合理设计的抗微生物肽的抗菌活性

抽象的

由于没有有效的治疗来消除它们，因此许多传染病仍然是普遍存在的人口中。原因可以是朝向可用治疗分子的抗生素抗性或产生足够治疗方案的缓慢速率，以解决新的传染病的快速生长，以及目前治疗方案的毒性。由于这些原因，需要寻求和发展新的治疗方案，以减少细菌感染的快速规模。抗微生物肽（AMP）是原核生物和真核生物的第一道防线的组分，并且具有针对革兰阴性和革兰氏阳性细菌，真菌，癌细胞和原生动物以及病毒的各种活动。在该研究中，通过测定其动力学以及它们的细胞毒性，进一步筛选最初鉴定为其HIV抑制活性的肽。从获得的结果中，两个安培（分子3和分子7）的麦克风为12.5 μ.克/毫升K.肺炎(ATCC 700603)和6.25μ.克/毫升P．铜绿假单胞菌（ATCC 22108）。两个省级被杀很快这些细菌在体外，防止细菌生长在几小时内。此外，即使在100的AMP浓度下，这两种肽的细胞毒性活性也明显低落 μ.g / ml。这些结果表明，分子3和7有很大的潜力作为抗菌药或可作为在耐抗生素细菌的治疗的治疗方案的设计铅化合物。

1.介绍

人体配备防御机制，使其能够消除异物和/或病原生物[1，2］.然而，当微生物侵入人体免疫系统时，人体防御系统将失去自我防御能力，最终导致免疫系统完全崩溃，从而为其他病原微生物进入人体让路。

尽管大多数细菌的细胞与人体共处而不造成任何伤害和破坏，一些常见的传染病病原体，会导致疾病可能包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株，念珠菌白葡萄酒，疱疹单纯x，分枝杆菌复合体（苹果电脑），结核分枝杆菌，肺炎克雷伯菌， 和铜绿假单胞菌， 仅举几个 [3.］.S.金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯氏菌，大肠杆菌， 和铜绿假单胞菌是对个体有严重临床和医学影响的细菌的例子，这些细菌是全世界医院感染的主要原因[4，5］.此外，这些致病微生物被认为是许多感染的主要病原体，如皮肤感染、呼吸道感染和其他重大疾病。在某些情况下，这些感染可导致危及生命的疾病，如肺炎、脑膜炎、中毒性休克综合征和菌血症[5- - - - - -7］.

除了一些人的免疫系统不能抵抗任何细菌感染的事实外，主要问题是目前可用的用于根除这些致病微生物的抗生素无效。这种新抗生素的无能是微生物对它们产生耐药性的结果。此外，免疫能力强的人感染了S.金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和/或K．肺炎由于抗生素抗性基因，还表现出对这些药物的低敏感性[8- - - - - -11.］.

缺乏有效的抗菌抗生素来抑制传染性病原体并阻止这些微生物复制的能力鼓励微生物学家和临床病理学家开始寻找替代补救措施以治疗这种微生物感染的旅程。一些抗微生物肽已被证明是良好的抗菌活性来源[12.- - - - - -17.］.

这些肽的许多肽已商业开发，可在市场上获得。一些实例包括美国FDA批准的明素B-Collistin-Colomycin（前药）和用于治疗皮肤感染的达达霉素（立方霉素）[18.，19.］.同样，amp的实施也取得了重大成果，证明其对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、原生动物、真菌、病毒，特别是艾滋病毒的活性[20.- - - - - -26.］.

在先前的研究中，我们能够与强大的抗HIV活性，以识别和确认抗菌肽[27.］.其中一些amp还被用作诊断HIV的配体[28.，29.］.随访研究描述在硅片里进行父母的抗HIV AMPS的诱变诱变，以增加其结合亲和力，并且抗HIV活性表明，与其亲本安培相比，这些突变的AMPS增加了抗HIV活性。此外，还证明了这些抗HIV安培的广泛中和能力和作用机制（未发表的数据，稿件正在准备中）。然而，在目前的研究中，我们将这些肽筛选出许多革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以研究这些抗菌肽是否可以具有除抗HIV活性的抗菌活性。抗菌实验还证实了生物信息化方法用于鉴定具有不同微生物活性的肽的疗效。结果表明，一些安培对革兰氏阳性细菌具有中等的活性。然而，肽表现出对革兰阴性细菌的有效活性，例如肺炎克雷伯菌(写明ATCC 700603)和铜绿假单胞菌（ATCC 22108），其是临床抗生素抗性菌株。此外，一些肽具有抗菌活性的证明有针对这些细菌在合理的时间内快速杀灭动力学。他们对人类细胞系的细胞毒性活性也显著低。

2.材料和方法

2.1。细菌菌株

并对推测的抗菌肽进行了抗菌活性测定金黄色葡萄球菌属，从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得，用革兰氏阳性菌S.金黄色葡萄球菌SPP。包括甲氧西林敏感性S.金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）和耐甲氧西林S.金黄色葡萄球菌(写明ATCC 33591)压力。测试的其他菌株是K.肺炎(写明ATCC 700603)和铜绿假单胞菌（ATCC 22108），其是革兰氏阴性细菌。

２.２.抗菌肽化合物

使用五种推定的抗HIV AMPS用于抗菌测定（表1），其物理化学性质的特征（表格2)．按照Tincho的先前工作中描述的鉴定了AMP [27.］.从GL生物化学有限公司(上海200241，中国)中获得所选amp，采用固相法进行化学合成，反相高压液相色谱法纯化至> 98%。

２.３.抗菌肽的制备及阳性对照浓度

AMP的储备溶液通过溶解在无菌蒸馏水中的AMP的量来制备（DH₂o），并且在浓度为500的浓度下以两倍的连续稀释液制备微量滴定液稀释测定中使用的各种AMP工作浓度 μ.1.5625 g / mlμ.g / ml。氨苄青霉素用作在该测定中，阳性对照和100工作原液 μ.克/ ml的在蒸馏水中来制备。

２.４.体外抗菌试验

2.4.1。抗菌活性和最小抑制浓度（MIC）

使用微量滴定液稀释方法来测量AMP的抗菌活性。根据临床和实验室标准研究所（CLSI）规定的标准和准则进行该测定[30.］.简而言之，检测微生物(MRSA (ATCC 33591)、MSSA (ATCC 25923)、K.肺炎（ATCC 700603），和P．铜绿假单胞菌（ATCC 22108））在振动器上的胰蛋白酶肉汤（TSB）中的中间显性相增加，振荡器在37℃下设定在37℃并以150rpm摇动。将浊度调节至0.5麦克兰标准，最终体积为10毫升。从准备的AMP解决方案库存中，各种工作肽浓度（500 μ.1.5625 g / mlμ.g/ml)，将菌体与多肽的混合物置于96孔平板中，37℃孵育24 h。孵育24小时后，40μ.(l (2) - 4-iodophenyl 3 - (4-nitrophenyl) 5-phenyl-2H-tetrazolium (INT) was added to each well and incubated again for 3 h. Absorbance readings were taken at 620 nm on a microtiter plate reader (Omega®POLARstar BMG Labtech, USA).

AMP的所有抗菌测定一式三份制备，并重复实验三次以确保测试的再现性。吸光度结果被出口到Excel文件中，在标准化过程中，它们被转变为百分比。每种肽的MIC定义为浓度导致初始接种物的约90％杀伤。

2.4.2。生长抑制试验

的生长曲线K.肺炎(写明ATCC 700603)和P．铜绿假单胞菌(ATCC 22108)用分子3和分子7处理后的时间是根据每次采集时间在620 nm处的测量值来确定的。将不同浓度的肽添加到测试菌株中(k .肺炎和铜绿假单胞菌），将其使用与用于在AMP和MIC的抗微生物活性的测定相同的方法在96个孔板中培养。

2.5。细胞毒性

用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)测定AMPs的细胞毒性活性，Freimoser [31.］.简而言之，HEK293T和HepG2细胞胰酶化后，1 × 10⁴将细胞/孔接种在96孔无菌板中，并在含有10％胎牛血清的Dulbecco改性鹰培养基中生长至汇合。分子3和分子7各自以不同浓度的孔加入孔中（10 μ.微克/毫升，25 μ.50 g / ml,μ.g / ml和100 μ.g / ml)。6% DMSO处理的细胞作为阳性对照。经多肽处理48 h后，20μ.l of MTT solution was added to each well, and the plates were incubated in a humidified incubator for 3 h in 5% CO₂在37°C。孵育后，去除培养基，二甲基亚砜(DMSO) (100μ.每孔）加入每个孔中，将板再次在37℃，5％CO的振荡器中孵育₂培养10分钟。在室温下轻轻旋转10分钟使沉淀溶解。采用多板阅读器(Omega®POLARstar BMG Labtech, USA)在570 nm、600 nm和630 nm波长下测定吸光度。

实验重复3次，以验证实验的重复性。经过处理的细胞的最终吸光度通过在630 nm处和570 nm处的测量值减去多孔板的背景吸光度得到。细胞存活率百分比计算公式如下:

吸光度结果被出口到Excel文件中，在一个名为“规范化的过程中，它们被转换为百分比。

2.6。统计分析

呈现的数据是从至少三个独立实验获得的平均值±SD。使用GraphPad Prism软件（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）进行每个推定放大器的统计分析和细胞毒性值。这种方式之间的差异被认为是显着的根据Prism的双向方差分析检验。标准误差柱代表平均值的标准差(±标准差)和表示的未处理的和处理的细胞的装置之间的显著差异。

3.结果

3.1。抗菌肽的体外抗菌活性

采用CLSI标准规定的微量滴定法对鉴定的抗菌活性进行研究。初步筛选结果显示，与革兰氏阳性菌相比，分子3和分子7这两种抗菌肽对革兰氏阴性菌具有更有效的抗菌活性(表)3.)．进一步的实验以确定具有抗菌活性的测试AMP的的MIC表明，分子3的MIC值分别为12.5 μ.克/毫升K.肺炎(ATCC 700603)和6.25μ.克/毫升P．铜绿假单胞菌（ATCC 22108）。分子7观察到相同的麦克风值K.肺炎(写明ATCC 700603)和P．铜绿假单胞菌（ATCC 22108）。

数据表明，革兰氏阴性细菌对分子3和分子7更敏感，具有比传统抗生素药物更有效的抗生素抗性病原体的抑制活性。然而，革兰氏阳性细菌（MRSA（ATCC 33591）和MSSA（ATCC 25923）对这些肽（分子3和7）不敏感。

3.2。分子3的增殖抑制活性和对细菌分子7

除了确定的麦克风外，我们还研究了肽随着时间的推移影响细菌生长的速率（图1和2)．的OD₆₂₀was measured from 3 to 8 h after treatment with a microplate reader, with Ampicillin as a positive control. It was found that both peptides (Molecule 3 and molecule 7) could inhibitK.肺炎(写明ATCC 700603)和铜绿假单胞菌（ATCC 22108）浓度的生长25 μ.g/ml或更低，在治疗后很短的时间内(图1和2)．我们注意到，即使AMP的浓度低于测定的MIC，分子3和7仍然可以完全抑制铜绿假单胞菌（ATCC 22108）治疗后的增长3-8小时（图1(一)和2(一个))．然而，分子3能够抑制铜绿假单胞菌在所有浓度和实验期间，虽然分子7不能抑制铜绿假单胞菌在浓度低于MIC (6.25μ.克/毫升）（图2(一个))．同样，分子7也不能抑制生长K.肺炎（ATCC 700603）在低于这些生物上的分子7获得的各自的MIC值（图2 (b))．分子3能够抑制生长K.肺炎(ATCC 700603)的浓度等于MIC (12.5μ.g/ml)，比MIC高2倍MIC。浓度为6.25μ.g / ml，分子3能够抑制4小时的生长（图1 (b))．此外，阳性对照，氨苄青霉素，可以抑制其生长铜绿假单胞菌（ATCC 22108）浓度为100 μ.g / ml。但是，相同浓度的氨苄青霉素（100 μ.克/毫升）未能抑制的生长K.肺炎（ATCC 700603）。抑制生长的可能性K.肺炎(写明ATCC 700603)和铜绿假单胞菌(ATCC 22108)显示这些AMPs的抑制作用是剂量依赖的。

3.3。上HEK293T和HepG2细胞系分子3和分子7的细胞毒性活性

通过MTT方法测试分子3和针对哺乳动物细胞HEK293T和HepG2的分子7的细胞毒性（图3(一个)和3 (b)），使用剂量反应测定（25,50,75和100的浓度 μ.克/使用毫升）中。分子3和分子7诱导的在这项研究中测试的两种细胞系的存活力的剂量依赖性降低。仅观察到两种肽（分子3和分子7）在细胞活力中度降低，甚至在100的最高肽浓度 μ.克/毫升，用79.5％的HepG2细胞的细胞生存力。然而，相当多（ ）与未处理细胞株(阴性对照)相比，用分子3和分子7处理HEK 293T细胞株，其细胞活力仅为59.29%。然而，当肽浓度为25时μ.g/ml时，两种细胞系的抑制率均大于90%(图)3(一个)和3 (b))．但是，在这个浓度下，分子3和7有效地抑制了革兰氏阴性细菌的生长，包括k .肺炎(写明ATCC 700603)和铜绿假单胞菌(ATCC 22108)，显示这些肽对正常人体细胞的毒性较小。

4。讨论

医疗和制药行业都在比赛中发现和开发新药物，将作为强有力的抗菌打击多种疾病。这个旅程是一个耗时的过程，需要大量的资金，有时结束在临床试验阶段被拒绝，由于许多副作用。在过去的十年里开发新的抗生素的另一个主要问题是现有的抗生素增加细菌耐药性，这是由滥用抗生素引起的。有效的抗微生物肽类药物可以对抗可能的抗生素抗性。

在寻求寻找新型肽的抗生素中，我们使用微量滴定方法筛选了许多用于抗菌活性的AMP。从结果中，表明只有两个抗微生物肽能够完全抑制生长铜绿假单胞菌和k .肺炎在各自的AMP浓度为6.5时μ.g / ml和12.5 μ.克/毫升(表3.)．甚至最高的AMP浓度为500.0μ.克/毫升的没能抑制高达两治疗的50％的葡萄球菌SPP。即使对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）。耐甲氧脲也是如此金黄色葡萄球菌（MRSA）。Only moderate bacterial inhibitions were observed 24 h after treatment of both StaphylococcusSPP.．有500.0. μ.微克/毫升浓度的AMP（数据未示出）。

从结果中我们观察到，分子3和7具有相似的赖氨酸和精氨酸百分比组成，这两种氨基酸是被测抗菌肽中这两种肽中最常见的残基(表)1和表格2）;这些氨基酸已经被证明对AMPs的阳离子功能很重要[32.- - - - - -34.］.此外，两种amp具有相似的等电势，与其他测试肽相比，两种amp具有最好的正电荷参数(表)2)．此外，正电荷残基的存在和43%的疏水性是极好的元素，使这些多肽具有比其他三种多肽更好的抗菌活性[35.- - - - - -37.］.

通过细胞壁化学的差异，可以解释在针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中观察到的抗菌活性的差异。革兰阴性细菌具有额外的外膜，这使得它们更耐常见的抗生素[38.，39.］.因此，安培对革兰氏阴性细菌的更大活性是有希望的结果。因此，在抗生素抗性细菌上使用诸如AMPS的新型分子可以作为对这些抗生素抗性细菌的药物设计的另外的模板。本研究中获得的结果也可以通过在革兰氏阳性细菌的膜中存在一层重肽聚糖体积来解释，这可能会阻止破坏葡萄球菌SPP。由安培。相反，革兰氏阴性细菌具有额外的外膜的轻肽聚糖层;因此，测试的细菌（铜绿假单胞菌(写明ATCC 22108)和K.肺炎（ATCC 700603））对安培敏感。因此，可以说，在某些情况下，可以在微生物膜上对微生物膜的作用（n-连接糖，肽聚糖，脂多糖）对微生物的作用是保护它们免受中和抗体和抗生素的影响[40- - - - - -42.］.

虽然结果指出，100 μ.克/ ml氨苄青霉素不能抑制的生长k .肺炎此外，当用100处理时，观察到这种细菌似乎比未处理的细菌大得多 μ.g / ml氨苄青霉素。林等。在2013年报告了同样的观察k .肺炎用5mg / ml治疗果实却已似乎比未治疗的长得多k .肺炎试验后的第二小时后;后来，经处理的细菌停止生长而不是未经处理的细菌，并在治疗后24小时超越未处理的细菌[43.］.未治疗的模式k .肺炎和治疗k .肺炎with 5 mg/ml of果实却已本研究报告的曲线与未经治疗的曲线相似k .肺炎和k .肺炎处理100μ.g / ml ampicillin（数字1 (b)和2 (b))．

这两种抗菌肽抑制革兰氏阴性菌的能力铜绿假单胞菌(写明ATCC 22108)和K.肺炎（ATCC 700603）也证明了抗菌肽开发的模型将被考虑作为设计未来工具，并具有广泛的微生物活动有力肽的鉴定。虽然最初的生物信息学模型开发，以确定放大器，具有HIV活性，它限制了这些抗菌肽只是艾滋病毒活动，因为它先前已表明，单一的抗菌肽可以发挥多种抗菌活性[44.- - - - - -50.］.

许多抗菌肽已被证明对选定的病原微生物的抗菌活性[12.- - - - - -17.，49.]但虽然这些安培大部分都没有通过临床试验的最终阶段，但只有很少使用[50.- - - - - -52.，这两种抗菌肽目前表现出的抗菌活性看起来很有希望，因为这些肽比已知的抗生素氨苄西林更有活性K.肺炎(写明ATCC 700603)(数据1 (b)和2 (b))．此外，分子3和分子7杀死铜绿假单胞菌(写明ATCC 22108)和K.肺炎（ATCC 700603）以快速的速率并仍然在治疗后长期保持活性。因此，这种能力将分子3和分子7赋予杀菌。此外，AMPS（分子3和分子7）对HEK293T细胞系具有降低的毒性，其具有在HepG2细胞系（一种人肝癌细胞系）上观察到的安培的细胞毒性。安培的选择性毒性可能是由于哺乳动物细胞和细菌之间的膜的差异。

尽管作用机制，分子3和分子7发挥其抗菌活性尚未建立起来，这些放大器的杀菌能力可以使用任意的桶，破碎机械，地毯机制的结果[53.或者或环形孔机制[24.］.该桶破碎机制的可能性更大，因为我们的大部分肽是α.螺旋，β折叠的肽，具有延长α.- 雄辩结构，并扩展β- 表格结构;它已被发现最多α.螺旋或β折叠抗菌肽利用这一机制发挥对病原体[他们的活动54.］.分子3和分子7所显示的抗菌活性铜绿假单胞菌(写明ATCC 22108)和K.肺炎（ATCC 700603）以及它们对HEK293T和HepG2细胞系低毒性表明，这两种抗菌肽可以是用于肽来源的有效抗菌药设计良好的先导化合物。

5.结论

世界上大多数研究机构和/或制药公司的最终目标是探索更多和新的药物来对抗许多传染病。我们迫切需要找到新的先导分子，可以用于开发这些病原体敏感的新药。在这里，一组先前被证明具有HIV活性的多肽，对致病性革兰氏阴性菌表现出了快速杀菌活性。此外，两种具有抗菌活性的amp对HEK293T和HepG2细胞株的毒性较低，即使其浓度比细菌MIC高4X。这些结果表明，这些多肽在临床上很重要，是设计抗感染药物的一个极好的模板。进一步的工作将是测试肽对临床菌株的活性，建立抗菌肽的作用机制，并进行体内试验，以确定其抗生素潜力。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

AP、MBT、MM和TM构思和设计了实验。MBT进行了实验。AP、MBT、MM和TM对数据进行分析。MBT, MM和TM贡献试剂/材料/分析工具。AP, MBT, MM, TM写论文。

致谢

这项研究的作者要感谢所有的资金提供者：国家研究基金会，科学技术部，和DST / MINTEK纳米技术创新中心（NIC）。此外，他们特地从医学微生物学单位，医疗生命科学，西开普省，南非的大学系感谢凡妮莎Joosta女士，为细菌培养，并从医疗生命科学，西方的大学系蒂莎恩古尼博士开普敦，南非;用于引导在食品毒理学实验室的初始步骤。在这项研究中进行的实验是由TM部门研究基金，并通过AP和MM DST / MINTEK纳米技术创新中心（NIC）的研究基金资助。

参考

1. L. Du Pasquier和M. Flajnik， "脊椎动物免疫系统的起源和进化"，刊于基础免疫学， W. E. Paul, Ed.， Lippincott，费城，宾夕法尼亚州，美国，第四版，1999。视图:谷歌学术
2. R. A. Goldsby和R. A. Goldsby，“Kuby Immunology”免疫学，弗里曼，W. H.和公司，纽约，纽约，美国，第5版，2003年。视图:谷歌学术
3. J. E.卡普兰，D.汉森，M. S.德沃金等人，“人类免疫缺陷病毒相关的机会性在美国高活性抗逆转录病毒疗法的时代感染流行病学，”临床传染病， 2000年第30卷，第5-14页。视图:出版商网站|谷歌学术
4. I. M. Gould，“医院获得的甲氧西林的费用金黄色葡萄球菌（MRSA）和它的控制，”国际抗菌药物杂志，卷。28，不。5，第379-384，2006年。视图:出版商网站|谷歌学术
5. A. Ferroni，L. Nguyen，B. Pren，G.Quesne，M. C. C. Brusset和P. Berche，“爆发了医院泌尿道感染铜绿假单胞菌与自来水污染相关联的小儿外科单元，”医院感染杂志，卷。39，没有。4，pp。301-307，1998。视图:出版商网站|谷歌学术
6. A. Balcht和R. Smith， "铜绿假单胞菌：感染和治疗，“信息卫生保健，第2卷，第83-84页，1994。视图:谷歌学术
7. J. P. Curran和F. L. Al-Salihi， "新生儿葡萄球菌烫伤皮肤综合征:由一种不寻常的噬菌体类型造成的大规模爆发"儿科，卷。66，没有。2，pp。285-290,980。视图:谷歌学术
8. M. P.杰文斯“‘Celbenin’抗性葡萄球菌，”BMJ， vol. 1, no. 15219页，124-125页，1961。视图:出版商网站|谷歌学术
9. K.普尔，“在革兰氏阴性细菌外排介导的多重耐药性”临床微生物学与感染，卷。10，不。1，pp。12-26,2004。视图:出版商网站|谷歌学术
10. A. P. Johnson，H. M. Aucken，S. Cavendish等，“MRSA中的EMRSA-15和-16的优势导致英国医院菌血症：分析来自欧洲抗微生物耐药监测系统（耳朵）的分离物”抗菌化疗杂志CHINESE，卷。48，不。1，第143-144，2001。视图:出版商网站|谷歌学术
11. K. Hiramatsu，H. Hanaki，T. Ino等，“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌减少万古霉素易感性的临床菌株，“抗菌化疗杂志CHINESE，卷。40，不。1，pp。135-136,1997。视图:出版商网站|谷歌学术
12. 彭h K. Ngai, Z. Zhao, T. B. Ng，“Agrocybin，一种来自食用蘑菇的抗真菌肽茶薪菇”,肽第26卷第2期2，页191-196,2005。视图:出版商网站|谷歌学术
13. M. Andersson, A. Boman，和H. G. Boman，“猪和人蛔虫线虫产生三种抗菌肽:cecropin P1的分离和两种ASABF肽，”细胞与分子生命科学，第60卷，第2期3，页599-606,2003。视图:出版商网站|谷歌学术
14. H. Steiner, D. Andreu，和R. B. Merrifield，“天蚕素和天蚕素类似物的结合和作用:来自昆虫的抗菌肽”生物化学与生物物理学报，卷。939，PP。260-266,1998。视图:出版商网站|谷歌学术
15. F. Niyonsaba，K.Iwabuchi，A. Someya等，“人类抗菌肽LL-37的一家水癌族诱导肥大细胞趋化性”免疫学，卷。106，没有。1，pp。20-26,2002。视图:出版商网站|谷歌学术
16. K.Pütsep，C.Bränden，H.G.Banan和S. norgark，“抗菌肽来自幽门螺旋杆菌”,自然，第398卷，第671-672页，1999。视图:出版商网站|谷歌学术
17. A. Kubo，C. S. Lunde和I. Kubo，“吲哚和（e）-2-己醛，Polymyxins的Phytochemicationolizors反对铜绿假单胞菌和大肠杆菌”,抗微生物剂和化疗，卷。40，不。6，第1438至1441年，1996。视图:出版商网站|谷歌学术
18. S. Gupta, D. Govil, P. N. Kakar等人，“粘菌素和多粘菌素B:重新出现”印度急救医学，卷。13，不。2，第49-53,2009。视图:出版商网站|谷歌学术
19. D. M.舒梅克，J.思谋，和W. E.罗兰，“在复杂性皮肤和皮肤结构感染的治疗达托霉素注射（达托霉素）的综述，”治疗和临床风险管理，卷。2，不。2，第169-174，2006年。视图:出版商网站|谷歌学术
20. D. Andreu和L. Rivas，《动物抗菌肽:概述》，生物聚合物，卷。47，没有。6，PP。415-433,1998。视图:出版商网站|谷歌学术
21. C.Münk，G.Wei，O. O. Yang等，“的θ.- 掺杂，逆流，抑制HIV-1条目，“艾滋病研究与人类逆转录酶病毒第19卷第2期10，第875-881页，2003。视图:出版商网站|谷歌学术
22. J. P. Lalezari, J. J. Eron, M. Carlson等人，“基于enfuvirtide的抗逆转录病毒治疗的长期安全性和抗病毒活性的II期临床研究，”艾滋病，卷。17，不。5，第691-698，2003。视图:出版商网站|谷歌学术
23. W. Wang，S. M. Owen，D.L.L.Rudolph等，“活动α.- 和θ.抗HIV-1的初步分离防御素，”免疫学杂志，卷。173，不。1，pp。515-520，2004。视图:出版商网站|谷歌学术
24. K. A. Brogden，“抗菌肽：细菌中的孔隙甲板或代谢抑制剂？”自然评论微生物学，第3卷，第2期。3，页238 - 250,2005。视图:出版商网站|谷歌学术
25. J. J. Dwyer, K. L. Wilson, D. K. Davison等人，“对enfuvirtide耐药病毒具有有效活性的螺旋型、寡聚型HIV-1融合抑制肽的设计”，国家科学院的诉讼程序，第104卷，第104号31, pp. 12772-12777, 2007。视图:出版商网站|谷歌学术
26. Wang G.， K. M. Watson, A. Peterkofsky, R. W. Buckheit Jr.，“基于抗菌肽数据库的新型人类免疫缺陷病毒1型抑制肽的鉴定”，抗微生物剂和化疗，卷。54，没有。3，第1343-1346，2010。视图:出版商网站|谷歌学术
27. M. B. Tincho，M. N. Gabere，和A.利乌斯，“在硅片辨识与HIV治疗推定的抗微生物肽的分子验证，”艾滋病与临床研究杂志，第7卷，第5期9,606页，2016年。视图:出版商网站|谷歌学术
28. M. E.威廉姆斯，M. B. Tincho，M.N。Gabere等人，“用于通过HIV蛋白p24的改进的人免疫缺陷病毒的诊断推定的抗微生物肽的分子验证，”艾滋病与临床研究杂志，第7卷，第5期5，p。571,2016。视图:出版商网站|谷歌学术
29. A. Pretorius, M. N. Gabere, M. B. Tincho, M. E. Williams，“HIV检测肽PCT专利WO 201”，2016,6/079716 A1, 2016/05。视图:谷歌学术
30. 临床检验标准研究所，《有氧生长细菌的稀释药敏试验方法》;批准Standard-Ninth版”,取代M07-A8，第29卷，2页，2012。视图:谷歌学术
31. F. M. Freimoser, C. A. Jakob, M. Aebi, and U. Tuor, “The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium bromide] assay Is a fast and reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities,”应用和环境微生物学，卷。65，不。8，pp。3727-3729，1999。视图:出版商网站|谷歌学术
32. R. E. W. Hancock和D. S. Chapple的，“肽抗生素”抗微生物剂和化疗，卷。43，不。6，PP。1317-1323,1999。视图:出版商网站|谷歌学术
33. R. E. W. Hancock和G. Diamond，“阳离子抗菌肽在先天性宿主防御中的作用”微生物学的趋势，卷。8，不。9，pp。402-410,2000。视图:出版商网站|谷歌学术
34. R. E. W.汉考克和h . g。作为新的抗感染治疗策略的抗菌和宿主防御肽自然生物技术，卷。24，不。12，PP。1551-1557,2006。视图:出版商网站|谷歌学术
35. Y. Rosenfeld, N. Lev，和Y. Shai，“疏水性对净正电荷比对结构相似抗菌肽抗菌和抗内毒素活性的影响”，生物化学，卷。49，没有。5，PP。853-861,2010。视图:出版商网站|谷歌学术
36. L. M. Yin，M.A.Edwards，J.Li，C.M. Yip和C. M. Deber，“伴阳膜相互作用阳离子抗微生物肽的疏水性和电荷分布的作用”生物化学杂志，卷。287，没有。10，pp。7738-7745,2012。视图:出版商网站|谷歌学术
37. M. H. Jindal是C. F.勒，M. Y.莫哈末-尤索夫和S. D. Sekaran，“净电荷，疏水性和特定氨基酸有助于抗微生物肽的活性，”健康与转化医学杂志，卷。17，不。1，pp。1-7,2014。视图:出版商网站|谷歌学术
38. dr . S. Gupta，“diderm(革兰氏阴性)细菌的起源:抗生素选择压力而不是内共生可能导致了具有两层膜的细菌细胞的进化”，Antonie Van Leeuwenhoek.，卷。100，不。2，pp。171-182,2011。视图:出版商网站|谷歌学术
39. R. S. Gupta，《原核生物之间的自然进化关系》微生物学评论第26卷第2期2，页111 - 131,2000。视图:出版商网站|谷歌学术
40. Wei X.， J. M. Decker, S. Wang et al.，“HIV-1的抗体中和和逃逸”，自然，卷。422，没有。6929，PP。307-312,2003。视图:出版商网站|谷歌学术
41. K. M. Davis和J. N. Weiser，“肽聚糖主干的修饰帮助细菌建立感染，”感染和免疫，第79卷，第5期。2, pp. 562 - 570,2011。视图:出版商网站|谷歌学术
42. I. Nikolaidis，S.Favini-stabile，A. Dessen，“抗生素靶向细菌细胞壁”，“蛋白质科学，卷。23，不。3，pp。243-259,2014。视图:出版商网站|谷歌学术
43. Lin T. H.， Huang S. H.， Wu c.c.c . et al.，“通过抑制肺炎克雷伯菌的生长和荚膜多糖的合成果实却已”,循证补充和替代医学文章编号621701,2013。视图:谷歌学术
44. C.-Y.平底锅，t.t.t.Chao，J.-c。Chen等人，“虾（Penaeus Monodon.）抗脂多糖因子减少的致死率铜绿假单胞菌脓毒症小鼠”,国际免疫药理学，第7卷，第5期5，第687-700，2007。视图:出版商网站|谷歌学术
45. C.-Y.潘，J.-Y.陈，T.-L.林和C.-H林，“体外从epinecidin-1和抗痤疮丙酸杆菌，白色念珠菌，和阴道毛滴虫的抗脂多糖因子衍生的三种合成肽的活性，”肽，第30卷，第2期6, pp. 1058-1068, 2009。视图:出版商网站|谷歌学术
46. S. Tharntada, S. Ponprateep, K. Somboonwiwat等人，“黑虎虾抗脂多糖因子的作用，Penaeus Monodon.，以防止白斑综合症病毒感染。普通病毒学杂志，卷。90，没有。6，第1491至1498年，2009年。视图:出版商网站|谷歌学术
47. “中国林蛙抗微生物肽前体cdna的分子克隆与应用，”中国林蛙学报(自然科学版)动物学科学第26卷第2期3，pp。220-226,2009。视图:出版商网站|谷歌学术
48. Y. Chen，L. Cao，M. Zhong等，“新蝎子毒液肽衍生物KN2-7的抗HIV-1活性”，普罗斯一体，第7卷，第5期4、文章ID e34947, 2012。视图:出版商网站|谷歌学术
49. 曹磊，戴超，李志忠等，“一种蝎毒肽衍生物的抗菌活性及其机制体外和已”,普罗斯一体，第7卷，第5期7、Article ID e40135,2012。视图:出版商网站|谷歌学术
50. G. Wang, K. W. Buckheit, B. Mishra, T. Lushnikova, R. Buckheit，和R. De Novo，“具有不同环路结构的抗病毒和抗菌肽的设计”，艾滋病与临床研究杂志，卷。52，pp。36-41,2011。视图:谷歌学术
51. c.p. Chalekson, M. W. Neumeister, J. Jaynes，《用抗菌肽D2A21治疗感染伤口》，创伤杂志:损伤，感染和重症护理，卷。54，没有。4，第770-774，2003。视图:出版商网站|谷歌学术
52. A. Trotti, A. Garden, P. Warde等，“在头颈部恶性肿瘤放疗患者中，一项多国、随机III期试验:盐酸伊甘南口服液降低口腔黏膜炎的严重程度。”国际辐射肿瘤学杂志^*生物学^*物理，卷。58，不。3，第674-681，2004。视图:出版商网站|谷歌学术
53. A.Giuliani，G.波形和S. Nicoletto，“抗菌肽肽：概述了一个有前途的治疗阶级，”打开生命科学，第二卷，第一期，第1-33页，2007年。视图:出版商网站|谷歌学术
54. E. Breukink和B. de Kruijff，“乳酸链球菌素，是不是一个特例?”生物化学与生物物理学报，卷。1462，没有。1-2，第223-234，1999。视图:出版商网站|谷歌学术

版权

版权所有©2020 Marius B. Tincho等人。这是分布下的开放式访问文章知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。