2015/16冬季流感儿童繁殖儿童的病因

摘要

急性呼吸道感染是尼泊尔等发展中国家的主要公共卫生问题之一。除了流感，其他几种病原体也会导致儿童急性呼吸道感染。在临床管理过程中，感染的病原学特征不明确，因此使用经验的抗菌药物。本研究的目的是通过实时荧光定量PCR检测流感和其他呼吸道病原体。选取尼泊尔国家流感中心2015/16冬季收集的175例流感阳性病例咽拭子标本，用于检测其他呼吸道病原体。采用Pure Link病毒RNA/DNA迷你试剂盒(Invitrogen)提取总核酸，进行多重RT-PCR检测。甲型流感和乙型流感病毒分别检出120份(68.6%)和55份(31.4%)，其中合并感染106份(60.6%)。其中A/H1N1 pdm09亚型25例(20.8%)，A/H3亚型95例(79.2%)。儿童中经常与流感病毒同时感染的病毒有鼻病毒(26;呼吸道合胞病毒A/B型(19例; 10.8%), adenovirus (14; 8.0%), coronavirus (CoV)-HKU1 (14; 8.0%), CoV-OC43 (5; 2.9%), CoV-229E (2; 1.1%), metapneumovirus A/B (5; 2.9%), bocavirus (6; 3.4%), enterovirus (5; 2.9%), parainfluenza virus-1 (3; 1.7%), and parainfluenza virus-3 (2; 1.1%). Coinfection of肺炎支原体在儿童（5; 2.8％）中发现了流感病毒。大多数病毒感染发生在5岁以下的幼儿中。除了流感病毒外，检测到九种不同的呼吸道病原体，其中鼻病毒和呼吸道同胞病毒A / B的共键主要被发现。本研究为我们提供了有关呼吸道病原体谱和辛纤维组合的更好信息，这对ARIS的诊断和治疗很重要。

1.介绍

ARIs是儿童死亡和发病的主要原因之一，特别是在发展中国家[1]世界卫生组织（WHO）估计每年有190万儿童死于呼吸道感染（RTI），主要是非洲和东南亚国家的肺炎[2].发达国家和尼泊尔等发展中国家之间流感样疾病（ILI）的发病率几乎相似；发展中国家的死亡率较高。非流感ARI病毒与流感病毒混合感染的频率从10%到30%不等，研究表明混合病毒感染之间的相关性可能会增加疾病的进展或临床严重程度[3.]．

全世界最常见的ARI病因包括流感病毒（InfV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、鼻病毒（RV）、偏肺病毒（MPV）、博卡病毒（BV）、腺病毒（AV）、肠病毒（EV），支原体肺炎e、副流感病毒(PIV)、冠状病毒(CoV) OC43、nl63,229e和HKU1 [4]．甲型及乙型流感病毒是冬季全球范围内引起急性呼吸道感染及严重疫情的主要原因[5]。每年仅流感病毒的流行就可在全球范围内造成5-15%的急性呼吸道感染。根据世卫组织的数据，每年流感在全球范围内造成300-500万严重病例和250000-500000人死亡[6]．

在东南亚的热带和亚热带国家，如泰国、新加坡、马来西亚和中国，与ILI相关的病原体已经有了明确的特征。然而，尼泊尔对ILI的流行病学和病因学了解甚少。尼泊尔建立了基于实验室的ILI监测系统，自2009年出现大流行性流感以来，该系统极大地促进了疫情调查、监测和及时应对。在尼泊尔传播的流感病毒与我们的邻国和地区有许多相似之处。我们报告，流感的全年传播与泰国、越南北部和老挝类似，在多雨和冬季出现活动高峰[7]．有效的检测方法对实验室诊断具有重要意义。目前，快速抗原检测、病毒培养和PCR等分子方法被用作病毒检测方法[8]．在临床环境中，快速可靠的PCR测定特别有助于制定关于患者的管理和治疗的早期决定。在这项研究中，我们试图通过患有流感样疾病病例的儿童的多重PCR测定来表征流感和其他ARI病原体。

2.材料和方法

2.1.样本采集和处理

这是一项从2015年10月至2016年2月进行的基于实验室的描述性横断面研究。在冬季访问国家流感中心（NIC）期间，从2个月至12岁有流感样疾病（ILI）症状的儿童中收集了394份咽拭子样本，尼泊尔加德满都国家公共卫生实验室。在总共175份对流感病毒呈阳性的咽拭子样本中，进一步检测了其他呼吸道共同病原。流感样疾病被定义为有发热史的急性呼吸道感染个体(≥38°C），咳嗽和/或喉咙痛，在过去10天内发作[9]．咽拭子标本采集于病毒运输介质(科潘，意大利)中，并在适当温度(2-6℃)下用三包装容器运输。标本在新加坡Esco生物安全柜中处理，用于流感等呼吸道病原体核酸提取。实时荧光定量PCR检测呼吸道病毒及其他病原体。

收集的数据包括患者的人口学特征（年龄和性别）；经实时聚合酶链反应（rRT-PCR）检测确认的流感病毒的地理位置、类型和亚型。

2.2.核酸提取和PCR扩增

根据制造商的说明，使用Purelink TM病毒RNA / DNA迷你试剂盒（Invitrogen，Thermo Fishific，USA）从喉拭子中提取总核酸（RNA / DNA）。将内部控制（IC）加入每个提取管中，以便在扩增结束时获得提取的质量。最后，50次洗脱核酸 µl的洗脱缓冲液，在−80°C保存至使用。呼吸道病原体的实时rt -PCR检测采用7500 Fast real-time PCR系统(美国Thermo Fisher scientific公司)。采用快速追踪诊断(FTD)呼吸道病原体21试剂盒(Biomerieux，卢森堡)，按照制造商的方案，采用5种多重PCR对病毒进行筛选，采用rt -PCR对提取的核酸进行筛选:流感(InfV) A- b型、流感A/H1N1型、鼻病毒(RV)、冠状病毒(CoV) OC43、NL63、229E、HKU1型、副流感病毒(PIV) 1-4型、偏肺病毒(MPV) A- b型、bocavirv (BV)型、呼吸道合胞病毒(RSV) A- b型、腺病毒(AV)型、肠道病毒(EV)型、parechovirus (PeV)型以及一种细菌性病原体:肺炎支原体．试剂盒中提供两支病毒和细菌多重PCR检测阳性对照、内控管(IC)和阴性对照管(NC)。简单地说,10µ在每种反应中，将提取的核酸的L作为模板用于FTD呼吸道病原体21在制造商的说明之后的多重PCR。热循环放大条件包括在42℃下的逆转录15分钟，在94℃下的变性3分钟，然后在94℃下持续8秒，在60℃下34秒。基于制造商的解释标准，确定试样是病原体阳性的或阴性，如果阳性和阴性对照结果不符合解释标准，则重复PCR运行。

2．3.统计分析

使用SPSS 11.5进行统计分析。生成描述性统计、频率和百分比。对合并感染病例、流感单次感染和与其他病原体合并感染的年龄分布进行了描述。

２.４.伦理批准

本研究经尼泊尔卫生研究委员会批准（reg。没有。180/2015）。

3.结果

检测了175份任何流感病毒阳性的咽拭子标本，以确定合并感染与其他可能的ARI病因。120例(68.6%)标本中检出甲型流感病毒，其中A/H1N1 pdm09型25例(20.8%)，A/H3亚型95例(79.2%)。同样，在55份(31.4%)样本中发现了B型流感病毒。在这些人中，175名儿童甲型或乙型流感病毒呈阳性;RSV A-B鼻病毒腺病毒偏肺病毒A-B副流感病毒1和3博卡病毒肺炎支原体，肠病毒，冠状病毒OC43, 229E和HKU1均被甲型和乙型流感病毒双重感染。同样，儿童同时感染肺炎支原体（桌子1）.

在本研究中，流感阳性儿童病例(n= 175）分为三个年龄的亚组和呼吸道病原体的阳性检测率，结果相当于少于5岁，6至10岁，以及10至12岁的年龄段显示在表格中2和3.. 在流感阳性病例中，与多种呼吸道病原体共同感染在5岁以下人群中占优势，其次分别为6-10岁和10-12岁人群（表1）2和3.）.

5岁以下甲型流感患儿中鼻病毒10型(5.7%)、呼吸道合胞病毒A/B 8型(4.6%)、腺病毒9型(5.1%)和冠状病毒hku1 7型(4.0%)同时感染的比例高于乙型流感阳性病例。同样，在6 - 10岁的甲型流感和乙型流感患儿中，鼻病毒6型(3.4%)、呼吸道合胞病毒A/ b4型(2.3%)、腺病毒3型(1.7%)和冠状病毒hku1 2型(1.1%)的合并感染率相对较低(见表)2和3.）.

同样，38例(21.7%)流感阳性标本同时感染了两种呼吸道病原体;21份(12.0%)样本中含有3种呼吸道病毒，9份(5.2%)样本中含有4种呼吸道病原体(见表)4）.甲型流感检出率以2015年10月至2016年1月为主。同样，B型流感感染高峰出现在2016年2月，其次是2015年10月。在2015年10月至2016年2月期间，除流感病毒外，还检测到鼻病毒、腺病毒和冠状病毒(HKU1)。呼吸道合胞病毒A-B于2015年11月至2016年2月检出，MPV A-B于2015年11月至2016年1月检出。

A/H1N1 pdm09型流感、A/H3型流感和B型流感单次感染分别为10.3、29.1和21.7%。A、B型流感与其他单病原体合并感染21.7%，双病原体合并感染12%，三病原体及以上合并感染17.2%(表)4）.

4.讨论

呼吸道病毒是急性呼吸道感染的主要原因，其中流感是尼泊尔等发达国家和发展中国家的主要公共卫生负担之一。在这项研究中，从2015年10月至2016年2月，共调查了175份流感阳性标本，以检测潜在的呼吸道病原体。我们发现证实了9种非流感呼吸道病原体与流感病毒的共同感染。其中，与鼻病毒、RSV A/B、腺病毒和CoV-HKU1病毒的共同感染率较高。关于这些病毒的流行性和季节性，可获得一些信息，主要是在尼泊尔等发展中国家，在这些国家f定期进行此类研究是不寻常的。

2015/16年冬季，流感病毒检出病例增加(44.4%)，所有流感阳性病例均采用FTD呼吸道病原体21试剂盒进行rt - pcr进一步筛查。病原体的范围及其阳性率可能因国家和时间的不同而不同[8]流感病毒是人类呼吸道感染的主要原因之一，其后果比冬季各种病毒引起的普通感冒更严重[10]．在我们以前的研究中，在尼泊尔的多雨和冬季季节期间报道了流感病例的数量增加[7]．中国山东省也有类似的发现[11]，不丹[12)、印度尼西亚(13]，以及泰国[14]．

在流感阳性标本中，鼻病毒、RSV A-B、腺病毒和CoV-HKU1病毒是最常被检测到的共同感染病原体。与我们的发现类似，Koul等人进行的一项研究表明，流感病毒和鼻病毒最常在呼吸道样本中检测到[15]．然而，RSV一直被认为是儿童上呼吸道感染和肺炎的主要病因[16尽管鼻病毒是最常被发现的。在我们的研究中，在感染流感的儿童中发现了CoV-OC43、CoV-229E、MPV A-B、bocavvirus、enterovirus和副流感病毒1和3同时感染，这在尼泊尔是少报的。

我们的研究在流感阳性病例中检测到博卡病毒、冠状病毒和肠道病毒合并感染。5岁以下儿童因肺炎死亡的大多数发生在发展中国家，有关呼吸道感染病毒原因的临床影响和严重程度的信息有限[17]．关于低收入国家严重肺炎病毒病原学的信息很少，这些国家的疾病负担特别高[18]．除少数例外情况外，对bocavvirus、冠状病毒和肠道病毒的了解有限，也缺乏有关感染危险因素的数据[19在尼泊尔]。

流感繁殖肺炎支原体(2.9%)在流感阳性儿童中发现，流感是引起儿童急性呼吸道感染和社区获得性肺炎的重要病原体[20.]．在我们的研究中，大多数病毒感染患者在比前一份报告类似的年龄超过5岁的孩子中发现了[21]．此外，ARIs在婴儿、儿童和老年人中的发病率尤其高，在低收入和中等收入国家更为明显[22]．在这项研究中，呼吸道病原体的流行率低于伊斯兰教和他的同事在印度的报告，那里ARI的流行率为26.2% [23]．

在本研究中，呼吸道病原体可分为4组:A型流感单次感染(39.4%)、B型流感(21.7%)、流感和2种病原体多重感染(21.7)、3种病原体多重感染(12.0%)、4种病原体多重感染(5.2%)。在越南进行的研究[24]，老挝人民民主共和国[25),日本(26]，荷兰[27]和印度[28]报告幼儿（<5年）中更频繁地发现单一和多种呼吸道感染。从巴西，土耳其，日本和中国报道了类似的单一和多种病原体共染素的同类和多种病原体繁殖的结果[29- - - - - -34]．

据我们所知，这可能是首次采用多重RT-PCR试剂盒检测21种呼吸道病原体A、A/H1N1、B型流感、RV、RSV A-B、PIV 1-4、冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、MPV A-B、BV、肺炎支原体最近，Ruttitnunt等人报告了从包括尼泊尔在内的东南亚国家收集的ARI病例样本中病毒病原体的检出率（71.3%）。然而，该研究涵盖了尼泊尔提供的样本中的九种病毒病原体[35]．另一项在尼泊尔西部地区进行的研究报告了RSV，流感A-B, PIV-3，肺炎链球菌，和流感嗜血杆菌通过评估医院数据库系统；然而，作者没有提到验证性检测方法[36]．

在流感阳性病例中发现多种病原体与多种呼吸道病毒合并感染的水平增加。据我们所知，这些发现是新的，而且是事先没有预料到的。这项研究表明，广泛的呼吸道病原体是尼泊尔流感阳性病例合并感染的原因。然而，由于这项研究是在一组流感阳性儿童中进行的，所以除了流感以外，其他病毒感染的比例或发生率无法说明。在临床诊断和治疗中应仔细考虑这些发现的意义。此外，呼吸道病原体单/多共感染对疾病严重程度的影响，迫切需要在未来进行完整的研究。

本研究存在研究周期短、样本数量有限、诊断试剂等局限性。由于财政拮据，我们无法全年继续学习。因此，这项研究的发现并不能反映全年的情景。同时，我们的研究无法详细探讨单次和多次并发感染的病情严重程度、住院时间、结局等临床情况，需要进一步的综合研究。

我们的发现提供了呼吸道病毒的基本信息和不同年龄组儿童的分布模式，这将有助于更好的治疗方法和有效的预防策略。此外，应密切注意年幼儿童的病毒感染。

5.结论

流感是尼泊尔冬季儿童急性呼吸道感染的主要原因之一。除流感外，还发现了九种不同的呼吸道病毒。预计这些发现将有助于更好地了解尼泊尔的呼吸道病毒，以及适当的病例管理和尽量减少抗菌剂使用的战略。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者非常感谢加德满都特库国家公共卫生实验室国家流感中心的所有工作人员，感谢他们在研究期间提供的技术援助。

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