国家参考实验室的分枝杆菌秘鲁国立卫生研究所的执行评估的一线耐药性基因型自2011年以来™。只有样品显示任何类型的电阻进行表型耐药与比例方法评价麦德7 h10琼脂11药物,其中包括异烟肼和利福平。然而,在2013年至2015年之间,执行一项全国性调查,样本分析与并行的两种方法。我们选择同期收集菌株显示两种方法之间的不和谐的结果(敏感基因型MTBDR +版本测试和耐药的比例对异烟肼和利福平agar-plaque测试)。

结核分枝杆菌菌株保存在−80°C的生物可以在这个实验室被激活在Middelbrook 7 h9肉汤了7天。0.5毫升的整除然后转移到Lowenstein-Jensen媒体进一步增长。

根据Hofmann-Thiel等的建议 9),我们重复的基因型®MTBDR +德国,海LifeScience, Nehren v2.0测试和另外的比例agar-plaque测试确认结果。基因型MTBDR +v2.0 ( http://www.hain-lifescience.com)被执行后,制造商´s迹象。GenoLyse v1.0工具包用于提取DNA, DNA扩增和使用基因型MTBDR进行杂交 +v2.0探针对突变的识别 rpoB, katG, 韩国仁荷基因。

比例在agar-plaque测试,殖民地从Lowenstein-Jensen媒体转移到麦德布鲁克7 h9 7天,随后麦德布鲁克7 h10 21天。斑块中利福平的最小抑制浓度为1.0 μ在2 g / mL和异烟肼最低抑制浓度:0.2 μ和1.0克/毫升 μ克/毫升。解释,如果关键的比例高于1%,压力被认为是抗,如果低于1%,这被认为是明智的 10, 11]。只有菌株显示坚持不调和后重复的测试包括WGS分析。从这些菌株基因组DNA提取使用“GenJet基因组DNA净化”( http://www.thermofisher.com)设备,根据制造商的建议。双链DNA的浓度是量化,通过荧光,用量子位2.0荧光计工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。全基因组测序进行使用paired-end 2×250和2×300 pb的Nextera XT装备与系统门店illumina公司MiSeq (illumina公司Inc .)、圣地亚哥、钙、美国)。MiSeq试剂盒v3(600次)被用来作为推荐( https://www.illumina.com)。

执行质量控制获得读取使用FastQC程序v0.11.8 [ 12]。纯洁的估计的读取和纯度的测序确定项目Kraken2 v2.0.7 [ 13和布莱肯v2.2 14]。使用程序读取被清洗Trimmomatic v0.38 [ 15]。

“通过引用”获得的序列是一致的(基因映射)使用程序BWA [ 16“mem”),算法,使用作为参考菌株的基因组 结核分枝杆菌H37Rv(基因库,访问人数:NC_000962.3)。识别重复的和最终的执行命令工具皮卡v2.18.25 ( http://broadinstitute.github.io/picard)。

最后,我们报告的序列 rpoA, rpoB, 和rpoC基因分离与利福平的序列不和谐的结果 katG和我 nhA异烟肼基因分离与不和谐的结果。为了分类突变为低,中位数,或高概率赋予耐药性(并不是所有的突变必然是与阻力),我们跟着世界卫生组织的建议 9)和补充信息中发现的其他出版物。利福平耐药性,我们报告突变都根据提出的共识Telenti et al。 17),以及安德烈等人的符号( 18]。描述性统计分析,占据版本。使用了15个。

从2013年到2015年,我们能够确认不和谐的结果(报告为敏感基因型MTBDR利福平、异烟肼 +v2.0和对同一药物的比例方法麦德710琼脂)36株,对利福平16和21对异烟肼(1样本不整合对药物)进行全基因组测序。表 1显示相应的患者的主要特征。值得注意,这占大约0.5%的7194个有效的结果。

16个菌株被发现不和谐的结果对利福平的表型和基因型的方法。这些,我们能够恢复并执行WGS 14。所有菌株都错义突变 rpoB。最常见的突变是V170F, 6个样品中找到。图 1显示所有基因突变出现在 rpoB(可能的确定电阻), rpoA, rpoC在这些14株(可能是补偿性突变)。

21株被发现不和谐的结果之间的异烟肼表型和基因型的方法。我们能够恢复并执行WGS他们所有人。基因突变的发现非常多样化 katG,(图 2)是最常见的错义突变R463L、现在在3样本。我们没有找到以下的突变 katG吉恩:c。10−> C,先驱,A109T K154T,生物化工,T271A, G307V, S315T, S315N, P365P, T380I, R396L, D419, P432L, A478A, A551A, N660T, N660D E709G, G177S。图 3显示所有突变出现在其他基因( 韩国仁荷、fabG1 oxyR、p-ahpC kasA, ndh, furA, efpA, nat, fbpC, Rv0340, iniB, iniA, Rv1592, Rv1772, srmR, accD6,和 fadE24),可能与异烟肼耐药性,最常见的被错义突变: kasAG269S 3株 Rv1592cI322V 9个样本。有趣的是,我们不能发现非同义突变菌株4和15日和应变5中,我们无法找到任何突变。