文摘

益生菌是活的微生物,在消耗大量食物一起促进消费者的健康。本研究的目的是评估在体外乳酸菌的益生菌特性(实验室)与传统的埃塞俄比亚发酵画眉草injera面团,因此,Kocho产品。共有90个实验室被孤立,其中4例(4.44%)隔离显示45.35 -97.11%和38.40 -90.49%存活率在pH值(2、2.5、3)3和6 h,在秩序。四个耐酸隔离被发现宽容胆汁盐0.3% 24 h和91.37 - 97.22%的生存。acid-and-bile耐盐实验室发现隔离抑制一些食源性致病菌不同程度进行测试。所有acid-and-bile-tolerant隔离表现出对不同抗生素的敏感性不同。的在体外坚持不锈钢板4实验室筛选益生菌分离株的粘附率范围从32.75到36.30%。四个有效益生菌实验室属于隔离乳酸菌物种被确定使用的应变水平16 s rDNA基因序列比较,即是乳杆菌应变CIP 103151,乳酸菌paracasei无性系种群。tolerans应变NBRC 15906,乳酸菌paracasei应变NBRC 15889,乳杆菌应变JCM 1149。这四个乳酸菌生产益生菌菌株被发现是潜在有用的产品。

1。介绍

在世界范围内,各种发酵食品生产,这对许多人的饮食作出了重大贡献1]。发酵食品是用来描述一个特殊的类碳水化合物的食品的特点是各种故障在益生菌微生物的存在,但很少是碳水化合物的唯一组成部分采取行动(2]。发酵食品和饮料产品不仅已成为营养的来源,也是功能和益生菌的食物,除了营养价值有健康的影响或提供防止食源性疾病。

食源性疾病的问题(增)是多因素疾病,及其预防和控制需要多学科的方法,涉及人类有益的活微生物(益生菌)为了消除这些病原体及其相关健康风险(3]。几个在体外研究表明,食源性致病微生物的生长是由益生菌乳酸菌抑制(4- - - - - -6]。消费大量的益生菌活微生物与食品一起从根本上促进消费者的健康(7]。乳酸菌(LAB)属于一种种类繁多的微生物包括革兰氏阳性、耐氧的,耐酸,通常nonsporulating nonrespiring杆或球菌微生物,并在发酵的过程中发挥重要作用的食物通过抑制腐败/致病性细菌和生产优秀的味道,香气,纹理的发酵食品8,9]。一些实验室益生菌,和其他人可能潜在的益生菌或发酵文化,广泛分布在自然界中,可用于食品工业10]。

实验室可以从多种来源孤立如奶制品、发酵食品、动物内脏或淡水鱼类,土壤样本,甘蔗植物,和家禽农场11]。最常见的类型的益生菌实验室包括不同乳酸菌spp。(磅嗜酸的,磅johnsonii,磅干酪乳杆菌,磅喂食,磅gasseri,这种磅),属双歧杆菌(男朋友。bifidum,男朋友。animalis无性系种群。lactis,男朋友。longum无性系种群。longum,男朋友。longum无性系种群。对象的)[12,13]。实验室也非常有用的治疗各种疾病引起的耐药致病微生物(14]。益生菌微生物可能提供营养,提高增长,产生酶,抑制病原体,增强免疫反应(15]。

在埃塞俄比亚,传统发酵食品准备在家庭层面,这些发酵食品的消费通常练习。因此,一些研究孤立和筛选抗菌生产乳酸菌从传统发酵食品是由许多工人16,17]。同样,Tesfaye et al。4]显示乳酸细菌菌株的拮抗效应作为纯或定义的混合文化在发酵过程中对一些食源性致病菌和存储发酵的牛奶。然而,仍然有一些研究数据描述的益生菌实验室。大多数埃塞俄比亚传统发酵产品的消耗没有进一步加热处理可视为理想车辆携带益生菌进入人类胃肠道。

益生菌菌株与传统发酵食品和饮料可以大规模生产的应用程序作为起动文化传统产品和有一个理想的功能属性的应用程序作为益生菌对食源性致病菌。因此,本研究试图评估在体外益生菌特性的实验室分离出三个埃塞俄比亚传统发酵食品等画眉草面团,因此,Kocho对其潜在益生菌特性对一些食源性致病菌。

2。材料和方法

2.1。样品收集

传统发酵食品(画眉草面团,Kocho,因此)从亚的斯亚贝巴及其周边地区,埃塞俄比亚。每个样本(200克)使用消毒无菌收集容器。样品被带到实验室和一个冰盒存储在冰箱+ 4°C到进行了进一步分析。因此是一个本地发酵奶产品。画眉草面团发酵画眉草(Eragrostis微软)面粉用于准备和许多眼睛被称为薄薄饼样产品injera。Kocho是一个产品准备去皮质和捣碎果肉enset植物(象腿ventricosum),这是进一步混合,捏成一个糖化和发酵的坑里。

2.2。隔离和净化实验室的传统发酵食品

隔离的实验室,25毫升或25 g的每个示例的传统发酵食品(画眉草面团,Kocho和因此)和225毫升的单独的无菌蛋白胨水0.1% (W / V)。然后,顺序十进制稀释的匀浆。从适当的稀释,0.1毫升整除的传播复制predried表面镀夫人(德曼、Rogosa和锋利)琼脂(Oxoid Basingstok,汉普郡,英格兰)。接种板块是孵化在厌氧条件下使用一个厌氧罐(桶、天然气Pak厌氧系统)在37°C 48小时。然后,10 - 20的殖民地被随机选择从可数夫人板块进一步净化。孤立的殖民地的实验室转移到大约5毫升汤夫人(Oxoid)和净化重复裸奔在琼脂夫人。纯文化实验室被飞跑到偏夫人琼脂和存储+ 4°C作进一步鉴定(18]。

2.3。确认测试的实验室分离

2.3.1。KOH测试

KOH测试被用来确定实验室分离的革兰氏反应。实验室文化是生长在琼脂在37°C夫人在厌氧条件下24小时。下降3%水KOH被放在一个干净的幻灯片。使用无菌循环,可见细胞从新鲜文化都被转移到KOH下降了3%。细胞和KOH混合彻底在幻灯片上,不断搅拌在一个面积约1 - 2厘米²。隔离,没有给出粘质的产品,选择从乳酸菌(实验室)被称为革兰氏阳性细胞(19]。

2.3.2。过氧化氢酶试验

一夜之间文化的隔离种植在琼脂+ 37°C的夫人在厌氧条件下24小时。过氧化氢酶的测试是由滴两滴过氧化氢(3%)24日h-old文化载玻片上。过氧化氢酶测试显示阳性反应的特点是氧气泡的形成表明过氧化氢酶酶的生产测试细菌。因此,隔离,没有气泡,被选为后续活动。

2.3.3。芽孢染色

革兰氏阳性和catalase-negative隔离种植在琼脂+ 37°C的夫人在厌氧条件下24小时。spore-staining过程应用(20.]。spore-staining技术后,内生孢子配方使用油浸在光学显微镜下检查目标。的隔离没有形成内孢子被选作进一步分析。

2.4。体外益生菌特性的表征

益生菌的体外分析常用的方法低pH值属性包括宽容,宽容对胆汁盐,抗生素敏感性,抗菌活性,细菌坚持染色钢板。

2.4.1。耐低pH值

一夜之间隔离种植分别在5毫升汤夫人在厌氧条件下+ 37°C。一卷1毫升的日志7 CFU /毫升每个overnight-grown文化被接种到10毫升的肉汤给夫人一个初始接种体级别的日志6 CFU /毫升。文化是离心机在5000 rpm 10分钟+ 4°C。球被洗两次磷酸盐缓冲剂(pH值7.2)。丸resuspended在5毫升无菌汤夫人调整pH值为2.0,2.5和3.0使用1 N·HCl模拟胃肠环境。试管是孵化3和6小时37°C。一个适当的潜伏期后,1毫升的文化是在无菌稀释9毫升磷酸盐缓冲剂(σ,圣路易斯,密苏里州美国)准备根据制造商的指令(0.1米,pH值6.2)为了中和酸性媒介。简单地说,一个100μl整除文化及其系列稀释10倍镀在琼脂培养基夫人。接种板块在37°C孵化24至48 h在厌氧条件下使用一个厌氧罐(桶、气包系统)。殖民地被表示为菌落生长实验室每毫升(CFU /毫升)。积极控制组成的普通肉汤接种文化是使用[夫人21]。存活率的百分比计算实验室殖民地种植在琼脂夫人相比,最初的细菌浓度: 在哪里N₁孵化后的活菌数是隔离,N₀是最初的活菌数。

2.4.2。耐胆盐

估计胆汁耐酸公差实验室(这些只生长在pH值2.0,2.5,和/或3.0),该菌分别种植在汤夫人在37°C在厌氧条件下(21]。每种文化的初始浓度10⁶CFU /毫升然后在5000转离心10分钟在4°C。颗粒在phosphate-saline洗两次缓冲区(PBS pH值7.2)。细胞颗粒在无菌resuspended汤夫人补充0.3% (w / v)胆汁盐(美国牛胆汁)。采集标本在24小时发作的潜伏期确定细胞如前所述的生存能力(21]。积极控制组成的纯汤夫人没有胆汁盐与每个单独接种文化同时设置。适当的孵化后,1毫升的每个单独的文化分别稀释在无菌9毫升磷酸盐缓冲剂(美国圣路易斯σ)准备根据制造商的指令(0.1 M, pH值6.2)为了消除媒介。简洁,一个100μl整除文化及其系列稀释10倍夫人被镀在琼脂培养基。盘子在37°C孵化24至48 h在厌氧条件下使用一个厌氧罐(桶、气包系统)。实验室在菌落数量表示每毫升(CFU /毫升)。存活率的百分比计算实验室殖民地种植在琼脂夫人相比,最初的细菌浓度: 在哪里N₁孵化后的活菌数是隔离,N₀是最初的活菌数。

2.4.3。抗菌活性

acid-bile-tolerant实验室的抗菌活性菌株对一些食源性致病菌决心使用agar-well扩散法和一些修改的协议表示丰塔纳等。22]。测试生物体(金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,单核细胞增多性李斯特氏菌(临床分离),鼠伤寒沙门氏菌,大肠杆菌写明ATCC 25922)从埃塞俄比亚获得公共卫生研究所(EPHI),埃塞俄比亚的亚的斯亚贝巴。

选中acid-bile-tolerant实验室分离从偏接种到新鲜的汤夫人含有1%葡萄糖和孵化一夜之间在37°C。每个隔离的隔夜活跃文化肉汤是离心机分别在5000 rpm 10分钟4°C。每个单独的上层清液游离文化收集作为对抗研究的粗提取液对选定的食源性致病菌。食源性致病菌的纯培养接种从偏到脑心浸液肉汤。24小时孵化后37°C, 100卷μl培养液的每一个指标细菌在营养琼脂板的表面均匀擦洗用无菌棉拭子。盘子被允许干,无菌软木钻孔机(直径5毫米)是用于切割均匀井琼脂。每一个充满了100年μl培养自由滤液从每个acid-bile-tolerant实验室分离。在37°C孵化后24至48小时,板块观察区域的抑制(ZOI)。抑菌圈的直径测量卡尺在毫米,和一个明确的区1毫米或更多的被认为是积极的抑制(23,24]。实验进行了一式三份,和活动报道的直径ZOI±SD。

2.4.4。抗生素敏感性测试

每个acid-bile-tolerant和敌对的乳酸菌的分离是评估为阀瓣的抗生素耐药性扩散法描述Zhang et al。25对一些抗生素,包括氨苄青霉素(10μ红霉素(15 g / ml)μ链霉素(10 g / ml)μg / ml),卡那霉素(25μg / ml),四环素(30μg / ml)。因此,100卷μl积极发展文化的每个acid-bile-tolerant和敌对的乳酸菌在营养琼脂板的表面均匀擦洗用无菌棉拭子。干燥后,抗生素光盘被放置在固化琼脂表面,和盘子离开在4°C为30分钟抗生素的扩散,然后在37°C厌氧孵化24至48 h。电阻的定义根据阀瓣扩散法通过使用上述抗生素光盘,和抑制区使用卡尺测量的直径(26];欧元区每个抗生素的抑制(毫米)直径的测量,并表示作为敏感,年代(≥21毫米);中间,我(16 - 20 mm)和阻力,R(≤15毫米)。

2.4.5。细菌粘附不锈钢板

acid-bile-tolerant依从性分析的、敌对的和antibiotic-sensitive乳酸细菌隔离决心在不锈钢板的一些修改协议由El-Jeni et al。27]。简单地说,实验室培养无菌汤夫人。此后,隔夜细菌培养(500μl)沉积在试管中,然后满450μl(汤夫人,在无菌不锈钢板沉积,和试管培养24小时在37°C。不锈钢板是在无菌条件下,用10毫升无菌1%蛋白胨水,洗净,在无菌1%蛋白胨水5分钟管。板在相同条件下然后再洗,涡3分钟在无菌1%蛋白胨水管(6毫升)连续分离的细菌细胞坚持钢板表面。细胞数量是由指望夫人琼脂孵化24小时后在37°C。同时,初始细胞总数估计来计算每个实验室粘细菌细胞的百分比。

2.5。形态学、生物化学和生理测试

益生菌实验室隔离被确定根据他们的形态,生理,生化特征基于Bergey手册(28]。

2.5.1。细胞形态

一夜之间文化是湿的安装在显微镜幻灯片和光学显微镜下检查使用油浸的目标。细胞形态学标准被认为是考试期间细胞形态和细胞的安排。

2.5.2。生长在不同的温度下

一夜之间的每个实验室文化50μl被分为四个独立的管,包含5毫升介质(修改汤夫人)包含bromecresol紫色指标浓度为0.12 g / l。接种后,两个接种试管培养7天,15°C和其他两个试管在45°C。在这孕育时间,增长在任何温度下被观察到生长介质的变化(文化)从紫色到黄色。

2.5.3。生长在不同氯化钠浓度

实验室分离检测他们的宽容不同氯化钠浓度。为此,4%和6.5%氯化钠浓度是用于测试。同样,试管5毫升的修改包含bromecresol汤夫人紫色指标准备根据适当的浓度。四个试管4%氯化钠和其他四个试管与6.5%生理盐水分别接种50μl 1%的每一夜之间文化实验室和孵化+ 37°C的7天。颜色从紫色到黄色的变化被认为是细胞生长的证据。

2.5.4。精氨酸水解试验

精氨酸包含介质夫人和奈斯勒试剂(HgI。负责₄K₂),0.09 mol / L tetraiodomercurate钾溶液(2)(K₂[HgI₄)在2.5 mol / L氢氧化钾,为了测试使用氨生产从精氨酸。夫人包含0.3%盐酸精氨酸转移到复制管5毫升和接种量为1%在一夜之间文化实验室。此后,管在孵化+ 37°C 24 h。一个100µl的文化都被转移到一个白色背景。此后,相同数量的奈斯勒试剂是用移液器吸取文化。颜色明亮的橙色的变化表明积极的反应,而黄色表示负面反应。消极的控制,不含精氨酸,用作负控制。

2.5.5。天然气生产的葡萄糖

为了确定homofermentative和异型发酵实验室分离的特点,有限公司₂夫人生产葡萄糖测定的修改包含反向杜伦管以1%葡萄糖肉汤。汤夫人(8毫升)在不同管含有1%葡萄糖倒杜伦管准备与单独接种50µl 1%的隔夜新鲜实验室文化。那么试管被孵化+ 37°C 5天。气体的存在在杜伦管5天的观察显示有限公司₂生产葡萄糖。

2.6。益生菌鉴定实验室隔离使用16 s rRNA基因测序

2.6.1。基因组DNA提取

基因组DNA提取纯文化(n= 4)潜在的益生菌实验室。另外,1毫升的纯液体培养是离心机在10000转3分钟。上层清液被免职,细胞resuspended在300年µl缓冲区(10毫米Tris-HCl, pH值8.0;50 mM葡萄糖,10毫米EDTA)。悬架,3µl溶菌酶(10毫克/毫升)补充道,和细胞细胞溶解在37°C下60分钟偶尔搅拌管内容通过推翻它。赖氨酸缓冲区(20 mM Tris-HCl, pH值8.0;75毫米氯化钠;1% SDS;10毫米EDTA) 300µl和3µl核糖核酸酶(10毫克/毫升)被添加到混合物中。的混合是在37°C的环境中30分钟,然后在冰上冷却1分钟。然后,100年µl醋酸铵溶液(7.5米)被添加到混合,混合在一个漩涡20秒,在13000转离心5分钟。上层清液转移到清洁1.5毫升管,和300年μl异丙醇是补充道。此后,混合物被推翻混合1分钟和存储−20°C为30分钟。的混合物在13000转离心5分钟。上层清液提供准确,和管推翻放在一个干净的过滤器。然后,400年µl 70%的乙醇和混合添加了几次的推翻洗DNA沉积物。最后,沉积物是在37°C干15分钟直到乙醇滴完全消失了。干沙是溶解在30岁µl TE缓冲。

2.6.2。16 s rDNA的PCR扩增

放大的16 s rDNA基因的特定引物AMP_F 5′- GAG AGT TTG ATY CTG GCT CAG 3′和AMP_R 5′-亚美大陆煤层气有限公司GAG GTG ATC汽车20 CA 3′。PCR反应混合物是由混合25µ标记的l 2 x大师混合(缓冲区,聚合酶和核苷酸),正向引物1µl,反向引物1µl,大学₂O 22µl。然后,49µl的混合物加入无菌PCR管,和1µl gDNA用作模板;放大反应进行了热循环(Bio-Rad Mycycler)。

2.6.3。DNA电泳

PCR产品在1%的琼脂糖凝胶分离和溴化乙锭染色之后,检查紫外线照明器,数码相机和图像捕获。

2.6.4。测序的PCR产物

16 s rRNA PCR扩增和测序是由欧陆坊,Novogene(香港)。V4高变区16 s rRNA的放大使用特定引物515 f - 806 r。所有PCR反应进行了与Phusion®高保真PCR反应混合液(新英格兰生物学实验室)。生成的库与TruSeq DNA PCR-Free样品制备设备使用paired-end Illumina公司测序序列(2×250个基点)HiSeq2500平台上(美国Illumina公司)。

2.6.5。系统发育分析

正向和反向序列组装和使用BioEdit序列比对编辑器来编辑5.0.9版本。序列相似性估计通过搜索基因库的同源性DNA数据库使用爆炸。最后,基于标识的隔离是序列。

进化历史推断使用neighbor-joining方法(29日]。最优树分支长度之和= 0.19972900所示。的比例复制的树分类群聚集在一起,引导相关测试(1000复制)旁边的树枝。树是按比例画,分支长度在同一单位的进化距离用来推断系统发育树。进化距离计算使用可能性最大的综合方法,在基地的数量的单位替换/网站。所有职位包含漏洞和缺失的数据都消除了。总共有891个职位在最终的数据集。进化在MEGA7进行了分析。

2.6.6。统计分析

所有的测量进行了一式三份,结果表示为平均值的标准偏差(SD)。单向方差分析分析的数据加上事后邓肯的测试通过SAS软件(版本。9.2、罗利数控)。系统发育树准备使用MEGA7(版本7.0)。确定统计学意义 。

3所示。结果

3.1。孤立潜在的益生菌乳酸菌从传统发酵食品

从每个样本共计90(30)乳酸菌分离得到三个不同的传统发酵埃塞俄比亚食品(画眉草面团,因此,Kocho)。其中,56例(62.22%)分离革兰氏阳性发现,endospore-negative, catalase-negative。

3.2。形态学、生物化学和生理特征

4 acid-bile-tolerant实验室隔离被确定通过形态学、生物化学和生理特性(表1)。所有的隔离都直杆状,能够增长4%氯化钠盐浓度。从4 acid-bile-tolerant实验室隔离,隔离的3被发现氯化钠盐浓度6.5%的速度增长。测试隔离的能力增长15°C和45°C表示,3的隔离可以增长15°C和45°C(表1)。相反,隔离E031没有发现增长45°C。

2 4 acid-bile-tolerant隔离,隔离(T035和K011)产生的气体从葡萄糖(表1)。因此,四个隔离被发现同样分为homofermentative和异型发酵类型(50:50)(表1)。关于精氨酸水解测试、隔离E031 T035,和精氨酸水解K011被发现阳性,而E052无法水解(表1)。

3.3。体外益生菌特性的表征

3.3.1。耐低pH值

56隔离,4隔离(7.14%)、4隔离(7.14%),和9隔离(16.07%)容忍pH值的2.5,分别和3对3 h(表2)。在进一步延长潜伏期6 h, 8隔离(每4测试pH值2.0和2.5)幸存下来,而只有5幸存下来从9潜伏期的延长到6 h(表3.0 pH值2)。

因此,总56的实验室分离,4(7.14%)隔离幸存pH值2.0,2.5,和3.0曝光3和6小时后,和治疗的平均值明显不同(表3)。其中,1例(25%)从每个孤立画眉草生面团,Kocho样本。而且,2例(50%)实验室文化隔绝因此样本。一般来说,分离株的存活率在不同pH值范围从38.40到97.11%(表3和6 h潜伏期3)。隔离,就像E052、K011 T035发现高度宽容和坚持50%以上为3和6个小时。相反,隔离K031无法增长50%以上在pH值2.0曝光3和6 h(表3)。虽然分离株的存活率明显降低pH值2.0 6 h接触,所有的隔离被带到下一个实验。

3.3.2。耐胆盐

所有4实验室分离(E052、E031 K011和T035)能够生存在90%以上的胆汁盐(表的0.3%3)。隔离E031是最宽容的存活率为97.22%其次是隔离E052和K031存活率为93.62%和93.38%,分别。然而,隔离T035显示,91.37%存活率(表3)。

3.3.3。抗菌活动

直径粗提取物的抑制区显示每个隔离了抗菌效果对每个检测食源性病原体(表4)。抑制的平均区域的粗提取物抑制检测食源性致病菌的生长被发现介于17到21毫米。隔离T035显示最高敌对活动金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,单核细胞增多性李斯特氏菌(临床分离),大肠杆菌写明ATCC 25922,鼠伤寒沙门氏菌与抑菌圈直径范围从19.33到21毫米。然而,E052显示最低抑菌圈的直径从对微生物指标(表17 - 19毫米4)。

3.3.4。抗生素敏感性试验

依从性能力的潜在益生菌实验室之间的隔离等被发现(表32.75和36.30%4)。隔离K011显示,依从率(36.30%)最高,其次为隔离T035和E052依从率33.48%和33.17%,分别。然而,隔离E031显示最少(32.75%)依从率(表4)。

3.3.5。细菌粘附不锈钢板

抗生素敏感性试验所选的实验室分离出一些常见的抗生素四环素敏感性,氨苄西林、红霉素。然而,所有4潜在益生菌实验室分离抗卡那霉素、链霉素(表显示5)。

3.3.6。益生菌鉴定实验室分离16 s rRNA基因测序

4 16 s rRNA基因序列的实验室分离的最佳潜在益生菌属性显示已知物种的同源性最高的细菌在数据库中(图1)。因此,与E052显示99%乳杆菌1149年应变JCM T035显示99%的同源性乳杆菌应变CIP 103151年K011显示,95%相似乳酸菌paracasei无性系种群。tolerans应变NBRC 15906, E031显示99%的同源性乳酸菌paracasei应变NBRC 15889(图1)。

4所示。讨论

益生菌的研究活动,对应用程序保存食品和人类健康,还有待极大的兴趣。目前,益生菌的拮抗特性实验室对食源性致病菌的兴趣已表示他们潜在的可能替代化学药物(30.]。因此,已经付出了大量努力,选择乳酸细菌来自埃塞俄比亚传统发酵食品的基础上最重要的技术,功能,和安全标准以获得潜在的益生菌乳酸菌。

所有选定的四个潜在益生菌被鉴定为实验室基于形态学、生物化学和生理特征被发现同样分为homofermentative和异型发酵类型。这一发现是依照乳房et al。31日人孤立乳酸菌物种因此并发现他们分组homofermentative和异型发酵类型。Akalu et al。17)也报道称益生菌实验室隔绝Shamita和Kocho确定了形态、生化反应和生理上和由异型发酵和homofermentative类型。Azadnia和Nazer汗32)报道,传统喝酸奶的乳酸菌孤立部落的法尔斯省能够增长4% NaCl浓度但不是在6.5% NaCl浓度。

在目前的研究中,56个益生菌的实验室分离测试pH值2 3和6 h,只有4(7.14%)隔离显示宽容pH为6小时(表21)。因此,宽容的四个乳酸菌种虫害pH值2.0 6 h显示生存率为38.40到73.29%。类似的研究中,Mourad和Nour-Eddine [33)表明,乳杆菌OL12,l .杆菌OL9,l .杆菌OL15,l .杆菌OL33隔绝发酵橄榄显示生存百分比为55%,49%,65%和57%,分别暴露在pH值为2.0 2 h。然而,这些结果并不符合这些报道Akalu et al。17)和Rajoka et al。34)表示,大多数菌株磅杆菌从不同来源分离显示成活率80%以上在pH值2 3 h。其他报告显示,5耐酸乳酸菌菌株显示89%以上存活率在暴露于pH值2 3 h [35]。Akalu et al。17)验证,14/17乳酸菌从传统的发酵菌株分离Shamita和Kocho被发现宽容pH值2当孵化6 h存活率为74 - 89%。然而,孵化在低pH值导致所有实验室的存活率显著降低隔离在另一项研究指出,郭et al。36]。作者指出,乳酸菌的可行的计数明显受到低酸度的影响,特别是在pH值2。

在这项研究中,56个益生菌的实验室分离,只有4(7.14%)的隔离是宽容的pH值为2.5(表3和6 h1)。同样,56个实验室分离,9隔离(16.1%)和5隔离(8.93%)幸存下来在pH值为3和6 h,分别。因此,四的存活率乳酸菌菌株在pH值为2.5和3 3和6 h被发现宽容不同存活率-97.11%(77.98)和(65.58 - -90.49%),分别为(表2)。同样,Akalu et al。17)报道,在30个实验室隔绝埃塞俄比亚传统发酵饮料和食物(Shamita和Kocho17),乳酸杆菌显示82 97%和81 91%存活率在pH值为2.5和3 3和6 h,分别。这也是类似的报告哦,荣格(35)显示一个更好的存活率(88%以上)乳酸菌物种在pH值2.5和3对3 h Omegisool隔绝,传统发酵小米朝鲜的酒精饮料。据Haghshenas et al。37),乳酸菌菌株从伊朗分离发酵乳制品中幸存下来在pH值为2.5(71%对76%)3 h。从之前的调查,人们普遍认为一个隔离与充分宽容pH值为3.0 3 h与前途的益生菌可以视为high-acid-resistant应变特性(36,38]。最近,唐et al。39)报道,所有的9乳杆菌菌株恢复从哺乳仔猪的粪便被发现是非常宽容的pH值3对3 h。

目前的结果是相反的乳房et al。31日)发现低到高存活率(1.03 - -100%)6乳酸菌物种在pH值2.5和3.0 3 h。相同的作者表示,最大的6株的存活率22.5%,pH值3 6 h。然而,完全丧失生存能力的乳酸杆菌孤立的从传统的埃塞俄比亚因此被记录在pH值为2.5 6 h (31日]。此外,当前的存活率高于之前报道等乳杆菌在pH值为2和3 6 h暴露(33]。4耐酸实验室分离显示高耐胆汁盐(91.37%对97.22%)(表条件3)。胆汁盐耐受性也被认为是一个重要的选择标准益生菌分离株为了生存在小肠的条件。此外,耐高胆汁盐条件也紧张具体演示了早些时候不同的地方乳酸菌物种Omegisool隔绝,传统上小米发酵酒精饮料在韩国显示相当大的公差胆汁盐(35]。类似于现在的发现,在其他的研究结果显示,所有显示的分离株高耐胆汁盐条件和的存活率乳酸菌压力范围从88%到92% (37]。在一个相关的研究中,Akalu et al。17)也显示出30个测试实验室的隔离,17岁乳酸菌从埃塞俄比亚传统发酵获得的隔离Shamita和Kocho显示非常高耐胆汁盐环境包含0.3%。相反,博客等。40)表明,乳酸菌菌株B3, G12 A13, 22日表现出低水平的耐胆汁盐存活率为36% 0.3%,33%,3%,和3%,分别。符合这翰达岛(41)报道称,所有的实验室分离表现出低水平的耐胆盐通过显示幸存的百分比小于50%当暴露于0.3%胆汁盐24 h后37°C。

所选的四个潜在益生菌乳酸细菌菌株(乳杆菌JCM 1149株,乳杆菌应变CIP 103151,乳酸菌paracasei无性系种群。tolerans应变NBRC 15906,乳酸菌paracasei应变NBRC 15889)表现出不同程度的对抗单核细胞增多性李斯特氏菌金黄色葡萄球菌,沙门氏菌Typimurium,大肠杆菌(表4)。根据翰达岛(2012),隔离间隙区≤9毫米,≥12毫米直径对病原体测试表明贫穷和强大的抗菌活性,分别。因此,所有选择的实验室潜在的益生菌菌株(n= 4)表现出强烈的抗菌活性对食源性致病菌T035 (乳杆菌应变CIP 103151)显示最高的敌对活动金黄色葡萄球菌,单核细胞增多性李斯特氏菌,大肠杆菌,美国沙门氏菌感染与抑菌圈直径范围从19.33到21毫米。

根据当前的研究中,Bassyouni et al。42显示所有的乳酸菌隔离从埃及获得乳制品有很强的抗菌效果大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。然而,在结果所揭示出的相同的作者,3隔离最强有力的抗菌活性与病原微生物检测与抑制带范围从17到21毫米直径。在本研究协议,特et al。5)验证所有的实验室分离(n起源于= 118)博德和Shamita属于属乳酸菌,Lactococcus,明串珠菌属,链球菌被发现抑制等测试菌株的生长吗金黄色葡萄球菌,沙门氏菌spp。,大肠杆菌O157: H7的抑制区范围从15到17毫米直径。符合这一点,崔et al。43)报道,4株的实验室乳酸菌应变完全抑制食源性致病菌的生长,大肠杆菌O157: H7写明ATCC 35150,肠炎沙门氏菌KCCM 12021,鼠伤寒沙门氏菌KCTC 1925,金黄色葡萄球菌。Tigu et al。16)也显示出11益生菌实验室隔绝埃塞俄比亚传统发酵调味品,即达塔和Awaze,2乳酸菌隔离抑制的增长沙门氏菌typimurium和大肠杆菌抑制区从10.3到14.3毫米直径。符合这一点,Haghshenas et al。37)报道,在选择8实验室隔绝伊朗发酵乳制品,乳酸菌物种,特别是磅杆菌15 hn,显示最有效的对抗活动金黄色葡萄球菌,单核细胞增多性李斯特氏菌,沙门氏菌typimurium,大肠杆菌抑制区为11.7,13.7,12.3,和12.3毫米直径。同样,Rajoka et al。34),所有的验证乳杆菌从人类分离牛奶抑制的增长金黄色葡萄球菌,沙门氏菌typimurium,大肠杆菌使用agar-well扩散法和可变直径(6毫米至14毫米)。

差距在对抗活动针对不同病原体高度pathogen-specific表明益生菌菌株和益生菌的潜在的先决条件。一般来说,益生菌的抗菌活性可能是由于生产抗菌化合物如有机酸、乙醇、二氧化碳、过氧化氢、短链脂肪酸、细菌素。因此,这些抗菌化合物,通过生产益生菌微生物胜过其他微生物生存的不利条件下胃肠道(41]。

所有的四个测试乳酸菌菌株被发现抗链霉素和卡那霉素敏感对四环素、氨苄青霉素、红霉素(表5)。这些结果与获得的结果中发现协议使用乳酸菌物种(34]。Tigu et al。16)也报告说,所有的实验室分离获得从传统发酵调味品等达塔和Awaze是容易受到氨苄青霉素、红霉素和四环素。同样,根据Amraii et al。44),所有选择的实验室分离株对氨苄青霉素敏感,红霉素、四环素。相反,Sukmarini et al。45)报道,120隔离的实验室从四个不同的印尼传统的发酵食品,16隔离对红霉素耐药。符合这一点,锅等。46)中观察到12乳酸菌物种从中国获得发酵食品,5隔离对卡那霉素敏感,7对红霉素耐药,耐氨苄青霉素,和8个分离株耐四环素。

益生菌的主要重要特征之一,粘附肠道粘膜是必需的。目前的结果表明,实验室筛选益生菌分离株在体外坚持财产不锈钢板粘附率从32.75到36.30%(表4)。与本研究协议,El-Jeni et al。27)报道,乳酸细菌的粘附率不锈钢板范围从32到35%。Winkelstroter et al。47)也显示纯培养的磅。sakei写明ATCC 15521显示强烈坚持不锈钢表面。一般来说,这表明,我们的实验室潜在的益生菌分离株可能潜在的能力在胃肠道(GI)呼吸道粘膜。

系统发育分析和分配的16 s rDNA测序实验室分离益生菌属属性乳酸菌,确定物种乳杆菌JCM 1149株,乳酸菌paracasei应变NBRC 15889,乳杆菌应变CIP 103151,乳酸菌paracasei无性系种群。tolerans应变NBRC 15906(图1)。据Shokryazdan et al。48),比较16 s rRNA基因分析的结果显示实验室分离属于l .嗜酸的酵母,l . buchneri,l .干酪乳杆菌。此外,赵、李和Hahm [49)已经确定了乳酸菌与潜在的益生菌菌株特性从哺乳仔猪的粪便使用16 s rRNA基因分析。同样,其他近期研究(Dowarah et al。6]显示应变水平的识别不同乳酸菌具有强有力的益生菌特性的隔绝一些基质使用16 s rDNA基因的系统发育评估。

5。结论

在目前的研究中,四个乳酸菌分离菌因此,Kocho,画眉草面团被发现有潜在益生菌的特点。建议这些菌株可以适合使用食品行业潜在益生菌文化与其他人类健康的好处。然而,需要进一步的研究来评估在活的有机体内这些潜在的乳酸菌益生菌特征。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果都包含在这篇文章,可以从相应的作者(SAS数据)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认微生物、细胞和分子生物学亚的斯亚贝巴大学的部门和部门的食品和环境科学,芬兰赫尔辛基大学提供的实验室设施、生物学系,自然科学和计算科学学院,阿克苏姆大学、埃塞俄比亚、金融支持、和埃塞俄比亚的公共卫生研究所(EPHI),亚的斯亚贝巴,埃塞俄比亚,提供测试生物体。作者也感谢卫斯理Morovic博士科学家,应变发现和微生物科学,杜邦营养和生物科学,芬兰,16 s rDNA分析中对他的支持。

补充材料

三个(画眉草面团,因此,Kocho埃塞俄比亚)传统发酵食品被用作隔离源。隔离被指定为E因此T为画眉草面团,和KKocho,然后用不同的数字。一般而言,上述传统发酵食品准备在家庭层面和他们的消费在全国普遍实行。(补充材料)