧光non-O157 STEC分别是亚文化彩虹琼脂O157板块,使进一步分化为初步血清组根据不同的殖民地色彩,可以很容易地选择血清学或PCR测试。这些non-O157 STEC被证实是“六大”血清型的血清学在10/15动物(补充图1;表2);血清型O103、O26 O121孤立从9日2和1牛的粪便样本,分别是O26和O121 coisolated与其他血清型(表2)。似乎non-O157 STEC的殖民地,基于CHROMagar STEC的表型TM和彩虹琼脂O157盘子,也独立于5/15的动物,但这些不能被分配到的“六大”non-O157 STEC基于血清学和菌落PCR (“NT”;表2)。有趣的是,O157不是孤立的从任何的动物测试,尽管使用敏感,选择性培养协议能够检测1 CFU O157/10g粪便(表2)[50,51,68年,69年]。这可能与报告的季节性变化在牛O157脱落,这些样本收集冬天当牲畜棚O157在非常低的数字39,70年]。
菌落PCR显示所有non-O157 STEC隔离着运算单元和hlyA基因(表2)。种O103和O26不匹配相应的控制株的毒力基因资料。O121隔离从动物# 6529匹配的一个控制O121菌株缺少四个毒力基因;然而,O121抗原基因不能从这个隔离放大,表明这个基因(表内可能的突变2)。考虑到引物成功放大相应的地区从控制菌株表明我们主要血清型孤立的变体。
使用从粪便中提取DNA PCR (fecal-DNA PCR)与血清组菌落PCR的结果对于大多数隔离和放大血清组抗原从额外的样品(表2)。血清型之间的匹配两个PCR方法从动物隔离5620,5657,5760,5825,5916,5935,5938,5982,和6017年;然而,结果动物6529(表不匹配2,补充图1)。O103-antigen基因也放大从12个额外的动物的粪便DNA样本包括5776,5787,5845,5868,5901,5915,5985,6069,6120,6171,6542,6582(表2)。因此,单靠粪便DNA PCR, 21/59(36%)的动物可以被视为non-O157 STEC阳性。在各种组合毒性基因也被放大,从所有粪便DNA提取(表2),这可能表明,100%的动物与non-O157 STEC殖民。然而,fecal-DNA PCR结果并不总是符合可行non-O157 STEC的隔离,因此可能反映了最近的殖民遗留遗传物质的存在或存在其他STEC除了七掺杂物血清型的目标我们的化验。因此,结果完全基于粪便DNA PCR需要解释在其他测试中,而不是独立。
毒力基因的大量观察使用fecal-DNA PCR在我们的研究中(表2,补充图1)。这可能是由于存在自由Stx-converting噬菌体或其他STEC DNA在缺乏可行的细菌(假阳性)之前报道(71年,72年]。毒性资料内血清型一直是高度可变的字段记录样本,随着时间的推移,和之间的位置(73年- - - - - -75年]。因此,我们观察到变化的毒性资料STEC隔离控制菌株相比不是小说。我们还观察到一个更高的发病率O103通过粪便DNA PCR比文化,分别为36%和15%;O26隔绝2动物样本和O121从1只动物样本文化(表2)。PCR和文化之间的这种差异在其他研究又可能暗示相对旧的殖民和持续感染可行的掺杂物STEC更容易污染环境,隐藏,因此在屠宰胴体(46,74年,76年]。
维洛细胞细胞毒性试验是用来评估功能的存在毒素在粪便样本(47、48)。纯化志贺毒素,用作控制,证明了细胞毒性在维洛细胞1:64稀释Stx1和1:256稀释Stx2,与相应的抗血清中和(补充图2从而验证测试。类似的细胞病变效应(CPE)观察动物粪便提取物58/59在维洛细胞细胞毒性实验,其中95%(55/58)与多克隆anti-Stx1中和和/或anti-Stx2抗血清(表2,补充图3)。这个Stx-related CPE可以与隔离STEC和/或毒素基因通过粪便DNA PCR扩增;其他STEC血清型没有目标在我们的研究中也可能导致Stx粪便提取物(表的存在2)。有趣的是,CPE粪便提取物引起动物# 6122是中和anti-Stx1和anti-Stx2抗血清在缺乏可行的STEC或放大Stx表明残余毒素基因从一个相对年长的感染目前没有可行的STEC或DNA(表的踪迹2)。相比之下,没有观察到CPE和动物粪便提取物# 5915,虽然stx2从表相同的样本(基因扩增2,补充图2),表示可能非功能基因。此外,粪便提取物non-Stx因素,如病毒,可能造成CPE观察与3/58粪便提取物(动物# 6044,# 6069,# 6148)没有与anti-Stx中和抗血清(补充图3)[77年,78年]。这些变化表明,维洛细胞细胞毒性实验需要验证通过中和步骤和相关文化/ PCR的结果。
STEC O103主要non-O157 STEC是孤立于奶牛评价这项研究(表2)。这种血清群已经成为常见non-O157 STEC从牛隔离在美国和全球37,39,44]。例如,三十小腿从一个封闭群被发现在加拿大港口于七大STEC的至少一个主要是O103 O157(70%)(75.8%)和(73年]。综合分析小腿粪便收集来自12个奶牛场在新西兰发现STEC O26血清组(33%)是最普遍,其次是O45 (25%)、O103(17%),和O121 (9%) (79年]。STEC O103也正在越来越多地与美国爆发;后venison-related O103爆发2010年,三个最近的跨州暴发与O103有关受污染的牛肉,地面野牛肉类,苜蓿芽后调查由美国疾病控制和预防中心和USDA-FSIS [80年- - - - - -83年]。这使得我们的临床流行病学观察相关。
4所示。结论
总之,non-O157 STEC隔绝25%(15/59)的动物测试使用EC肉汤、CHROMagar STECTM在这项研究中,彩虹琼脂O157。按顺序使用的两种不同的选择性琼脂媒体,在这项研究中,启用分化于STEC从背景植物和初步的基于殖民地颜色和荧光表型。血清学和/或菌落PCR随后被用来证实血清组的初步non-O157 STEC的“六大”STEC添加剂在10/15的动物。主要可行non-O157 STEC O103血清组孤立。使用从粪便中提取DNA PCR验证大多数殖民地PCR结果还发现额外的毒性和o抗原基因样本没有相关文化的结果。同样,Stx-related CPE与粪便提取物55/59维洛细胞动物只能与Stx相关基因获得的资料与粪便DNA PCR和没有文化的结果。文化差异与粪便DNA PCR和细胞毒性试验结果表明,后两个化验,虽然暗指STEC的存在,可能并不总是反映一个持续的,可行的感染7掺杂物STEC。因此,本研究验证粪便文化的结合方法需要清楚地隔离可行的“六大”non-O157 STEC构成食品安全威胁。文化与粪便PCR方法不能代替或细胞毒性检测单,最多可以作为主要屏幕识别可能港STEC样品。
数据可用性
没有数据被用来支持本研究的发现。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢博士自动跟踪萨默斯NMSU,获取饲养场牛、专家汉娜Mazon小姐提供的技术援助,实习生,农业部/ 1890国家学者计划,和艾丽卡Biernbaum小姐,ORISE研究生,i t·帕·博士的实验室。这项研究支持部分由新墨西哥农业实验台和美国农业部创新基金(# 692-0142-601)授予博士i t··库和USDA-ARS短剑项目(5030 - 32000 - 112 - 00 - d)。
补充材料
补充图1。代表殖民地(a)和(b)粪便DNA PCR结果显示5760年动物。PCR反应被在4%琼脂糖凝胶电泳分析,加载在车道1-13为100个基点的阶梯,O103, O111, O121, O145, O26, O45,运算单元,stx, stx1, stx2, hlyA,₂梯子。扩增子大小在bp,正如所料,所示。补充图2。维洛细胞细胞毒性试验。我只分析控制与媒体(a)和媒体和抗血清对维洛细胞(b)所示。二世,稀释Stx和稀释Stx anti-Stx血清中描述所示插入的传说。细胞病变效应Stx1 1: 64稀释(c)和Stx2 1: 256稀释(e)维洛细胞并保护维洛细胞抗血清的存在,anti-Stx1 (d)和anti-Stx2 (f)。三世,缺乏从5951年动物细胞病变效应与稀释粪便提取物显示(g, h)。所有图片都被在使用倒置显微镜放大10倍。 Supplementary Figure 3. Vero cell cytotoxicity assay with fecal extracts. Examples of various effects of fecal extracts on Vero cells are shown as described in the inserted legends. Images were captured at 10x magnification using an inverted microscope.(补充材料)