突变结核分枝杆菌与药敏试验在秘鲁结果不一致隔离

摘要

常规采用基因型或表型方法评估抗结核药物的耐药性;然而，我们可以看到这些不同的方法之间的不一致性。我们的目标是利用全基因组测序(WGS)，识别能够解释分子和表型方法对利福平和异烟肼敏感性评估不一致结果的突变。在MTBDR基因型中显示敏感结果的秘鲁菌株+选择异烟肼或利福平agar-斑块试验比例中的v2.0试验和耐药结果。通过重复这两种测试证实了不一致，并使用下一代测序方法进行了WGS。利用BWA程序和算法“mem”对获得的序列进行“参照”(基因组作图)，并将其作为参照基因组结核分枝杆菌H37Rv压力。14株利福平和21株异烟肼被证实存在不一致，其中1株两种抗生素共有，共有34株独特的菌株。利福平不协调菌株中rpoB基因最常见的突变为V170F。异烟肼不协调菌株中最常见的突变为katG R463L、kasA G269S和Rv1592c I322V。还报道了其他几个突变。这是在拉丁美洲针对利福平和异烟肼的基因型和表型方法结果不一致的菌株突变的第一个研究。这些突变可被视为未来基因型测试的潜在靶点，以评估对这些药物的敏感性。

1.介绍

秘鲁是世界上30个国家的耐多药结核病（MDR-TB）的负担最重的一个。公共卫生系统提供了与表型（在7H10比例）[游离诊断和药物敏感性测试1和分子方法(基因型，Hain Lifesciences (gene type™))[2用于第一代和第二线药物。药物抗性的分子诊断已显示显著减少诊断时间，最重要的是对异烟肼和利福平的抗结核方案的支柱，从而有助于改善临床结果[3然而，参考标准继续是表型的方法，如MGIT 960和比例在琼脂斑块，二者目前在秘鲁的分枝杆菌的国家参考实验室使用。

基因型的方法是基于在利福平抗性决定区（RRDR），该基因的81个碱基对的片段的rpoB基因的突变的突变的鉴定。在katG基因和基因的inhA突变被鉴定诊断异烟肼耐药。然而，这种分析识别最频繁的突变，但不是每一个可能的突变抗性这些药物。有可能是基因突变通过这些测试（“非典型的”突变）身份不明，因此测试将被报告为易感[4]。值得注意的是，如果使用表型方法，将检测到抗性模式。有报道假设新的突变来解释分子和表型方法之间的差异[五，6，因为这些可以解释不一致的结果。全基因组测序(WGS)是一项可以识别新的序列来解释与抗性相关的某些特征的技术，目前可以用于研究的基因组结核分枝杆菌显示这种不协调结果的菌株[7]。

然而，并不是所有的突变都能决定耐药性，因此考虑它们与耐药性之间的相关性的现有证据是很重要的。世界卫生组织已就其解释提出建议[8]。关于这一主题的知识在不断发展，对于这些新突变的存在产生更多的信息是非常重要的。我们的目的是通过全基因组测序，找出能够解释分子和表型方法对利福平和异烟肼敏感性评估不一致结果的突变。这些信息将有助于今后开发更全面的诊断设备，以评估我国的耐药性。

2.材料和方法

2.1。株

秘鲁国家卫生研究所国家分枝杆菌参考实验室自2011年开始使用基因型™对一线耐药性进行评估。对异烟肼、利福平等11种药物在Middlebrook 7H10琼脂中采用比例法进行表型耐药评价。然而，在2013年至2015年期间，进行了一项全国调查，同时采用两种方法对样本进行分析。我们选择了在那段时间收集到的两种方法结果不一致的菌株(在MTBDR基因型中敏感)+对异烟肼或利福平的v2.0试验和抗比例agar-斑块试验)。

2.2。实验室程序

结核分枝杆菌本实验室生物库保存在−80℃的菌株在Middelbrook 7H9肉汤中重新激活7天。然后将0.5 mL转移到Lowenstein-Jensen培养基中进一步生长。

根据Hofmann-Thiel等人的建议[9，我们重复了®MTBDR基因型+，海恩LifeScience公司，内仁，德国2.0版测试，并且另外在琼脂斑试验中的比例，以证实结果。基因型MTBDR+V2.0（http://www.hain-lifescience.com)按照制造商的指示进行。DNA提取采用GenoLyse v1.0试剂盒，基因型为MTBDR进行DNA扩增和杂交+2.0探针在突变的鉴定的rpoB，katG基因,韩国仁荷基因。

在琼脂斑试验的比例，将菌落从罗氏媒体的Middlebrook 7H9传送7天，随后的Middlebrook 7H10 21天。斑块包含在1.0的最低抑菌浓度利福平 μg/mL和异烟肼在2个最低抑制浓度:0.2μ和1.0克/毫升μ克/毫升。对于解释，如果临界比例大于1%，则认为该菌株具有抗性，如果小于1%，则认为合理[10，11]。只有重复试验后表现出持续不一致的菌株被纳入WGS分析。使用“GenJet基因组DNA纯化”(http://www.thermofisher.com）试剂盒，根据制造商的建议。然后，将双链DNA浓度进行定量，通过荧光，使用该量子位2.0荧光试剂盒（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA，USA）。Whole Genome Sequencing was performed using paired-end of 2 × 250 and 2 × 300 pb of the Nextera XT kit with the system NGS illumina MiSeq (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). The MiSeq Reagent Kit v3 (600 Cycles) was used as recommended (https://www.illumina.com)。

2.3。生物信息学分析

质量对照所获得的使用FastQC程序v0.11.8 [读取执行12]。reads纯度的估算和测序纯度的估算采用Kraken2 v2.0.7程序[13和Bracken v2.2 [14]。然后使用程序Trimmomatic v0.38清洗读取数据[15]。

所得序列经“参考”(基因组作图)比对，使用程序BWA [16]，用算法“MEM”，利用作为参考的株的基因组结核分枝杆菌H37Rv (GenBank, Access number: NC_000962.3)。使用Picard v2.18.25 (http://broadinstitute.github.io/picard)。

最后，我们报告的序列rpoA, rpoB，和rpoC基因与利福平结果不一致分离株和的序列katG基因和我NHA异烟肼结果不一致的分离株的基因。为了将突变归类为低、中、高产生耐药性的概率(并非所有突变都必然与耐药性相关)，我们遵循了世界卫生组织的建议[9]，并以其他出版物的资料加以补充。对于利福平耐药，我们报道的突变均符合Telenti等人提出的共识[17]，以及Andre等人的注释[18]。为了进行描述性统计分析，请使用以下方法。使用了15个。

3.结果

3.1。株

从2013年到2015年，我们能够确认不一致的结果(报道对MTBDR基因型的利福平或异烟肼敏感)+36株，利福平16株，异烟肼21株(两种药物有1株不一致)，对v2.0和米德布鲁克710琼脂中比例法对同一药物耐药，进行全基因组测序。表格1显示了相应患者的主要特征。值得注意的是，这大约占这段时期7194个有效结果的0.5%。

3.2。利福平

16个菌株在表型和基因型上对利福平的检测结果不一致。其中，我们能够恢复和执行WGS在14。所有的菌株都有错义突变的rpoB。最常见的突变是在6个样本中发现的V170F。数字1显示了基因中所有的突变的rpoB(可能是决定抵抗的因素)RPOA,rpoC（可能是补偿性突变）在这些14株。

3.3。异烟肼

21个菌株表型和基因型检测结果不一致。我们能够恢复和执行WGS在所有的。发现的基因突变非常不同katG,（数字2)是R463L最常见的错义突变，在3个样本中均有出现。我们没有发现以下突变katG基因吉恩:c。- 10A > C, P92S, A109T, K154T, P235S, T271A, G307V, S315T, S315N, P365P, T380I, R396L, D419, P432L, A478A, A551A, N660T, N660D, E709G，和G177S。数字3显示其他基因的所有突变(的inhA，的fabG1，oxyR，对 - AHPC，KASA，NDH，的furA，efpA，NAT，fbpC，Rv0340，iniB，INIA，Rv1592，Rv1772，SRMR，accD6，和fadE24)，这可能与异烟肼耐药性有关，最常见的突变是误义:卡萨G269S在3个菌株和Rv1592c9个样品中含有I322V。有趣的是，在菌株4和15中，我们没有发现除了同义字以外的突变，在菌株5中，我们没有发现任何突变。

4.讨论

这是在拉丁美洲进行的第一项研究，解决了在相当多的菌株群中出现的突变结核分枝杆菌在基因型测试中显示对最重要的一线抗结核药物(利福平和异烟肼)的敏感性，在表型测试中显示对相同药物的耐药性(不一致)，使用全基因组测序发现“不典型”突变。事实上，我们能够在这些不协调菌株中发现误义突变，这可以解释利福平(的rpoBV170F，I491F等）和异烟肼（katG基因R463L,kasA G269S, Rv1592c I322V， 和别的）。

这是一个相关发现，因为这些可能被认为是未来开发耐药性诊断设备的潜在靶点[19]。值得注意的是，一些突变，如R463L inkatG基因其他组织也发出了类似的信号，突显出它们可能具有带来阻力的重要性。[20]。其他人则报道首次本出版物中，其中一些可能是偶然发现的，不一定赋予抗结核药物的耐药性，而其他人可以通过进一步的研究来证实。虽然我们侧重于错义和帧移位突变，我们已经报道上游和同义突变为好，以提供所检测到的变化的完整的监督。所有这一切都将有助于提供有关的基因组变异结核分枝杆菌而且还可能有其他潜在的应用，比如在流行病学动态和耐药菌株传播的研究中。

我们必须承认一些可能会限制我们结果外部有效性的问题。首先，这些样本是在2013-2015年采集的，因此我们在考虑这些毒株是我国目前流行的毒株的代表之前必须谨慎。其次，我们必须考虑到，尽管在变异产生耐药性的问题上有一些接近共识的举措，但这是一个新领域，信息仍处于初步阶段。因此，我们不能确保我们报道的突变真的与耐药性有关。理想的方法，虽然资源消耗，将是在敏感生物体中产生这些突变，以评估它们是否真的变得耐药[21]。

5。结论

在结核分枝杆菌株显示表型和耐药性的评价利福平和异烟肼基因型诊断测试之间的结果不一致，我们能够通过报告WGS确定了几个突变。其中的一些，特别是的rpoBV170F和I491F用于利福平和katG基因R463L,卡萨未来可考虑对异烟肼使用G269S和Rv1592c I322V，用于开发诊断耐药性的局部基因型诊断试验。

数据可用性

用来支持这项研究的结果对全基因组测序的数据是可用的，请相应的作者。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者要感谢秘鲁分枝杆菌国家参考实验室的工作人员对该项目的支持。这项研究由INNOVATE PERU资助，合同编号为530。这项研究是在秘鲁国家卫生研究所进行的。

参考

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