的协同抗菌和Antibiofilm活动MreB抑制剂盐酸A22结合传统抗生素铜绿假单胞菌和大肠杆菌临床分离株

文摘

在抗生素耐药性的时代,细菌细胞骨架蛋白MreB提出作为一个潜在的目标发展的新型抗菌素。结合临床抗生素治疗和anti-MreB化合物可能有前途的候选人在抵抗危机打击,而且在保留很多传统药物的效力。本研究旨在评价的协同抗菌和antibiofilm活动MreB抑制剂盐酸A22结合各种抗生素。最低抑制浓度(MIC)值的单个化合物肉汤采用微量测定法对66年临床分离株革兰氏阴性细菌。协同评估棋盘试验。部分抑制浓度指数计算为每个A22-antibiotic组合。杀菌活性的组合被time-kill曲线分析评估。antibiofilm活动的协同组合是由结晶紫染色剂,甲基thiazol四唑试验,和共焦激光扫描显微镜分析。合并后的细胞毒性和溶血活动对人类细胞也评估。根据我们的结果,铜绿假单胞菌和大肠杆菌不同程度的隔离是对传统抗生素产生抗药性。A22抑制细菌生长的剂量依赖性的方式用麦克风值介于2和64μ克/毫升。结合研究,合作发生最频繁和A22-ceftazidime A22-meropemen反对铜绿假单胞菌和A22-cefoxitin A22-azithromycin反对大肠杆菌。没有观察到的对抗。观察在time-kill研究中,合作与所有预期的组合。协同组合即使在最低检测浓度能够抑制生物膜的形成和消除在两株成熟生物膜。细胞毒性和溶血效果相同的组合对人体细胞没有观察到。本研究的结果支持先前的研究关于MreB作为新型抗生素的使用目标。获得的数据扩展现有知识的抗菌和antibiofilm活动A22抑制剂,他们表明A22可以作为主要化合物研究MreB抑制剂和抗生素之间的潜在的合作在未来。

1。介绍

抗生素耐药性危机已成为公共卫生面临的主要威胁之一根据世界卫生组织(世卫组织)(1]。全球耐多药耐药(MDR)革兰氏阴性细菌引起的感染呈上升趋势,负责死亡率和发病率高(2]。革兰氏阴性致病菌中,特拉(CR)铜绿假单胞菌和成员的肠杆菌科家庭,尤其是extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs)第和金属-β-内酰胺酶(MBLs)第大肠杆菌,与严重的医疗保健和社区获得性感染,主要发生在免疫抑制和其他脆弱的病人3- - - - - -6]。今天,越来越多的菌株已经被确认为抵抗基本上所有常用抗生素的耐药机制包括过度的射流泵、膜透性低,和目标的改变(7]。因为几类传统抗生素不能有效地治疗MDR引起的感染大肠杆菌和铜绿假单胞菌排名,世界卫生组织的发展新的疗法对这些病原体作为一个关键的优先级(8]。

除了多药耐药性的出现,这些病原体的能力在非生物和生物表面形成生物膜引起一个严重的问题关于慢性医院和医疗设备感染的化疗(9]。生物膜细胞据报道1000倍耐抗生素和宿主的防御系统比浮游细胞由于保护聚合物基体,限制药物渗透和防止病原体吞噬作用[10,11]。据报道,65%的微生物感染与生物膜发展(12]。

耐药病原体的出现和相关的传统药物失去疗效突出小说的发展需要抗生素替代目标(13),以及开发新的治疗策略针对生物膜的形成和根除(14]。组合抗生素疗法已被证明是有效的在过去,现在他们是主要治疗MDR细菌感染。因此,迫切需要进一步研究协同之间的相互作用和临床抗生素的新型抗菌素耐药性危机打击,但也保留的功效已经在临床使用的抗生素(15]。

近年来,细菌细胞骨架的组成部分提出作为潜在药物靶点16,17]。更具体地说,细菌肌动蛋白同系物MreB报告作为一个潜在的抗生素目标(16- - - - - -19),因为它是守恒的大多数杆状细菌在细胞生长调控的基本作用,细胞壁形态发生,细胞分裂,细胞极性,染色体隔离18,20.- - - - - -24]。据报道,杆状细菌与几个MreB基因的突变采用球形表型跟着消散,表明的重要性MreB蛋白质在细胞形状的决心和维护17,18]。此外,作为一个腺苷三磷酸酶MreB组织中起着关键作用的多酶复合体的必需品胞壁质合成(25)和调节在几个菌株活性复合物的本地化26]。因此,MreB的存在和功能对细菌的生存至关重要(18]。除了多功能角色,另一个特点,使细胞骨架蛋白的有前途的抗生素目标是真核类似物的结构和功能差异,允许特定细菌抑制剂的开发,减少毒性反应的可能性在哺乳动物细胞(17]。今天,MreB结构的三个组件被认为是可能的抗生素的目标,包括核苷酸和A22结合位点,必需品的ATP-dependant聚合(27,28],interprotofilament接口的蛋白质,这是重要的double-filament形成(29日]。因此,化合物可以干扰这些组件是有前途的抗生素。

天然和合成化合物针对原核细胞骨架一直介绍和作为研究工具来研究多功能细胞骨架蛋白。尽管这些抑制剂已报告有前途的候选人为发展新型抗菌素,批准治疗仍不可用(18]。几项研究已经完成到目前为止的抗菌活性天然或化学MreB抑制剂,包括大多数已知和研究S-benzylisothiourea衍生品(16- - - - - -18和也细菌毒素29日[],indole-based化合物30.),和小蛋白质监管者MreB大会(18,31日]。盐酸(S) - 3 4-dichlorobenzyl -isothiourea (A22盐酸,A22)(图1)是一种可逆MreB抑制剂的自制等人首次描述了诱导球形和无核细胞大肠杆菌(32]。多年,A22唯一已知anti-MreB化合物,主要用于基础研究的结构和功能研究MreB在几个菌株(17]。根据现有的知识,A22破坏细菌细胞的杆形状通过阻碍ATP-dependent聚合MreB [27),但药物的确切机制尚未清楚。通过瞄准MreB [33]A22阻碍重要亚细胞的过程包括细胞壁合成、细胞壁形态发生,细胞分裂,染色体隔离(18,20.,24]。其后,研究显示A22的抗菌活性与浮游细胞等病原体大肠杆菌和铜绿假单胞菌(34- - - - - -37),以及A22的抑制作用铜绿假单胞菌生物膜的形成(38),以最小的细胞毒性和基因毒性效应(37]。然而,据我们所知,没有研究已经报道的活动A22临床大肠杆菌生物膜及其功效根除成熟生物膜形成的临床分离株革兰氏阴性。此外,合并后的抗菌,antibiofilm,细胞毒性和溶血活性A22与传统抗菌素还没有研究到目前为止。

本研究的目的是调查在体外A22的抗菌活性,结合抗生素对多个非耐以及耐多药铜绿假单胞菌和大肠杆菌临床分离株。A22临床细菌生物被膜形成的综合效应和根除也检查了。此外,对人体细胞的细胞毒性和溶血的组合是为了检查评估协同或减少毒性作用的可能性。

2。材料和方法

2.1。菌株、文化传媒和抗菌药物

共有66名临床分离株组成的30铜绿假单胞菌和36大肠杆菌从AHEPA大学医院住院病人被纳入本研究。用VITEK细菌进行识别^®2自动化系统(bioMerieux、玛西我'Etoile、法国)。的标准菌株铜绿假单胞菌(NCIMB 12469)和大肠杆菌(NCIMB 8879)获得国家的工业、食品和海洋细菌(NCIMB、苏格兰、英国),作为质量控制的敏感性测试。细菌培养在Mueller-Hinton琼脂二世(尼古拉斯)和cation-adjusted Mueller-Hinton肉汤II (CAMHB) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),并保持在50%甘油−80°C。新鲜的亚文化从甘油股票在每个实验之前就做好了准备。从Sigma-Aldrich A22得到(产品编号SML0471-10 MG,圣路易斯,密苏里州,美国),在绝对乙醇稀释,储存在−20°C。阿米卡星(AMK)(静静S.A.) ampicillin-sulbactam (A / S)(海勒斯辉瑞S.A.),阿奇霉素(AZM)(静静S.A.)、头孢西丁(只)(Vianex S.A.)、头孢他啶(CAZ)(静静S.A.)、环丙沙星(CIP)(库珀S.A.)、粘菌素(CL)(海勒斯诺玛S.A.)、庆大霉素(创)(Sopharma广告),和meropenem (MERO) (Vianex S.A.)被用于这项研究作为传统的抗生素。股票的解决方案准备根据临床和实验室标准协会^®(CLSI)建议39)和存储在每个药物的最佳温度。

2.2。确定最低抑制浓度(MIC)

最低抑制浓度(麦克风)A22和抗生素是由汤采用方法根据CLSI指南(39]。选择适当的抗生素用于测试在每个按照CLSI标准菌株。总之,连续两个稀释(256 - 0.007μg / mL)的测试化合物CAMHB准备。传输的每个稀释50毫升的适当好96孔酶标(SPL生命科学有限公司、有限公司、韩国)。每个接种50μL细胞来源于一个对数生长期肉汤培养为了达到最终的浓度5×10⁵菌落(cfu) /毫升。盘子被孵化的37°C - h。麦克风被定义为最低浓度A22或抗生素导致没有可见的细菌生长。所有常规药物的敏感性断点被解释根据CLSI断点的建议(39]。从三个独立的实验中获得的MIC值。

2.3。棋盘试验

A22与传统抗生素的抗菌活性是由汤采用棋盘法与少量修改(如前所述40]。CAMHB短暂A22是双重的稀释(1/32-2×MIC)的列96微型板块,而抗生素的组合是稀释的行板(1/128-2×MIC)。每个好接种细菌悬液来实现最终的浓度5×10⁵cfu /毫升。孵化后37°C - h,麦克风中每个化合物的组合被确认为最低浓度完全抑制可见的细菌生长。基于获得的数据,部分抑制浓度指数(FICI)为每个组合根据下公式计算:FICI =麦克风仅A22结合/麦克风A22 +抗生素结合的麦克风/麦克风的抗生素。FICI结果解释为协同(FICI≤0.5),添加剂/冷漠(FICI = 0.5 4),和敌对(FICI°> 4°) (41]。FICI值评估在15大肠杆菌和15铜绿假单胞菌临床分离株。大部分的隔离或中间耐抗生素有耐药性的组合(表S1和S2)。提出了数据从三个独立实验获得的结果。

2.4。Time-Kill曲线分析

为了评估杀死A22动力学和调查如果协同产生致命的活动,time-kill曲线方法进行根据国家临床实验室标准委员会(NCCLS)指南42]。Time-kill分析只有在发现协同组合比例高于50%基于棋盘结果(A22和CAZ、MERO GEN,国际马铃薯中心铜绿假单胞菌;A22和排名,AZM大肠杆菌)对6个随机选择的临床分离株,包括三个菌株铜绿假单胞菌和大肠杆菌每一个。细菌在CAMHB亚文化到对数生长期和稀释5毫升CAMHB达到5×10的浓度⁵cfu /毫升。A22作为单药和抗生素添加或结合浓度,以便评估协同(基于每个应变的麦克风)。无毒增长控制包含在所有的测试。所有的样品都在37°C瓶孵化器孵化(150 r.p.m)。100年,在表示时间点μL(每个样本连续稀释在磷酸盐镀(PBS)和尼古拉斯板材菌落计数(cfu /毫升)。Time-kill曲线被绘制日志分析₁₀(cfu /毫升)和时间。1-log检测极限₁₀(cfu /毫升)。抑菌和杀菌活动被定义为< 3-log₁₀和≥3-log₁₀分别降低cfu /毫升,相对于最初的培养液。协同作用是定义在24小时≥₂₁₀降低cfu /毫升之间的组合和最有效的单一化合物(42]。结合被认为是协同杀菌时减少至少₂获得₁₀(cfu /毫升)与最活跃的代理和减少至少3-log₁₀(cfu /毫升)相对于最初的培养液在24小时。每个实验重复三次,每个试验是在重复执行。代表与复制克隆形成实验的结果决定。

2.5。抑制生物膜的形成

组合显示高(> 80%)会产生协同效应对浮游细胞被选为检查他们对三个强biofilm-forming antibiofilm疗效的临床分离株铜绿假单胞菌和大肠杆菌(A22和CAZ、MERO铜绿假单胞菌;A22 AZM,排名大肠杆菌)。生物膜的形成是由量化生物膜生物量(结晶紫测定CV)和可行的细胞内基质(MTT测定3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化)。短暂,一夜之间成长文化被稀释在CAMHB补充葡萄糖浓度达到10 2%⁷cfu /毫升和96年孵化静态的平底微型板块有或没有添加sub-MIC麦克风A22或/和选择抗生素(1/16-1×MIC) 24小时的37°C。量化生物膜生物量、浮游细菌被丢弃,井与PBS冲洗两次,风干了30分钟,沾0.1% (w / v)结晶紫溶液在室温下10分钟。多余的染色是丢弃,井用水洗了两次,风干1 h。结晶紫绑定到生物膜矩阵提取95% (v / v)乙醇,和吸光度测量570海里使用微型板块autoreader (BIO-TEK仪器,美国)。

的代谢活动可行的生物膜细胞MTT试验进行评估。孵化24小时后,与PBS不依从细菌冲洗两次,0.5毫克/毫升MTT试剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)添加到井3 h孵化后37°C在黑暗中允许甲瓒晶体的形成。孵化后,浮层的井被丢弃,晶体被添加可溶性二甲亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和吸光度决心在570海里。生物膜抑制和细胞生存能力的百分比表达与未经处理的控制(100%的生物膜的形成和100%的细胞生存能力)。每个试验进行了一式三份。

2.6。生物膜破坏Assay-Confocal激光扫描显微镜(样品形貌)

确定A22和抗生素对成熟生物膜的影响,MTT和样品形貌显微镜进行了研究。细菌细胞来源于mid-log阶段文化被接种CAMHB补充葡萄糖浓度达到10 2%⁸cfu /毫升。一百毫升的细胞转移到井96 -微型板块和孵化静态在37°C 24 h允许生物膜的形成。孵化后,上层的丢弃,井与PBS冲洗,和新鲜的培养基含有sub-MICs upper-MICs A22和/或选择的抗生素是轻轻倒没有扰乱细胞粘附和孵化24小时。可行的生物膜细胞的代谢活动MTT试验测定生物膜抑制试验中描述。

的弥散试验的生物膜接触A22和抗生素后,样品形貌成像。短暂,消毒都沉浸在CAMHB + 2%葡萄糖,接种10⁸35毫米cfu /毫升细菌细胞培养皿,在37°C和孵化静态24 h。孵化后,封面都用PBS和沉浸在新鲜培养基含有A22和选择的抗生素浓度基于麦克风和孵化24小时。生物膜在封面上都冲洗两次与PBS和吖啶橙沾0.1%解决方案在黑暗中1分钟。多余的染料被与PBS,被风干,装不变色的解决方案,和可视化在样品形貌(模型LSM780;卡尔蔡司AG)、德国慕尼黑)配备一个激发过滤器范围在10×515 - 560和放大。样品形貌图像使用ZEN2011软件进行了分析。

2.7。评价体外细胞毒性和溶血活动相结合

人类外周血单核细胞(PBMCs),多形核中性粒细胞(中性粒细胞)和红细胞(红血球)从健康的捐赠者外周血分离(n=3)。实验符合赫尔辛基宣言(7^th修订,2013)。所有捐助者给他们书面同意。

2.7.1。PBMCs和中性粒细胞隔离

PBMC细胞和中性粒细胞被Lymphosep隔绝整个肝素化的血液(淋巴细胞分离的媒体^CE;擤鼻涕、法国)密度梯度离心法在400×在室温下30分钟根据制造商的协议。离心后,单核带位于Lymphosep与血浆之间小心地转移到另一个离心管和清洗三次杜尔贝科的磷酸盐(DPBS;擤鼻涕、法国)离心10分钟300×在室温下。下的中性粒细胞和红细胞颗粒形成Lymphosep层也被转移到一个单独的管的红血球细胞溶解两次了ACK裂解缓冲NH(150毫米₄KHCO Cl, 10毫米₃,0.1毫米Na₂EDTA, pH值7.2 - -7.4)。剩下的中性粒细胞与DPBS洗了三次离心10分钟300×在室温下。第三个洗后,PBMCs和中性粒细胞resuspended 2 - 3毫升的rpmi - 1640年媒体(擤鼻涕、法国)补充10%胎牛血清(的边后卫;擤鼻涕、法国)。细胞被统计为0.4% (w / v)台盼蓝解决方案(美国密苏里州Sigma-Aldrich,圣·路易斯·)血细胞计数器。

2.7.2。细胞毒性评价

的细胞毒性活动A22、抗生素、及其组合对PBMC细胞和中性粒细胞是由标准MTT测定扩散与少量修改43]。简单地说,细胞被播种在96孔板(∼1×10⁵细胞/在100μL最终卷)和暴露于各种浓度的A22,抗菌化合物,及其混合物为24小时37°C和5%的公司_2。负(0%细胞生存能力)和正细胞生存能力(100%)控制与100年准备μL (rpmi - 1640中,100年完成μL细胞悬液没有添加药物,分别。在治疗后,10μL (MTT的解决方案(5毫克/毫升稀释DPBS)添加到每个在黑暗中孵化,4 h在37°C和5%的公司₂。孵化后,板块在1000×离心机10分钟,上层的丢弃,和100年μL的DMSO溶液添加到每个好溶解甲瓒晶体。最后,光密度(OD)为570 nm。细胞生存能力的比例是由下列公式计算:

实验至少重复三次,每次实验进行了一式三份。

2.7.3。溶血性试验

A22的溶血活性,抗生素,和他们的组合决定与一些修改(如前所述44]。简单地说,全血中收集K2EDTA BD真空采血管^®管(美国BD)与冷却DPBS稀释的比例1:3和离心机在700×8分钟和4°C。红细胞表面清洗三次相同的条件下与DPBS离心。红细胞表面沉淀稀释在DPBS获得0.5% (v / v)红细胞悬架,和一个100整除μ这个解决方案的L是添加到每个96 - 100微型板块已经包含μL(双重的连续稀释A22或/和抗生素达到200年每个的最后一卷μL和孵化1 h在37°C和5%的公司₂。负(0%溶血)和正(100%溶血)控制由混合100μ与100年L红细胞悬浮液μL DPBS或100μL Triton x - 100 10% (v / v),分别。孵化后,板块在1000×离心机10分钟,100年μL整除的上层清液被转移到清晰的微型板块,和OD测量在405海里。溶血的百分比计算由以下方程:

实验重复三次,每个试验进行了一式三份。

2.8。统计分析

所有化验进行至少三次,结果表示为意味着±标准差(SD)。确定统计上显著的差异,一个方差分析(方差分析)其次是图基执行的多个比较测试使用软件包GraphPad棱镜8.0.1 (GraphPad, Inc .)、美国)。的值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。抗菌药物敏感性试验

抗菌素耐药性的模式测试化合物的研究了隔离和麦克风范围如表所示1。根据获得的结果,铜绿假单胞菌和大肠杆菌不同程度的隔离选择抗生素有耐药性。耐药率最高的观察meropenem和ampicillin-sulbactam铜绿假单胞菌和大肠杆菌分别隔离。根据传统的抗生素的MIC值,最活跃的特工粘菌素了铜绿假单胞菌和meropenem大肠杆菌。A22了几乎相同的抑制活性铜绿假单胞菌和大肠杆菌菌株,MIC值介于2 - 64和4 - 64μ分别g / mL。在这两种菌株,麦克风A22是独立的分离株的耐药性资料(表S1和S2)。抗生素的MIC值与标准菌株在CLSI-approved范围内。

3.2。棋盘试验

棋盘化验的结果和计算FICIs组合的临床分离株铜绿假单胞菌(n=15)和大肠杆菌(n=15)在表中做了总结2。在这两种菌株,A22和抗生素组合显示不同程度的协同作用。FICI值≤0.5的边缘,协同效应主要是与A22 + CAZ A22 + MERO A22 +创,A22 + CIP组合铜绿假单胞菌(分别为87、80、73,53%)。有趣的是,对大肠杆菌隔离,结合A22排名和AZM施加强大的协同效应在几乎所有15个测试隔离(分别为100和93%的协同作用)。观察一个添加剂互动最频繁A22时结合AMK和CL铜绿假单胞菌MERO, AMK、CIP和A / S大肠杆菌。没有观察到任何对立组合测试。

3.3。Time-Kill动力学

根据time-kill曲线结果A22单一疗法显示剂量依赖性效应对死亡铜绿假单胞菌和大肠杆菌临床分离株。在这两种细菌,sub-MICs A22 (/ 2×MIC)引起的初始增长滞后或减少可行的细胞内9 h和再生发生不同程度的24 h(数字2(一个)和3(一个)、表3)。A22发挥杀菌活性铜绿假单胞菌在6 h和3 h 1×麦克风和2×麦克风,分别(图2(一个)、表3)。为大肠杆菌隔离A22显示在1×麦克风,抑菌活性和≥3-log₁₀杀死确定更高的浓度(2×麦克风)在24 h(图3(一个)、表3)。

结合time-kill研究,如图2 (b)- - - - - -2 (e)和3 (b)和3 (c),合作与所有预期的组合对临床分离株进行了研究铜绿假单胞菌和大肠杆菌。重要的协同交互A22与头孢他啶,meropenem,庆大霉素、环丙沙星组合被记录铜绿假单胞菌隔离。组合的A22 CAZ、MERO创,CIP 1/2×麦克风显示> 6-log₁₀菌落计数下降24 h后相比,最活跃的单剂( )(数据2 (b)- - - - - -2 (e)、表4)。特别是,上述组合活细胞数量的减少铜绿假单胞菌大约4-log₁₀24小时后与初始接种体相比,表明杀菌协同效应(数字2 (b)- - - - - -2 (e)、表4)。同样的,合作是中观察到大肠杆菌当A22结合头孢西丁和阿奇霉素1×麦克风(数字3 (b)和3 (c))。如表所示4,上面的协同组合> 4-log施加致命的活动₁₀减少可行的细胞与初始培养液在24 h。

3.4。抑制生物膜的形成

A22和抗生素的抑制影响生物膜形成图所示4。A22抑制每个三个强biofilm-forming临床分离株的生物膜的形成铜绿假单胞菌和大肠杆菌在24小时浓度的方式。1/4×麦克风A22导致大约50%抑制两菌株生物量的形成。抗生素的研究显示,一个贫穷antibiofilm活动只有在更高浓度能够抑制生物膜生物量的形成(数字4(一)和4 (b))。因为它是预期,铜绿假单胞菌使用隔离,当A22 CAZ和MERO sub-MIC组合,生物膜生物量减少80%甚至最低浓度的组合(1/16×MIC),显示显著增强antibiofilm活动( )(图4(一))。同样,在大肠杆菌隔离,显著减少生物膜生物量的组合中可观察到A22 AZM和它相比,最活跃的代理( )(图4 (b))。MTT检测结果证实了结晶紫(数字4 (c)和4 (d))。新陈代谢活跃biofilm-producing细胞测定在1/2×30%麦克风A22菌株。MERO A22组合,CAZ和排名,AZM反对铜绿假单胞菌和大肠杆菌分别显示显著减少可行的细胞相比,最活跃的化合物的组合( )。

3.5。生物膜Eradication-CLSM分析

的发射疗效A22 MTT比色和抗生素对预制生物膜试验,通过样品形貌显微镜(数字5和6)。如图5A22麦克风导致减少大约80%的可行的细胞暴露在24小时后铜绿假单胞菌和大肠杆菌成熟的生物膜。传统的抗生素头孢西丁除外,即使在最高的测试浓度(2×麦克风),表现出可怜的杀菌活性,导致大约减少50%的可行的细胞。然而,协同组合在所有情况下浓度和测试报告(数据更活跃5(一个)和5 (b))。此外,组合是非常有效的生物的破坏的生物膜。样品形貌图像表示主要的生物膜生物量减少,一个伟大的中断成熟的生物膜结构(图6)。

3.6。结合细胞毒性的活动

细胞毒性的协同组合,MTT测试进行人类PBMC细胞和中性粒细胞。预计,抗生素是对PBMC和中性粒细胞细胞无毒浓度高达64μ克/毫升。A22引起显著降低细胞生存能力 )只有在测试浓度越高(32 - 64μg / mL)(图7)。A22结合在某些浓度选择抗生素,已被确定为抗菌和antibiofilm协同研究。没有观察到的细胞毒性效应的增强的组合(图7)。

3.7。结合溶血性活动

A22单独的影响,结合红细胞表面抗生素对人类进行了研究。如表所示5,A22引起溶血的能力是不存在的或无关紧要的(< 1.5%)甚至在最大测试浓度(256μg / mL)。同样,测试抗生素在nonhemolytic浓度高达256μ克/毫升。任何情况下增强的溶血性活动发现关于联合治疗。

4所示。讨论

近年来,细菌细胞骨架蛋白MreB已经成为一个潜在的药物目标战役战斗中抗生素耐药性和开发新型抗菌药物。在MreB抑制剂A22报道作为先导化合物具有强抗菌和antibiofilm活动(18),但其与其他抗菌素联合活动没有特点。基于承诺背景和这种药物的理想的性质,我们的研究致力于研究A22之间潜在的协同作用和临床使用抗生素对浮游和生物膜形式的MDR革兰氏阴性细菌,考虑他们的溶血性和细胞毒性的活动。

的抗菌效果A22决心反对66年临床分离株革兰氏阴性细菌。A22了几乎相同的麦克风与范围铜绿假单胞菌和大肠杆菌临床分离株,与先前的研究结果具有可比性,A22能成功地抑制等病原体的生长铜绿假单胞菌和大肠杆菌压力(32,34- - - - - -37,45- - - - - -47]。我们发现的77.4%和67.5%铜绿假单胞菌和大肠杆菌分离,分别获得MIC值≤16μ克/毫升(表S1和S2)。这些发现证实了先前的报道,A22提出更高的MIC值大肠杆菌隔离与其他菌株37,48]。

在这两个铜绿假单胞菌和大肠杆菌菌株,A22的麦克风是独立隔离的概要传统抗生素的耐药性。铜绿假单胞菌显示高耐碳青霉烯的比例(81%)、cephems(42%)、氨基甙类抗生素(48%)和氟喹诺酮类原料药(65%)。同样,大多数的大肠杆菌隔离表现出高水平的抗beta-lactam抗菌素(95%),包括cephems、大环内酯类(89%)和氟喹诺酮类原料药(79%),同时保持不定地容易meropenem(35%)和阿米卡星(35%)。在我们的研究中,几个报告证明了CR铜绿假单胞菌是孤立的从比CR患者更常见吗大肠杆菌(49,50]。按照CLSI断点、粘菌素和meropenem最活跃的代理铜绿假单胞菌和大肠杆菌分别隔离。许多报道表明粘菌素仍然是最活跃和打捞剂治疗严重感染引起的CR铜绿假单胞菌(4]。然而,其安全性受到高水平的肾毒性(51]。有趣的是,很多大肠杆菌和铜绿假单胞菌隔离和低电阻剖面对传统抗生素的MIC值等于或高于A22与耐药的。进一步的实验涉及更多的菌株显然需要更好的调查和总结A22任何麦克风之间的相关性和抗生素耐药性临床分离的模式。

结合抗生素治疗是一个有吸引力的治疗方法治疗MDR-caused感染(52]。联合治疗通常需要单个化合物的低剂量,导致协同效应发展风险较低的阻力。许多报道证实抗生素组合的有效性对MDR革兰氏阴性细菌(53]。因为没有记录在报告A22与传统药物的相互作用对临床分离株革兰氏阴性,我们研究了几种组合对浮游细胞广泛应用棋盘法。有趣的是,我们发现A22表现出巨大的协同growth-inhibitory效应与各种抗生素和没有观察到任何对立的组合。我们的结果符合的一项研究中,协同效应的A22-related benzylisothiourea导数名叫“C2”与各种抗生素铜绿假单胞菌浮游细胞已经被观察到。作者得出结论,C2增强传统抗生素的抗菌活性,但是FICI值的组合没有评估35]。

在我们的研究中,strain-dependent协同的效果,主要是看到A22-ceftazidime和A22-meropemen反对铜绿假单胞菌和A22-cefoxitin A22-azithromycin反对大肠杆菌,尽管大多数隔离对抗生素耐药的组合。几个组合在体外棋盘设计的方法研究了协同交互对MDR病原体即使细菌抵抗个体抗菌素(54]。的确切机制A22与MreB不是特征但重要的详细模式来解释观察到的合作行动。A22首先介绍了作为ATP-competitor MreB的核苷酸结合位点结合,抑制蛋白质的ATP-dependant聚合(33]。之后,报告基于结构和动态模拟提出A22结合MreB A22-binding口袋,这是附近核苷酸结合位点,阻碍ATP水解(28]。根据最近的研究,A22破坏细菌细胞的杆形状ATP-dependent聚合的阻碍MreB以多种方式(27]。特拉等人报道,MreB蛋白质组织细菌细胞膜和对于膜蛋白的分布是很重要的55]。因此,通过针对MreB A22阻碍膜相关流程包括细胞膜组织细胞壁合成和细胞壁形态发生。A22之间观察到的合作和抗生素可能是因为A22细胞壁的破坏,导致膜透性增强,促进和提高抗生素的访问他们的细胞内的目标。因此,进一步的调查A22之间的分子间相互作用和抗生素来解释这些协同效应至关重要。

尽管麦克风和FICI决定的标准方法是研究抗菌和协同活动的单一或组合代理,分别这些技术只提供证据的growth-inhibitory效果测试抗生素(4]。从造成影响(growth-inhibitory影响不同。56),它是可行的进一步研究如果协同交互发挥抑菌或致命的活动time-kill曲线分析(57]。在单一疗法治疗,sub-MICs A22抑制细菌生长在短期时间内,当浓度较高抑菌(大肠杆菌)或杀菌(铜绿假单胞菌)。最高的测试浓度(2×麦克风)施加杀菌活动3 h和24小时内铜绿假单胞菌和大肠杆菌,分别。A22已经报道,类似于我们的研究呈现剂量依赖性对杀菌活动铜绿假单胞菌PAO1标准菌株(37]。预计,组合time-kill化验的结果表现出极大的协同杀菌与所有预期的互动组合综合治疗的24小时。

Biofilm-related MDR革兰氏阴性细菌引起的感染已成为一个主要的临床问题。细菌细胞在生物膜的社区是高度耐抗菌素和宿主免疫反应,因此难以消除。因此,迫切需要开发新型抗菌素和强有力的antibiofilm活动,表演与常规药物协同作用,针对生物膜的形成和破坏(9,11]。生物量测定的结果在目前研究表明减少生物膜的生产铜绿假单胞菌和大肠杆菌隔离sub-MIC A22处理时,导致较低的可行的细胞内基质比例比未经处理的控制。我们的发现与先前的一项研究中,报告A22的抑制作用铜绿假单胞菌生物膜的形成(38]。A22抑制生物膜形成的能力可能是基于球面表型细胞后获得治疗。细胞形状一直扮演一个残酷的角色在粘附和生物膜的发展。杆状细菌有殖民的表面增强的能力而spherical-shaped细胞通过最大化与下层接触面积(58]。

先前的研究表明A22作为强有力的antibiofilm剂通常专注于其功效防止初始细胞粘附和生物膜的形成。然而,A22走向成熟的生物膜的清除活动没有很透彻了。第一次我们的结果显示,根除A22预先形成生物膜的影响铜绿假单胞菌和大肠杆菌临床分离株。A22只有麦克风两菌株能够减少80%的细胞生存能力成熟的生物膜。大多数的传统药物显示sub-MICs可怜的生物膜抑制和发射效果。在组合研究,样品形貌分析表明大生物量减少combination-treated生物膜比未经处理的控制。放松的体系结构和预制生物膜的生物破坏A22可能增强的传统药物在矩阵的条目,导致协同antibiofilm效果。

A22对预制的传播功效生物膜可能是由几种机制控制。生物膜的形成、严重程度和稳定性取决于许多因素,包括细胞形态、细胞死亡,细胞粘附,群体感应(QS)介导的细胞活性14]。生物膜的破坏由A22可能是因为生物膜细胞的形态学变化后的治疗。能够很好的证明,交替在细胞形状由抗生素引起导致主要生物膜破坏效应(59]。在生物膜生长周期的最后一步,许多生物膜细胞脱离细胞外基质恢复浮游的生命形式,开拓新的领域60]。我们发现A22发挥杀菌活动24小时铜绿假单胞菌和大肠杆菌浮游细胞,而发射的功效A22测量在成熟的生物膜后24小时的治疗。这样A22可能作为一个贡献者本机色散造成的细胞生物膜的分离,导致整体生物膜损失和防止进一步的殖民。另一种解释可以给出基于A22 QS-dependant运动性复合物上的影响。QS-dependant群集和游泳运动的细菌中扮演一个重要的角色在细胞附着,生物膜发展,分散(14]。据报道,细菌细胞骨架蛋白,特别是MreB,发挥着基础性的作用在细胞通讯通过调节QS信号(61年]。值得注意的是,先前的研究表明,A22可以抑制游泳和群集的能动性铜绿假单胞菌PAO1和Myxococcus克桑托斯(26,38]。

本研究的目的是探讨协同互动A22和抗生素,这些组合的细胞毒性和溶血测试。Bonez et al。(2016)报道低细胞毒性、基因毒性活性A22单一疗法对人类PBMC细胞(37]。然而,没有报道溶血的影响。在我们的研究中,我们没有观察到任何溶血性A22活动所需的浓度杀死或抑制细菌细胞和生物膜,分别。PMBC减少> 50%,观察中性粒细胞生存能力只有64的浓度μ克/毫升(这是最高麦克风对细菌)。我们检查了溶血性和细胞毒性的属性组合发现大多数协同对抗细菌。高合作表明低FICI值,这意味着单个化合物的中等收入国家要低得多比单一疗法相结合。协同组合,麦克风A22减少的价值至少4倍noncytotoxic的浓度(< 32μg / mL)。值得注意的是当A22结合抗生素浓度,已经被确认为抗菌和antibiofilm协同,没有细胞毒性和溶血作用的增强。总的来说,抗菌、antibiofilm和细胞毒性研究表明,组合合作允许单个药物的剂量减少,因此不能增加细胞毒性。

本研究得出的结论是,A22展品协同抗菌和antibiofilm属性较低的细胞毒性和溶血的影响。我们的数据证实A22对临床分离株的抗菌活性铜绿假单胞菌和扩大我们的知识与临床的活动大肠杆菌菌株。目前的研究也提供了新的见解的潜力MreB作为小说的目标疗法旨在预防和破坏生物膜的形成。我们所知,这是第一个研究报告协同,noncytotoxic,和nonhemolytic交互的MreB抑制剂与各种抗生素,抗菌和antibiofilm活动对临床分离株革兰氏阴性。这些发现提供了新的证据,MreB可能需要一个地方作为新型抗生素目标不仅为单身,还结合抗菌药物治疗,建议A22化合物具有理想的特性来研究这些交互。进一步在体外和在活的有机体内研究需要的安全性和有效性A22和其他MreB抑制剂结合抗生素为了介绍他们作为潜在的治疗选择结合抗菌化疗在未来。

5。结论

本研究的结果支持先前的研究关于MreB作为新型抗生素的使用目标单一或联合抗菌化疗在未来。扩大现有知识的获得数据MreB抑制剂盐酸A22通过评估化合物的抗菌和antibiofilm活动与各种传统抗生素对MDR临床分离株,以及合并后的细胞毒性和溶血对人类细胞的活动。抗菌化验的结果强烈表明A22增强大部分常规药物的功效与浮游细胞,产生协同效应。Antibiofilm化验显示伟大的A22之间合作和CAZ, MERO,排名,AZM;因此所有的测试组合能够抑制生物膜的形成在低浓度和根除成熟生物膜形成的临床病原体。A22结合为一个单一的代理或显示最小的细胞毒性对人类活动PBMC细胞和中性粒细胞,和选择性向人类红细胞溶血性属性。总的来说,这些发现加强认为MreB蛋白可能作为发展的目标并指出A22作为一个有前途的化合物的新型抗菌素产生新的类似物作用与临床抗生素的协同作用。还需要进一步的研究来探讨分子A22和常规药物之间的相互作用和解释观察到的合作。此外,进一步在体外和在活的有机体内实验是必要的,以确保疗效A22和选择特定anti-MreB与理想的属性和最小的细胞毒性化合物的进一步发展。

缩写

A / S:	Ampicillin-sulbactam
A22:	A22盐酸盐
AMK:	阿米卡星
AZM:	阿奇霉素
CAMHB:	Cation-adjusted Mueller-Hinton肉汤
CAZ:	头孢他啶
菌落:	菌落
排名:	头孢西丁
国际马铃薯中心:	环丙沙星
肤色线:	粘菌素
CLSI:	临床和实验室标准协会
样品形貌:	共焦激光扫描显微镜
克雷格:	特拉
简历:	结晶紫
DMSO溶液:	二甲亚砜
DPBS:	杜尔贝科的磷酸盐
大肠杆菌:	大肠杆菌
ESBLs:	Extended-spectrum beta-lactamases
的边后卫:	胎牛血清
FICI:	部分抑制浓度指数
创:	庆大霉素
MBLs:	金属-β-内酰胺酶
耐多药:	耐药
MERO:	Meropenem
尼古拉斯:	Mueller-Hinton琼脂
麦克风:	最低抑制浓度
麦克风:	最低抑制浓度
麻省理工:	(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子
NCCLS:	国家临床实验室标准委员会
OD:	光密度
铜绿假单胞菌:	铜绿假单胞菌
PBMCs:	外周血单核细胞
PBS:	磷酸盐
中性粒细胞:	多形核中性粒细胞
q:	群体感应
红细胞表面:	红细胞
SD:	标准偏差
人:	世界卫生组织。

数据可用性

的数据支持当前研究的结果可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究受到了希腊和欧盟通过操作程序(欧洲社会Fund-ESF)人力资源开发、教育和终身学习(2014 - 2020)在项目的上下文通过博士学位Research-1加强人力资源研究潜力^圣周期(MIS 5000432),实现由国家奖学金基金会(犹太人)。

补充材料

补充表S1。麦克风A22和抗生素耐药性模式的值铜绿假单胞菌隔离。补充表S2。麦克风A22和抗生素耐药性模式的值大肠杆菌隔离。(补充材料)

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