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巴西亚马逊河帕拉州两个湖泊沉水木材真菌分解者的组成和多样性
摘要
热带森林的水生生态系统具有高度多样性的微生物,包括真菌,它们是水下木材的重要分解者。尽管真菌在分解过程中起着重要作用,但是关于巴西亚马逊流域淡水真菌多样性的研究却很少。这项工作的目的是描述真菌的组成和多样性存在于巴西亚马逊河流域的两个湖泊(帕拉州)。腐烂的木头碎片(每个湖30个样本)从Jua和Maica湖收集。在真菌生殖结构存在的情况下,对木材样品进行了6个月的检测。在木材中观察到的真菌进行了形态鉴定。在Jua湖中鉴定出23个类群(10个有性,13个无性),在Maica湖中鉴定出26个类群(17个有性,9个无性)。获得了14个分类单元的序列,为进一步鉴定提供了依据。Jua和Maica湖的多样性指数分别为H': 2.6514和H': 2.8174。Sørensen指数的真菌群落研究湖泊是0.3673。 This study is the first to describe the fungal biodiversity of two important aquatic environments in Pará, Brazil.
一。介绍
淡水真菌包括在其整个或部分生命周期中栖息于水的物种,或任何适应于在自然界中主要是水生或半水生基质的物种[1]。这些生物是分解水下植物尸体的关键因素。真菌生物量是水生生态系统中其他生物的营养来源[2,3]. 真菌的酶活性也会改变植物的基质,使它们更适合无脊椎动物的粉碎机和刮板[4]。
淡水子囊菌是一类真菌,已知能积极参与沉水木屑的分解[五,6]。该类群是多系统的,大多数物种属于Pezizomycotina亚门,属于Leotiomycetes、Sordariomycetes和Dothideomycetes [2,7]。该散囊菌纲的成员[8]和Orbiliomycetes [9]是不太常见的。希勒和Raja [10]报道了淡水子囊菌以相对较少的目分布:Helotiales、Pleosporales、Sordariales、Savoryellales、Microascales、Eurotiales和Jahnulales。近年来,由于更广泛的取样和分子鉴定方法的使用,已知分类单元的数量有所增加[11,12]。
亚马逊流域可以说是地球上最复杂的水生栖息地网络[13]. 这个辽阔的地区有各种各样的水环境,包括大河、湖泊、沼泽和季节性泛滥的洪泛平原[13,14]。水生生态系统大致可分为三大类:15,白水[16],和黑的水域[14,17]。水温、溶解氧和有机物含量等水的特性可能会影响淡水真菌种类的多样性[18]. 首次在亚马逊水域(秘鲁)发表的淡水真菌研究是由松岛在白水河进行的[19]。最近的一些研究描述了秘鲁亚马逊流域的子囊菌的新物种[20-24]和帕拉[巴西状态25,26]和亚马逊[27,28]。在一般情况下,亚马逊地区的微生物群落仍在勘探不足,并急需描述亚马逊区域真菌多样性与生态研究。因此,我们试图探讨新的环境,如塔帕若斯河,亚马逊河的最大清水支流之一[17]. 本研究旨在描述巴西帕拉州桑塔雷姆附近塔帕霍斯河流域两个湖泊中沉水分解木材上真菌的组成和多样性。
2。材料和方法
2.1条。研究地点
浸没木材的样品从湖JUA收集(2°25'57“S,54°46'39”W)和湖Maicá(2°27'29.0“S,54°40'10.8”W),并且本质上,下塔帕若斯和亚马逊河的分别在该海湾,。湖JUA接受水是从流和塔帕若斯水渠。湖Maicá是表面的流域的混合和亚马逊河的白水[14](数字1,图2(a),2(b))。
(一个)
(b)中
(C)
(d)
(五)
(六)
(g)
2.2。水的特性
使用ProfiLine 197i WTW多参数探针(德国威尔海姆)测量物理化学变量。温度(℃)、pH值、电导率(μS),溶解氧浓度(mg / L),和浊度(NTU)记录每个样品的集合。
2.3条。样品收集
2017年10月在Jua湖和2017年11月在Maica湖的每个地点都制作了一个单独的系列。在每个地点,收集了30个浸泡在水中的木片,这些木片显示出积极分解的迹象。样本的长度在6至22厘米之间,直径在6至15厘米之间(图2)2(c)). 这些基质用可密封的塑料袋(20 cm × 10 cm)和少量当地水运输到联邦大学应用生物学实验室(UFOPA)的多学科教学实验室。在实验室中,用自来水轻轻冲洗样品,放入潮湿的室内(塑料盒和潮湿的纸巾),并在室温和12/12 h光/暗条件下孵育。
2.4。沉木真菌的分离与鉴定
每隔10天,连续6个月,用Stemi DV4立体显微镜(Zeiss)在采集的木材样本上寻找真菌结构。用解剖针将发现的结构转移到含有蒸馏水的载玻片上。利用Axioskop 40显微镜(Zeiss)对子囊菌类、子囊菌类、子囊菌类、子囊菌类的微形态学进行有性子囊菌类的鉴定,如前所述[22,29,三十]。采用乳酚棉蓝溶液对红曲霉顶端器官进行染色。利用Axioskop 40显微镜(Zeiss)对无性子囊菌类进行分生、分生孢子和分生孢子类型的研究,鉴定出无性子囊菌类。隔离的真菌是由真菌结构转移到抗生素的表面水琼脂(20 g / L琼脂和氯霉素250 mg / L),马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) (Kasvi)和麦芽提取琼脂(MEA)(麦芽提取物30 g / L,真菌学的蛋白胨5 g / L和15 g / L琼脂,pH值5.4±0.2)。将培养好的菌落转移至PYG琼脂(1.25 g/L蛋白胨、1.25 g/L酵母提取物、5 g/L葡萄糖、250 mg/L氯霉素和18 g/L琼脂)[22](数字2(d)-2 (g))。
2.5。DNA提取,扩增和测序
DNA提取按照Ferrer等人的方案进行。[31]。Fungi were grown in test tubes containing 10 mL of potato dextrose broth (120 g potato, 10 g dextrose, and 1000 mL distilled water) for 10 days and transferred to Eppendorf tubes (2 mL) containing 500 μL缓冲液(2.5 mg十二烷基硫酸钠、7.0 mg氯化钠、3.65 mg乙二胺四乙酸、20 mL三氯化三钠和100 mL去离子水和5 μL的ß-巯基乙醇)。为了使细胞结构破裂,对微管进行冷冻(-20°C)和加热(65°C持续1 h)。下一个,500 μ将1份苯酚/氯仿/异戊醇溶液(v/v/v:25/24/1)添加到微管中并旋转,直到获得均匀悬浮液。然后将悬浮液离心(14000 rpm,15 min),并将上清液转移至新的微管(1.5 mL)。将异丙醇等体积添加到上清液中,将混合物均匀化并在-20°C下孵育过夜,以沉淀DNA。将沉淀的DNA离心(14000 rpm,15 min),用70%乙醇洗涤两次,然后在100 中重新悬浮μL蒸馏水。
按照White等的程序对rDNA的ITS区域进行测序,收集分子数据。[32]。反应产生的最终体积为50μ五十、 包括PCR缓冲液(10 mM Tris HCl,pH 8.3,50 mM KCl),1.5 mM MgCl 2,0.5 μ的ITS-1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ')和ITS-4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'),200μM μmdntps, 1.5 U塔克DNA聚合酶,以及100 ng的真菌DNA。热循环进行了应用生物系统公司ProFlex PCR系统初始变性5分钟在94°C,紧随其后的是35周期在94°C DNA变性1分钟,退火在55°C, 1分钟,2分钟在72°C扩展,最终在72°C扩展了10分钟。两个阳性对照和一个阴性对照也进行了测试。在1x TBE缓冲液(100 mM Tris base, 100 mM boric acid, 2mm EDTA pH 8.0)中,1.5%琼脂糖凝胶电泳,加10μL/100 mL of Siber Green SYBR® Safe. Amplified fragments were visualized under UV light. The amplification products were purified using a solution of polyethylene glycol-PEG (10 g polyethylene glycol 800, 7.3 g NaCl, and 35 mL of water) as previously described [33]. 将类似体积的PEG和扩增子溶液转移到微管(1.5 mL)中,均匀化,并孵育(37°C孵育15 min)。然后离心混合物(转速6000 rpm下15 min),丢弃上清液,用70%乙醇洗涤沉淀两次,然后在水中重新悬浮。
测序反应是使用BigDye®试剂盒(Applied Biosystems)进行。是对SEQ 3130遗传分析仪(Applied Biosystems)进行测序。在此研究中使用的序列进行比较,并存放于GenBank数据库(表1)。
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2.6。真菌群落的丰富性、多样性和公平性
每片木材的个体数量是由其上是否有一个物种决定的。在这项研究中,一个个体在每种底物的基础上被量化。如果是在一块木头上发现的,就要算一个人。然而,通常发现多个分类群定植于单个底物。频率、丰富度(物种数量)、α多样性(α),和真菌的相似度计算各湖。为了表征真菌群落中,香农 - 韦弗多样性指数的多样性(H)被雇佣[34]。该指标描述的多样性值越高,说明异质性和多样性越大。以下公式用于进行这些计算: 哪里p在=镍/氮,倪 = 是一世第分类群,和ñ是所有分类单元的个体数。
此外,解释香农 - 韦弗指数,均匀度指数(Ë)计算。该指数是各类群拷贝数的一致性。当一个分类单元在群落中占主导地位时,群落的均匀度趋向于0;当一个分类单元具有相同的丰度时,群落的均匀度趋向于1。指数用下式表示: 哪里H是基于个体数量和的Shannon-Weaver指数小号是样本中存在的分类单元数。
评估不同的真菌群落,样本之间的相似性计算使用Sørensen指数(小号),其值从0(无相似度)到1(绝对相似度)不等。计算公式如下: 哪里一个是在华夏湖收集的分类群的总数,b是在马卡湖收集的分类群总数,以及C是两个湖泊中常见分类群的数目。绘制了两个采集点的分类区面积曲线,以评估采样工作。使用过去的3.2版程序进行统计分析[35]。
为了确定样本大小是否足以描述集合地点的多样性,所述分类单元的累积曲线中的两个湖泊分解浸没木材的样品中发现下研究由新分类群的数目之间的比率分析和木材样品的数量。
三。结果
3.1。物理化学特性:
为了描述本研究中的水生环境,在木材取样时,对Jué和Maicé湖水进行了物理化学分析。桌子2列出参数的值。
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3.2条。样本量
从Jua湖和Maica湖获得的样本积累曲线可以看出,分类单元的数量并不是渐近线,这表明我们还没有充分捕获淡水真菌物种(图2)3)可能需要额外的收集。
3.3条。真菌鉴定
在形态上,胡亚湖共鉴定出23个不同类群,其中43.5% (ñ=10)being sexual (5 Dothideomycetes and 5 Sordariomycetes) and 56.5% (ñ=13)being asexual. In the Lake Maicá, 26 taxa were identified morphologically, of which 65.4% (ñ = 17)有性行为(4个dothideomyces和13个sordariomyces),34.6%(ñ=9)were asexual. We carried out DNA analysis studies with only fourteen taxa (Table1)。这是不可能调查所有类群,因为其中大部分是未开垦的真菌并没有让DNA提取。成功获得ITS序列数据和用于确证形态鉴定(表3)。
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这是巴西亚马逊地区的第一个记录。工厂:绝对频率;FRE:相对频率。ITS序列获得。 |
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3.4条。丰富性、多样性和公平性
在Jua湖,多样性(H′)和公平性(Ë)指数分别达到2.65和0.616255。在这一时期,最常见的五个分类群是巨大木霉(18%),Pseudoxylomyces线虫(11%)、Pleosporaceae MT017518,Fluviatispora和Teratosphaeriaceae MT017515(9%)。在Maica湖,多样性和公平性指数分别达到2.82和0.643588。在这个地点,最常见的分类群是梭孢壳属sp。(11%),Longicollum biappendiculatum(8%),Submersisphaeria服务提供商。,Aquaticola木犀科MT017515(7%)。两湖间真菌群落的Sørensen指数为0.3673。两种环境中都有8个类群。表中描述了在两个湖泊中观察到的分类群的丰富度、多样性和平衡性的信息4。
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4.讨论
在本研究中,我们描述了木材在属于塔帕若斯河(PA,巴西)湖泊分解相关的真菌多样性。这是一个重要的研究,因为它是第一个来描述塔帕若斯河地区的湖泊这些生物的多样性。在实验条件下,无论是湖泊呈现高度多样性和类群之间的一些相似之处。
Jua湖pH值较低(4.9±0.2),电导率较低(9.3±0.2)μ这是意料之中的,因为Jua湖受Tapajos河的影响[15,36]. 其浊度为30 0.1 NTU,可能是由于邻近Santarém市区的废水处理等人类活动的直接干扰所致。Maicá湖具有中性pH(6.7 0.2)和高导电性(42 0.2μS)。这可能在汛期是由于亚马逊河的影响[14]. 由于来自安第斯地区的大量沉积物,这条河流具有碱性pH值、高导电性和高浊度[15,16]。了解水在水生真菌多样性研究中的特征是很重要的,因为之前的研究已经表明,pH值、营养物质、底物类型、河流地貌和季节性等因素都会影响水生环境中的真菌群落[37-39]。
每个湖泊(Jua和Maica)采集20 ~ 25个样本后,累积曲线基本稳定。罗等人[40个]期间在一年时间内四个采样事件收集草,竹的100个样本从滇池在泰国和50克70的样品达到渐近线。Hu等人[41个]从一个堰塞湖和一条溪流中分别采集了100个和90个样品,分别得到了60个和80个样品的稳定曲线。科特斯[28]在两个季节周期内,在Iranduba(巴西亚马孙)地区的一个湖泊中采集了60块沉水木片,在非雨季采集的15个样品中获得了一个物种高原。在这项研究中,每个湖泊采集了30个样本,似乎足够接近高原地区的多样性。
在Jua湖和Maica湖,我们分别观察了23个和26个分类单元。在Jua湖和Maica湖中,独特类群的数量分别为15和18(表2)3). 这些结果与科尔特斯观察到的结果相似[28],他在亚马孙州的一个黑水湖鉴定了25个分类群。与其他作品相比[41个-43个],本研究的总类群数较低。这可能与每个时期的样本数量、采集数量和所研究环境类型的差异有关。此外,先前的研究表明,水的物理化学因素对淡水中子囊菌的丰富性起着重要作用,可能是这些湖泊中的一个因素[44个]。
胡亚湖无性真菌丰富度较高(56.5%),Maica有性真菌丰富度较高(65.4%)。在Jua湖,这可能与流入该环境的河流的影响有关,支持了湖泊中该分类单元的增加[45岁,46个]. 在玛卡湖,性物种丰富度更高。这些结果与Hu等人报道的结果相似。[41个,他们发现在一个死寂的环境中,性丰富度更高。科特斯(28他们还发现了类似的结果,并将这些结果归因于雨水的作用,因为雨水可以将真菌从土壤或植被带到湖中。
在胡安湖最常见的五个分类群是Pseudoxylomyces线虫,巨大木霉,胸膜科MT017518,Fluviatispora和Teratosphaeriaceae MT017515。在麦卡湖中,五个最常见的分类群是梭孢壳属服务提供商。,Longicollum biappendiculatum,Submersisphaeria服务提供商。,Aquaticola和Morosphaeriaceae MT017525。Aquaticolasp.和Longicollum biappendiculatum是Cortez所描述的最常见的分类群[28]。阿卜杜勒•阿齐兹(43个[英语背诵文选在对水下植物茎的研究中芦苇(骑士)特里恩。ex Steud列出了七种在这项研究中常见的物种(盗贼服务提供商。,环海鞘例如,Aquaticola服务提供商。,蛇床子服务提供商。,假盐蜜环菌服务提供商。,梭孢壳属SP。,和单格孢属式)。拉贾等人[42个],在佛罗里达半岛的淡水环境中,共有五个分类群(盗贼SP。,蛇床子SP。,水淹层,网状流孢子虫,和Longicollum biappendiculatum). 观察到这些类群同时发生在静水和水环境中。根据Shearer等人的说法。[24,淡水ascomycetes种类的组成在佛罗里达、热带南美洲(秘鲁)和热带东南亚之间是相似的。
Cancellidium舌,在Jua湖和Maica发现,Zelski等人也报道过。[22]在秘鲁的淡水栖息地淹没在木子囊菌的调查。这种被认为是全科和在激流和静水生境的草本和木本基材可以发生。这个物种,以及单格孢属sp.,可被视为耐干旱期[47个考虑到Jua湖也经历了相当长一段时间的干旱,它的存在并不令人惊讶。此外,球形顶孢菌最近有报道称,在卡廷加生物群落的河流和溪流中,以及在亚马孙州马瑙斯的一个湖泊中的沉水木材中,都有叶子的物质[五,28]。九个类群被确定为巴西亚马逊新的记录,如表1。
Jua湖和Maica湖的H’index多样性分别为2.65和2.82。Hu等人[41个]在泰国相比,人工湖和获得的分别2.34和3.68,分集索引的流,这表明因子如河岸林的组合物,河流的筑坝,和人为动作可以影响社会和在淡水真菌的多样性栖息地。科特斯(28]研究了亚马孙州湖泊的多样性,并进行了季节对比,得到雨季和非雨季的指数分别为2.60和2.13。本研究推断,季节性可能影响真菌多样性。在尼罗河,阿卜杜勒-阿齐兹[43个,冬季和夏季的指数分别为3.08和2.44。海德等人[48个]强调热带地区每样木材的分类单元数高于温带地区。根据格拉萨等人的说法。[49个,热带和亚热带地区的低多样性可能与生态和方法问题有关。本研究的多样性指数与其他静环境下的相似(平均值为∼2.8),证实了lotic环境下的多样性更大(平均值为∼4.60)[41个,50个-52个]。
Sørensen的相似指数(0.3673)显示,研究湖泊之间的相似性较低。这可能是由于研究过程中发现的结构和物理化学差异导致了水生生态系统中支原体的组成[37,38,53个]. 据勒夫说[54个,水流的单向流动(反映在生物体的生活策略中)、水的混合和曝气,以及外来物质的重要性,都影响到溪流和河流的微生物组成。
亚马逊河地区缺乏对在水环境中分解沉水木材的真菌的研究。因此,本研究有助于了解该地区水生真菌的多样性。结果表明,该区具有丰富均衡的多样性。这项研究提供了更深入的了解淡水真菌在清水栖息地的动态,并指出了该群落是如何分布在亚马孙湖。值得注意的是,还需要进一步的研究来加强这方面的研究,并增加有关巴西亚马逊地区淡水子囊菌物种的生物地理学、生态学和分类学的现有信息。
数据可用性
用来支持这项研究的结果的数据是可用的,请相应的作者。
的利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
致谢
笔者想感谢联邦大学伊斯特做准UFOPA和LABORATORIO德Micologia /国家研究所Pesquisas达亚马逊河流域,为INPA提供实验室设施。LABORATORIO德TECNOLOGIAS去DNA-UFAM负责DNA测序样品。我们感谢博士卡洛斯·伊万Vildoso教授和Huzefa拉贾博士的合作。这项研究是由Coordenação德Aperfeiçoamento德Pessoal去NIVEL高级 - 巴西(CAPES)(金融码001” d)提供部分资助。
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