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Guesh Mulaw, Diriba Muleta, Anteneh Tesfaye, Tesfaye Sisay, "埃塞俄比亚发酵食品中潜在益生菌的保护作用沙门氏菌鼠伤寒菌DT104在小鼠中的作用",国际微生物学杂志, 卷。2020, 文章的ID7523629, 8 页面, 2020. https://doi.org/10.1155/2020/7523629
埃塞俄比亚发酵食品中潜在益生菌的保护作用沙门氏菌鼠伤寒菌DT104在小鼠中的作用
摘要
沙门氏菌是造成食源性疾病暴发、疾病和死亡的最有害病原体之一。本研究的目的是评估潜在的益生菌菌株对沙门氏菌鼠伤寒菌DT104。选择的潜在益生菌菌株之间的相容性试验(乳杆菌K132,乳酸杆菌帕拉沙霉菌K114和Lactococcus lactisE124),显示无拮抗作用。反沙门氏菌分离出的潜在益生菌在混合或单独培养的情况下共培养活性均表现出显著的抗氧化活性沙门氏菌生长抑制率为96.50 ~ 100%。其中组合的菌株表现出最高的生长抑制率沙门氏菌采用鼠伤寒菌DT104,检测其对小鼠定植的影响沙门氏菌沙门氏菌感染DT104。用混合益生菌预处理白化雄性小鼠7 d后感染白化雄性小鼠沙门氏菌鼠伤寒DT104口服1天。共3个处理,其中阴性对照组用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理;阳性对照组(typ)接受沙门氏菌沙门氏菌感染DT104孤单。治疗组(pro-typ)先用混合潜在益生菌培养液预处理,然后感染沙门氏菌沙门氏菌感染DT104。小鼠存活率和计数沙门氏菌在粪便中记录。灌胃给药后第21天小鼠的存活率沙门氏菌鼠伤寒DT104显著 实验前型组(100%生存率)高于阳性对照组(20%生存率)。菌落形成单位每毫升沙门氏菌在粪便中的含量显著降低 与典型组相比,前典型组。潜在的益生菌菌株的组合能够保护小鼠免受沙门氏菌结果表明,鼠伤寒DT104菌具有作为益生菌培养物生产功能性发酵产品的潜力。
1.介绍
食源性疾病(FBD)构成了严重的公共卫生问题,显着影响人们的幸福权,并导致严重的社会经济影响[1].主要的食源性细菌病原体是空肠弯曲杆菌,perfringens梭状芽胞杆菌,大肠杆菌,单核细胞增多性李斯特氏菌、沙门氏菌种虫害和金黄色葡萄球菌[2].这些病原体已经开发出多种耐药性,并在发展中国家和发达国家造成巨大的经济损失[3.].食源性疾病的问题是多因素的,其预防和控制需要多学科的方法[4].
在主要食源性病原体中,沙门氏菌血清是引致严重疾病的主要原因之一,这些疾病包括急性肠胃炎及伤寒等全身感染[5].口腔感染沙门氏菌鼠伤寒菌在老鼠身上引发的疾病类似于沙门氏菌人类感染的伤寒,有发热、肠炎和败血症,对宿主是致命的[6].然而,感染的性质和严重程度取决于许多因素,包括所涉及的血清、菌株的毒力、感染剂量、宿主的年龄和免疫状况。因此,据估计沙门氏菌该物种每年导致全球9380万肠胃炎感染,并导致15.5万人死亡[7].
目前,疫苗接种和抗生素用于预防和控制沙门氏菌感染。因此,抗生素的应用是常见的临床治疗沙门氏菌反过来,感染促进抗性的发展沙门氏菌抗菌素的种类[8].此外,长期使用抗生素会导致肠共计微生物的变化[9].由于多药抗性菌株的发生和目前可用疫苗的次优疗效,替代干预策略沙门氏菌迫切需要感染[10- - - - - -12].一种有希望的替代控制方法是可能有益地利用益生菌对抗各种病原体,包括沙门氏菌spp。13].
许多益生菌(活微生物)的消费与食品一起可以从根本上促进消费者的健康[14].益生菌保护肠道病原体感染的可能机制是抗菌物质的生产、对有限资源的竞争和抗粘附作用[15].大量的在活的有机体内和在体外研究评价益生菌在预防和治疗胃肠道感染中的作用沙门氏菌物种(16- - - - - -18].益生菌的有益作用是已知的属、种和菌株的特定[19- - - - - -21].目前,基于食物的益生菌被认为具有更大的意义,因为不同的食品可以含有天然和有益的益生菌,因此可以用于营养和治疗目的[22].
埃塞俄比亚发酵食品均以其独特的发酵风格闻名,可用作潜在有益的益生菌来源。Tesfaye等。[18揭示了乳酸菌纯培养和混合培养对发酵乳发酵和贮存过程中某些食源性病原菌的拮抗作用。关于埃塞俄比亚传统发酵食品中益生菌乳酸菌特性的研究数据还很少。埃塞俄比亚的传统发酵产品大多没有经过进一步的热处理,可以认为是携带益生菌进入人体胃肠道的理想载体。从传统发酵食品和饮料中分离的益生菌具有良好的功能特性,可作为抗食源性病原菌的益生菌。因此,本研究的主要目的是测试三个潜在的益生菌菌株从传统埃塞俄比亚发酵乳酸菌的效果因此和kocho产品对沙门氏菌沙门氏菌感染下在活的有机体内使用实验室动物的条件。
2.材料和方法
2.1.菌株和生长条件
本研究使用的菌株及分离来源见表1.从传统发酵过程中分离出潜在的益生菌kocho和因此产品。这些菌株被鉴定为乳杆菌K132,乳酸杆菌帕拉沙霉菌K114和Lactococcus lactisEarlham研究所(Norwich, UK)对E124进行全基因组测序(未发表数据)。所有菌株均为革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性,均能在MRS琼脂上生长。沙门氏菌鼠伤寒DT104是从埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴的埃塞俄比亚公共卫生研究所(EPHI)获得的(表)1).沙门氏菌鼠伤寒菌DT104在37℃木糖赖氨酸脱氧胆酸酯(XLD)琼脂中有氧生长24 hoC。
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E = ergo, K = kocho;埃塞俄比亚公共卫生研究所。 |
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2.2。益生菌菌株之间的相容性
如Pedersen和Tannock所述,通过交叉条带法检测选定的潜在益生菌菌株的相容性[23].将分离菌株在MRS琼脂平板上形成相互交叉的垂直划线。培养皿在37℃培养o使用厌氧罐进行48小时厌氧处理。融合区生长的类型(刺激、抑制或菌株之间没有相互作用)是通过视觉确定的[24].生长抑制晕的存在表明菌株之间的不亲和性。
2.3.Coculture化验
评估选定的潜在纯菌株(Lactococcus lactisE124,乳酸杆菌帕拉沙霉菌K114和乳杆菌K132)及其组合对生长的影响沙门氏菌用Potočnak等人所述使用液体共脉冲技术。[25经过一些修改。共培养前,选择菌株和沙门氏菌鼠伤寒菌DT104分别在de Man、Rogosa和Sharpe (MRS)肉汤和tryptic soy (TSB)肉汤中培养。因此,100年μL和混合菌株(共10株6CFU/mL)和鼠伤寒链球菌(104 CFU/mL) were inoculated into brain heart infusion (BHI) broth and incubated for 24 h at 37°C in aerobic conditions. The control was a monoculture of年代.沙门氏菌感染。的数量沙门氏菌在木糖赖氨酸去氧胆酸酯(XLD)固体培养基上用平板计数琼脂测定。实验进行了三次。抑制率按下式计算[26]:
因此,在表中介绍了用于共培养测定的纯和混合益生菌实验室培养物的制备2.
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E =因此;K = kocho。 |
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2.4.在活的有机体内混合益生菌菌株的拮抗作用沙门氏菌感染
2.4.1。实验小鼠
从亚的斯亚贝巴大学的微生物,细胞和分子生物学系的动物房屋获得了4〜六周的男性白化小鼠。小鼠被饲养在动物室的笼子里。这些小鼠提供标准饮食和水随意.每3天更换鼠窝,定期监测动物健康状况。
2.4.2。实验设计
共有30只雄性白化小鼠参与了这项研究。每笼5只小鼠随机分成3组。第1组为阴性对照组,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)治疗。第二组为单核细胞增多症沙门氏菌鼠伤寒DT104培养物(阳性对照,典型)。保护沙门氏菌在III族(Pro-Typ)中评价了通过施用混合益生菌培养物的Typhimurium dt104感染。汇集来自每组的粪便样本并检查缺席/存在的一周沙门氏菌。将5克粪便匀浆放入45毫升0.1%的无菌缓冲蛋白胨水中,并在225毫升胰豆汤中进一步富集25毫升。丰富的培养物在XLD板上划线。在确保没有沙门氏菌来自所有小鼠组,沙门氏菌Truusalu等人的研究表明,鼠伤寒菌DT104和各种LAB培养物在前一天剥夺小鼠饮水后给予小鼠。[27].
2.4.3。治疗的准备
在液体共培养试验中筛选出性能最佳的益生菌在活的有机体内使用老鼠模型进行测试。因此,在活的有机体内混合潜在益生菌菌株的益生菌效应评价(Lactococcus lactisE124,乳酸杆菌帕拉沙霉菌K114和乳杆菌K132)年代。鼠伤寒DT104是按照Chen等人的方法口服给小鼠接种的。28].实验进行了两次,取平均值进行分析。
益生菌培养物分别在37°C的MRS肉汤中培养过夜。为了制备混合培养物,通过连续稀释和平板计数,对每个培养物(10 ml)的过夜生长进行定量,得到log6cfuml−1通过混合每个菌株的相等体积来实现,并分为组合菌株的日间。在进料步骤之前,通过混合Log 6 CFuml制备混合培养物−1每一种潜在的益生菌菌株因此,混合的潜在益生菌菌株(乳杆菌K132,乳酸杆菌帕拉沙霉菌K114和Lactococcus lactisE124)被称为多菌株公式(MFA)。沙门氏菌鼠伤寒菌DT104在37°C、10ml胰豆汤中单独培养过夜。LAB培养物和培养物的过夜生长年代。鼠伤寒菌DT104分别用10 ml无菌0.1%缓冲蛋白胨水连续稀释,得到104CFUml−1.
实验分为3个阶段[29:初始阶段(第1至7天),感染阶段(第8天),最后阶段(第9至21天)。I组小鼠灌胃0.3 ml磷酸盐缓冲盐水,连续7 d。第二组小鼠接受单核细胞刺激沙门氏菌鼠伤寒DT104于第8天给予剂量(0.3 ml;日志CFU·4毫升−1(可存活的生物体)为一次口服剂量。保护沙门氏菌ⅲ组采用混合益生菌菌株进行鼠伤寒DT104感染评价。本组为混合LAB菌株(0.3 ml / d;6日志CFU·毫升−1),连续用药7 d,第8天口服沙门氏菌鼠伤寒DT104 (0.3 ml;4日志CFU·毫升−1(可存活的生物体)为一次口服剂量。小鼠的症状和死亡是注册的,并且在21中的颈椎脱位杀死了所有存活的动物圣的一天。每天记录存活百分比(活鼠数/小鼠总数),连续21天。
2.4.4。活细胞计数沙门氏菌鼠粪中鼠伤寒DT104的检测
无菌条件下,从第9天至第21天,每天用无菌钳收集新鲜排空的小鼠粪便。每组的粪便材料(5 g)在45 ml 0.1%缓冲蛋白胨水中湿润10分钟,然后使用Stomacher lab搅拌机(Stomacher 400, Seward, London, UK)均质。然后将各匀浆(0.1 ml)适当稀释于木糖赖氨酸去氧胆酸酯(XLD)琼脂上计数沙门氏菌沙门氏菌感染DT104。37℃孵育24小时,记录平板上菌落形成单位。当计数
3.数据分析
所有的实验都是重复进行的。结果以均数标准差(SD)表示。使用SAS软件R 9.1 (SAS Institute Japan, Tokyo)和Stat View Ver. 5 (SAS Institute, Cary, NC)进行统计分析。
4.结果
4.1.益生菌菌株之间的相容性
3所选潜在的益生菌菌株之间的相容性已经通过交叉划线菌株来确定(乳杆菌K132,乳酸杆菌帕拉沙霉菌K114和Lactococcus lactisE124)置于MRS琼脂平板上(表3.).虽然确认所选的益生菌菌株对测试病原体具有拮抗活性,但是3种选择的益生菌实验室菌株未显示出彼此的任何抑制卤素,表明在混合培养物中组合时菌株之间的拮抗作用(表格3.).一般情况下,交叉条纹试验显示了相似的结果,因为在固体培养基中,任何益生菌菌株组合的共生长位点都没有明显的竞争迹象(见表)3.).最后,在进行相容性试验后,将从传统发酵食品中分离的3株潜在益生菌进行共培养试验研究。
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E =因此;K = kocho。“−”表示对彼此没有抑制晕;“+”表示能够顺利地生存和工作。 |
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4.2.Coculture化验
所有纯乳酸菌和混合乳酸菌菌株在单独和/或组合形式下共同培养,以对抗测试的食源性病原体(沙门氏菌鼠伤寒菌DT104的生长抑制率达96%以上4).三种益生菌混合培养(mix 4)的抑菌活性最高,抑菌率为100%,其次为两种益生菌混合培养(mix 2、mix 3、mix 1),抑菌率分别为99.74%、99.72%、99.71%。然而,最低的( )在单独的纯培养条件下,生长抑制率达到96.50%乳杆菌对沙门氏菌沙门氏菌感染DT104(表4).
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E =因此;K = kocho。数据为三次重复的平均值±SD,列内后跟不同字母的值表示显著差异(
).
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4.3.在活的有机体内混合益生菌菌株对抗拮抗作用沙门氏菌感染
治疗组(pro-typ)的生存率为100%,而阳性对照组(仅受激)的生存率仅为20%年代。鼠伤寒DT104存活(图1).
显然,感染后的第一天沙门氏菌鼠伤寒DT104前型组和阳性对照组(typ)小鼠均开始出现疾病症状。最后观察毛发勃起和腹泻。然而,用混合益生菌菌株预处理的小鼠能够从疾病中恢复,但用混合益生菌菌株预处理的小鼠能够从疾病中恢复沙门氏菌单独使用DT104鼠伤寒菌(阳性对照组)发病,最终死亡。因此,在阳性对照组(ⅱ组)中,第3天和第5天出现首次死亡率(30%),死亡率上升至50%。当检测时间超过5天时,阳性对照的死亡率呈上升趋势。最后,在第21天结束时记录小鼠死亡率(80%)。然而,仅用PBS治疗的阴性对照组I无死亡率(图)1).
4.4。活细胞计数沙门氏菌鼠粪中鼠伤寒DT104的检测
阴性对照组(PBS)小鼠无存活沙门氏菌检测鼠伤寒菌DT104计数5).与第二组的结果相比,沙门氏菌在7天的时间里,喂食混合益生菌菌株的小鼠减少了沙门氏菌从第9天至第21天测定粪便中的细胞( ;表格5).结果表明,CFU计数沙门氏菌小鼠给予混合益生菌株鼠伤寒菌DT104后,鼠伤寒菌DT104浓度低于阳性对照组(见表1)5).这说明肠道中联合益生菌LAB的存在能够抑制病原菌的生长。另一方面,在联合益生菌LAB菌株喂养的小鼠粪便中,粪便CFU计数沙门氏菌鼠伤寒DT104细胞由2.30 log CFU·ml显著降低至0.00 log CFU·ml−1.然而,从第18天开始观察到联合潜在益生菌LAB菌株治疗的显著效果(表1)5).
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PBS = PBS =磷酸盐缓冲盐水;pro + typ =混合益生菌培养物和沙门氏菌;typ = mono沙门氏菌沙门氏菌感染DT104。数据为三次重复的平均值±SD,列内不同字母后面的值表示显著差异(
).
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一般来说,计数沙门氏菌在感染后的整个实验过程中,阳性对照组小鼠粪便中的鼠伤寒菌DT104 (typ)始终高于益生菌组小鼠粪便中的鼠伤寒菌DT104(表1)5).因此,当选择的潜在益生菌LAB菌株以log 6 CFUml剂量给药时−1等级,沙门氏菌益生菌处理组小鼠第20天及以后粪便中清除鼠伤寒菌DT104。因此,与I组的结果相比,混合益生菌处理的小鼠在第20天和第21天没有观察到差异,因为在这两组中都没有检测病原体的活细胞计数5).但只有挑战的小鼠粪便中的复苏数量沙门氏菌第20天为4.53 log CFU·ml−1.
5.讨论
交叉条带平板法检测结果表明,筛选出的益生菌具有亲缘性。在评估潜在的多菌益生菌培养物时,必须进行相容性试验,以避免相互拮抗作用的菌株组合。目前的结果与Sáez等人得到的结果一致[24,他们报道,所选的LAB无细胞上清液对其他菌株没有抑制晕,表明在混合培养形式下,没有相互抑制其发展的抗菌物质。同样,Mohamed等人[30.]的研究结果表明,所选的5种益生菌相互之间并没有显示出任何抑制作用,有望在有益宿主的情况下互不干扰在活的有机体内条件。
益生菌已成功用于预防和治疗人类和动物的各种胃肠道疾病[31].发酵食品中益生菌菌株的有益作用被认为对人类健康有营养和治疗作用[22].几个在活的有机体内和在体外研究表明益生菌可以抑制沙门氏菌相关的腹泻(16- - - - - -18].在本研究中,这些潜在的益生菌LAB菌株(Lactococcus lactisE124,乳杆菌K132,乳酸杆菌帕拉沙霉菌K114及其组合)均表现出较好的抑制活性沙门氏菌鼠伤寒菌DT104主要在共培养实验中发现4).
三种潜在益生菌菌株及其组合均能显著抑制菌体的生长沙门氏菌沙门氏菌感染DT104下在体外共培养试验条件。抑制率最高(100%; )三种益生菌菌株以混合4 (乳球菌,植物乳杆菌,乳酸菌paracasei).与这项研究一致,Adetoye等人[32揭示了唾液乳杆菌C86和乳酸菌amylovorus从牛粪中提取的C94菌株能抑制黄牛的生长沙门氏菌共孵育8 - 16小时,不能恢复沙门氏菌在生长培养基中。不同的作者也报道了强烈的抑制沙门氏菌SPP。通过潜在的益生菌实验室菌株在共培养测定中[16,33,34].与此一致,Potočnjak等人[25]报告了所有的测试结果乳杆菌菌株(A、B、S1)能抑制 )的增长沙门氏菌共培养试验中所有时间点(6、12和24小时)的鼠伤寒菌。同一作者报道,共培养24 h后沙门氏菌细胞减少了1000倍沙门氏菌菌株A、B和S1共孵育12 h抑制率最高,分别为97、98和94%。
在本研究中,给模型小鼠口服乳酸菌可完全抑制试验病原体,特别是联合使用时。口服潜在乳酸菌菌株对维持和改善宿主健康有有益作用[35].大多数益生菌研究都使用活菌菌株,而使用热杀灭益生菌的研究报道很少[36].几项研究[16,35,37]表明益生菌实验室菌株对此具有保护作用沙门氏菌感染可能与多种机制有关。因此,活益生菌乳酸菌的抑制保护机制包括益生菌产生的抗菌化合物,可直接杀死胃肠道中的肠道病原体[38],通过增加分泌IgA的产生来消除肠道病原体,从而增强宿主的肠道免疫力[39]以及通过与病原体在上皮细胞上使用的受体(如甘露糖和糖蛋白)结合而产生的竞争抑制[40].
小鼠的死亡率沙门氏菌通过用混合益生菌实验室菌株进行预处理,防止Typhimurium DT104(乳球菌,植物乳杆菌和乳酸菌paracasei)。与目前的研究一致,Moura等人[41的研究报告,小鼠的存活率补充嗜酸乳杆菌UFV-H2B20,然后感染沙门氏菌刺血管蕈下显着( )实验组(34.6%生存率)高于对照组(0%生存率)。正如其他研究所观察到的[35,以评估潜在的反沙门氏菌活动时,小鼠口服补充一种混合物乳杆菌10天之后感染沙门氏菌沙门氏菌感染SL1344。因此,成活率乳杆菌-预处理组感染后第15天感染率为60%,而感染组仅为40%。此外,Júnior等[37]的研究结果表明,在小鼠中迅速口服白藜芦醇治疗,存活率高达70%乳酸菌diolivorans1Z和挑战沙门氏菌与小鼠相比的伤寒蕈下只接受了水(0%生存),然后挑战沙门氏菌沙门氏菌感染。
在本研究中,混合益生菌培养物在第20天以log 6 CFU/ml接种量给药时从益生菌处理小鼠的粪便中清除了目标生物。然而,消除沙门氏菌鼠伤寒DT104在实验小鼠体内的作用时间较长。这可能是由于益生菌菌种在肠道内定植并发挥其益生菌作用所需的时间。与此相反,未添加益生菌(typ)的小鼠表现出较高的肠道菌群沙门氏菌第20天注射鼠伤寒DT104。一般来说,经常食用含有益生菌培养物的发酵产品会导致这些培养物在人体肠道中建立,这将有助于快速消除肠道中的肠道病原体。此外,减少肠道沙门氏菌不同的工作人员报告了因益生菌影响而产生的数字[36,42,43].沙门氏菌鼠伤寒ATCC 14028在23天内完全排除乳杆菌和乳杆菌用作益生菌[29].同样,经选择的乳酸菌组合口服也有显著的保护作用沙门氏菌肉仔鸡的入侵及发炎情况[28].
相应地,混合的菌株乳杆菌对沙门氏菌随着感染的减少沙门氏菌-小鼠模型中诱发的动物死亡[35].施用五种菌株的益生菌组合作为牛奶发酵酸盐或牛奶悬浮液,共30天显着降低沙门氏菌经益生菌处理的猪在感染后15天感染鼠伤寒[44].而且,保护效果乳杆菌GG对沙门氏菌接种后4、7、11 d小鼠感染差异有统计学意义沙门氏菌沙门氏菌感染C5 (45].
6.结论
埃塞俄比亚发酵食品富含潜在的益生菌LAB菌株,由于其杀菌特性,可能对食源性病原体具有抗菌功效。在本研究中,筛选出的潜在益生菌LAB菌株(乳杆菌K132,乳酸杆菌帕拉沙霉菌K114和Lactococcus lactisE124)能够显示出保护作用沙门氏菌鼠伤寒DT104感染实验小鼠。因此,口服所选的益生菌菌株能保护小鼠免受感染沙门氏菌鼠伤寒菌DT104在功能性发酵产品生产中具有广阔的应用前景。
数据可用性
用于支持本研究结果的数据包括在文章中,并可在通信作者要求时获得(SAS数据)。
的利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
致谢
作者承认,亚洲甲腹和分子生物学系,亚的斯亚贝巴大学,食品创新和健康研究所战略方案,北罗兰研究所生物科学,诺维奇研究园区,英国诺威奇,提供所有实验室设施和生物学系,Aksum大学自然和计算科学学院,用于财务支持。
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