红霉素表征和四环素抗性乳酸杆菌Fermentum菌株

抽象的

乳酸杆菌Fermentum殖民化胃肠道和人类和动物的泌尿生殖器被广泛用于发酵产物和益生菌的制造。这些细菌可以用作抗生素抗性基因的载体，其可以转移到病原体细菌中。因此，必须在这些微生物中监测和控制可传染性抗生素抗性决定簇，以批准其安全状况。本研究的目的是表征红霉素和四环素抵抗力L.Fermentum.并估计耐药基因从乳酸菌转移到其他革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的可能性。在六L.Fermentum.从人类粪便和商业乳制品中分离的菌株，五种菌株表现出对四环素的表型抗性。用于抗生素抗性决定簇的PCR筛选揭示了质粒定位的四环素抗性基因删号（k）和删号（m）在所有菌株和红霉素抗性基因中嗯（b）在染色体中L.Fermentum.5-1和嗯（c）在质粒中L.Fermentum.3-4。所有测试的乳酸杆菌缺乏共轭转座TN916.无法将四环素抗性基因转移到金黄色葡萄球菌那葡萄球菌表皮那李斯特菌那Acinetobacter Baumannii.那Citrobacter Freundii.,大肠杆菌通过滤波配合。葡萄球菌haemolyticus.没有接受相应的红霉素抵抗基因乳酸杆菌菌株。因此，在本研究中，L.Fermentum.并不暗示红霉素和四环素抗性的差异，但这些菌株仍然对环境和人类健康构成威胁，因为它们在其质粒中占红霉素和四环素抗性基因，因此不应用于食品和益生菌。

1.介绍

乳酸杆菌Fermentum是人类胃肠道和泌尿生殖道的常见居民，已知这些细菌在这些地方发挥促进健康的作用[1那2］．天然存在于生奶、乳制品和许多传统发酵食品和饮料中[3.那4.］．一些益生菌分离株，例如L.Fermentum.RC-14和L.Fermentum.90 TC-4，已经广泛使用并在工业规模生产[5.那6.］．该品种已列于欧洲食物安全管理局(EFSA)公布的合资格安全推定(QPS)内[7.[以及其他乳酸菌（实验室），它通常被美国食品和药物管理局视为安全（GRAS状态）。然而，在过去十年中，在益生菌或起始培养物中使用的细菌在潜在的潜在参与和转移到食物或肠道病原体的潜在累积方面受到了关注[8.那9.］．

随着乳酸菌参与抗生素耐药性传播的意识日益增强，从生理和分子水平研究益生菌和发酵剂的抗生素耐药性是非常必要的。一个表型抗性菌株可能在基因上是典型的“易感”，相反，易感表现型可能携带沉默基因，这是通过基因分型观察到的[10.］．通过没有易感性测试标准，乳酸杆菌之间的抗生素抗性的测定是混淆的。仅针对一些抗生素和特定最常用的益生菌物种确定微生物断裂点[11.］．此外，最小抑制浓度（MIC）断点值可以根据施加的方法和培养基以及相同属的物种而变化[12.-14.］．

对抗生素的细菌耐药性可以是两种类型：本质抗性，这是生物体的自然性，具有横向扩散的潜力最小，并且在非致病细菌中没有风险，并且获得的抗突变，这是由突变导致的通常，通过采集通用材料，例如质粒或转座子[10.］．据报道，乳酸杆菌对万古霉素，氨基糖苷类和大多数核酸抑制剂具有高抗抗性抗性[15.］．物种之间对其他抗生素的抵抗力变化。已发现红霉素抗性和四环素抗性，因此，相应的遗传决定簇通常被认为是可能可转移的[16.那17.］．获得了对由此编码的红霉素的抗性嗯(B)基因已经被检测到在两个L.Fermentum.菌株NWL24和NWL26和中国发酵食品中分离的NWL26（酸奶）[18.］．L.Fermentum.CB101也从中国发酵食品（黄瓜）中分离出对红细胞和四环素的耐受非常高的麦克风（512μG / ml对于红霉素和超过128 μ用于四环素的g / ml）[19.］．来自四种红细胞和四环素抗性L.Fermentum.从印度发酵食品中分离的菌株，已发现三种菌株港口嗯（b）基因和一个ralbors tetracycline流出基因删号（k）和删号（l）[20.］．已经确定了几种可能在转移抗生素抗性转移中实施的质粒L.Fermentum.，例如，抗性质粒plme300L.Fermentum.ROT1 [21.，四环素和红霉素耐药质粒L.Fermentum.lf601 [22.]和质粒pLEM3赋予红霉素抗性L.Fermentum.[23.］．展示从乳杆菌到其他细菌的抗生素抗性决定簇的抗生素抗性决定簇的作品非常有限，尤其是属于肠道微生物群的细菌24.-26.］．到目前为止，只有一个成功转移的证据嗯（b）基因来自L.Fermentum.NWL24到肠球菌粪便器181在过滤器交配实验中[18.］．

这项工作的目的是全面地表征红霉素和四环素抵抗概况L.Fermentum.菌株并评估相应的抗性基因对其他细菌的可转移性。在这项研究中，六L.Fermentum.通过琼脂椎间盘扩散法测定从人粪便和商业乳制品中分离的菌株和商业乳制品的菌株对红霉素和四环素的敏感性，然后通过肉汤微量稀释方法测定这些抗生素的MIC。通过PCR扩增通过直接筛选红霉素和四环素抗性决定簇的直接筛选的细菌菌株的表型测定。这些抗生素抗性基因的可转移性来自L.Fermentum.在过滤器交配实验中研究了许多革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的菌株。本研究为安全评估提供了参考，并有助于益生菌评估体系。

2。材料和方法

2.1。分离细菌和生长条件

六乳酸杆菌粪便的菌株分离健康人(HF-A1、HF-A4 HF-B1)和商业乳制品(3 - 4、5 - 1和5 - 2)连续稀释样品的无菌磷酸盐(PBS),后续电镀到de Man-Rogosa-Sharpe(夫人)琼脂(HiMedia、印度),和在厌氧条件下孵化(Anaerogas包;NIKI MLT，俄罗斯)37°C。选择单个菌落，纯化，并保存在MRS琼脂上立即使用，并在20%甘油中保存在−80°C下。在所有实验之前，细菌分离株至少传代两次。

2.2。鉴定细菌

将细菌菌落分配给该属乳酸杆菌由Maldi-ToF质谱（Bruker Biotyper系统，Bruker Daltonics，德国），如前所述[27.］．简而言之，来自MRS琼脂的一个新鲜的殖民地涂抹在地面钢靶（Bruker Daltonik）上，覆盖1 μ在50%乙腈和2.5%三氟乙酸中，α -氰-4-羟基肉桂酸基质饱和溶液的L，在室温下风干。对于每个菌株，分析两次菌落材料的制备。质谱记录根据制造商的说明。将得到的光谱与集成数据库(3.2.1.1版本)中的参考光谱进行比较。采用标准Bruker解释标准。评分≥2.3为可靠的物种分配，评分≥2.0但<2.3为可靠的属鉴定。低于2.0的分数被认为是不可靠的。

对于大多数准确的物种鉴定，通过使用通用16S rRNA细菌引物27F和1392R通过PCR方法扩增16S rRNA基因（表1）和下面描述的PCR程序。通过琼脂糖凝胶电泳，纯化并在ABI棱镜3730序列子（应用生物系统）上测序PCR扩增的1.4kbp DNA片段。通过将16S rRNA基因序列与NCBI数据库中的爆炸中的那些进行比较，将细菌分离物鉴定到物种水平。

2.3。抗生素易感性测试和MIC测定

通过盘扩散法测定对红细胞霉素和四环素的易感性，如前所述[27.］．简而言之，在厌氧条件下在37℃下在37℃下在汤中生长细菌（Anaerogas Pack; Niki MLT，俄罗斯），并在琼脂平板上浇注（接种后0.5 McFarland）。将抗生素盘（药物医药科学研究中心，俄罗斯）置于接种板的表面上。在37℃的厌氧条件下孵育48小时后，根据[的方法27.］．使用以下标准来解释抗生素的抑制区:细菌被认为对红霉素有耐药性(R) (15μG /盘）当抑制区域（mm）≤10≤10，在11-20时适度易感（MS），≥21的易感致敏感;细菌被认为是四环素的抗性（R）（30 μG /盘）当抑制区域（mm）≤16≤16时，在17-21处适度易感（MS），并且≥22易感。

96孔未处理细胞培养板(Eppendorf) MRS培养基中微量稀释法测定抗生素的MIC。四环素(Sigma-Aldrich)和红霉素(Sigma-Aldrich)的浓度范围为0.12-256μg/ml，在MRS肉汤中多次稀释后得到。水井中接种200株μL细菌培养（3×10^7. CFU/ml) and incubated at 37°C. The MIC was read after 48 h of incubation as the lowest concentration of an antibiotic at which visible growth was inhibited. According to the microbiological breakpoints suggested forL.Fermentum.通过efsa [11.]，麦克风高于1的菌株 μG /ml为红霉素，8μ用于四环素的G / ml被认为是抗性的。

2.4。DNA制备和操纵

将细菌在37℃下在30mL的MRS肉汤中培养过夜。通过离心（5分钟，13000rpm）收获细胞，然后重悬于3ml裂解缓冲液（50mM Tris-HCl和3mg / ml溶菌酶，pH8.0）中。将重悬的颗粒在37℃下振荡孵育3小时。在这一步之后，100 μ加入含锡硫酸钠钠（SDS; 10％，W / V），并将样品轻轻倒置以进行细胞破坏。500. μL苯酚：加入氯仿（1：1，v / v）。离心步骤（5分钟，13000rpm，室温）后，将透明的上清液转移到新管中。DNA用500次沉淀 μl冷异丙醇，用塑料尖端取出DNA。用乙醇96％（w / v）洗涤DNA，在干燥后，将其稀释100℃ μl蒸馏水。将所有DNA样品储存在-20℃。

根据制造商的说明，使用基因射精质粒细胞Miniprep套件（Thermo Scientific）获得质粒DNA。

2.5。PCR检测基因

利用表中所列引物进行PCR扩增，确定是否存在红霉素和四环素耐药基因1．Transposon Tn的存在916.通过扩增整合酶编码基因检测（Int）和检查之间的中间区域删号（m）和Int带有引物的基因Tet-int在表格中描述1．

PCR反应在总体积为25体内进行 μl含有DNA模板，每次引物10pmol（表1），1U Taq DNA聚合酶，四种DNTPS中的每种浓度为200 μM，含有Tris-HCl，KCl的PCR缓冲液（NH_4.）₂所以_4.，mgso._4.和Triton X-100。扩增程序如下:95℃初始变性4 min, 94℃初始变性30 s 35个循环，46-60℃(根据单个引物的退火温度;表格1) 30秒，72°C 1.5分钟，最后在72°C拉伸7分钟。所有PCR反应均采用本实验室阳性和阴性对照。PCR产品(5μl）通过电泳与1％琼脂糖凝胶上的电泳分离，染色中Midori Green DNA染色（Nippon Genetics Europe，德国）染色。

2.6。过滤器交配实验

乳酸菌对抗生素耐药性的转移性是通过过滤器配对进行检测的，如[24.]，在多个革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌亚普。金黄色葡萄球菌ATCC®29213™，葡萄球菌haemolyticus.那葡萄球菌表皮（临床分离株），和李斯特菌88K(奥伦堡州立大学Alexey Vasilchenko博士的礼物)和革兰氏阴性(Acinetobacter Baumannii.那Citrobacter Freundii.,大肠杆菌(临床分离株))的细菌。临床分离株S. haemolyticus.那S. Epidermidis.,大肠杆菌来自喀山流行病学和微生物研究所(喀山，俄罗斯)。临床分离株A. Baumannii.和C. Freundii.从医学微生物学（Giessen，Germany）获得。在Luria-Bertani（LB）培养基中培养病原体的培养物。如上所述，通过测定麦克风来表征受体菌株的抗生素抗性分布。通过PCR证明，如前所述，通过PCR证明了缺乏红霉素和四环素抗性基因。S. haemolyticus.对红霉素和四环素敏感，但携带删号（k）基因，因此用作红霉素抗性基因的受体菌株。其他测试的菌株耐用于红霉素（所有革兰氏阴性菌株）或具有沉默嗯（b）基因（S.金黄色葡萄球菌那S. Epidermidis.,L.单核细胞增生)．因为他们对四环素敏感而缺乏删号基因，它们作为受体菌株四环素耐药基因。氯霉素(40μG / ml）用作用于经牙的选择性抗生素标记物S. Epidermidis.那S. haemolyticus.,A. Baumannii.利福平(2.5μg / ml）为S.金黄色葡萄球菌那L.单核细胞增生,大肠杆菌和氨苄青霉素（40 μg / ml）为C. Freundii.．这些浓度足以完全抑制乳酸杆菌，而受体细菌不受影响。

对于过滤器交配实验，用过夜种植的供体接种MRS肉汤和LB肉汤（1：100）L.Fermentum.相应地，培养物和受体病原体培养物，并在37℃下孵育约。4小时到生长的中指数阶段。将一个ml的每种培养物混合并通过无菌0.45过滤 μM孔径硝酸纤维素膜过滤器（Millipore，USA）。之后，通过过滤器通过过滤器，将无菌蛋白质生理盐水（PPS）溶液（8.5g / L NaCl和1g / L细菌蛋白胨）通过过滤器将细胞更紧密地捕获到膜中。将过滤器在37℃下在LB琼脂上孵育过夜。用2mL PPS从过滤器洗涤细菌。将配合混合物的稀释液涂布在含有10的LB琼脂平板上 μG / ml四环素或红霉素（Sigma-Aldrich）和选择性抗生素（氯霉素，利福平，或氨苄青霉素，来自Sigma-Aldrich）（双重选择性培养基），含有10的琼脂平板 μG / ml四环素或红霉素（Sigma-Aldrich）或选择性抗生素（单选酶）和无抗生素的非选择性培养基。供体和受体菌株的对照培养物也单独镀三种琼脂平板。将板在37℃温育24-48小时。

3.结果与讨论

3.1。隔离和鉴定L.Fermentum.菌株

在我们以前的工作中，15乳酸杆菌从健康志愿者的粪便中孤立的菌株（未发表的数据）和19乳酸杆菌从商业奶类产品及益生菌中分离出的菌株[27.[六种菌株显示出六种菌株通过盘扩散法抵抗红霉素或四环素。对这两种抗生素的抗性被认为是益生菌中最威胁的一种，因为它通常被获得和可能转移[16.那17.］．因此,这六个乳酸杆菌在该研究中使用菌株以全面地表征其红霉素或四环素抵抗谱，并评估相应的抗性基因对其他细菌的可转移性。所有测试的菌株都被指定为L.Fermentum.Maldi Biotyper的物种作为样品质谱与参考质谱共享最大相似性L.Fermentum.来自Maldi Biotyper软件（分数值范围在2.019和2.083之间）。在我们确定样品16S rDNA序列的相似度分数后，该发现验证了16S RRNA基因分析，其中NCBI数据库中的参考序列的相似性得分≥99％L.Fermentum.．

３．２．抗菌素耐药性的表型特征

表型的L.Fermentum.表中提出了对红细胞和四环素的抗性2．除5-1株耐药外，本研究检测的菌株均对红霉素敏感或中敏感。mic在0.25到1之间μ基于EFSA建立的MIC断点，将所有菌株视为易患红霉素的菌株[11.］．五次测试L.Fermentum.分离株对四环素具有抗性，5-1株为中敏感株。与圆盘扩散法的结果完全一致，这5个分离物L.Fermentum.显示了16-64的高麦克风 μ对于四环素的G / ml，因此根据[11.］．人类粪便分离株中常见的四环素抗性可以通过在药物中的药物或治疗和疗法中的药物和消耗的食物中的抗谱或组合的密集使用来解释，这可以为抗生素抗性细菌提供选择性压力．通过盘扩散特征的抗微生物抗性的表型曲线主要与观察到的麦克风相吻合，除了菌株L.Fermentum.5-1，其在盘扩散法中对红霉素抵抗力，但最终根据MIC值被认为是非耐受者。

因此，表型测定表明L.Fermentum.菌株HF-A1、HF-A4、HF-B1、3-4和5-2具有四环素耐药性，具有转移的潜力。

3.3。抗生素抗性基因

采用PCR检测抗生素耐药基因，结果见表2．对所有菌株进行了红霉素耐药基因检测嗯（一种），嗯(B),嗯（C），嗯（t），和Mef.（一种）。仅有的L.Fermentum.5-1是积极的嗯（b）基因，给出425bp频带，对应于椎间盘扩散测定中的抗性表型（图印地，泳道2）。这嗯（b）编码作用于23s核糖体亚基的RRNA甲基酶的基因是最常发现的所有红霉素抗性基因中的一种乳酸杆菌物种 [15.］．根据PCR结果嗯（b）基因归因于染色体DNAL.Fermentum.5-1，因此不可能转移。然而，因其获得对红霉素的抗性嗯(B)在不同来源的乳酸菌中经常被报道[9.那18.那20.那21.那23.那35.］．红霉素抗性基因嗯（c）在质粒DNA中发现来自L.Fermentum.3-4（图印地，泳道3）以及我们的知识，此基因尚未从该特定物种中描述。乳酸杆菌的较低患病率与之前的报告一致[20.那35.］．这嗯（c）基因仅在少数人中被检测到L. plantarum.发酵干香肠的菌株[36.和几只分离出该物种的鸡唾液l .那l . agilis那l . crispatus那L. Reuteri.,L. Saerimneri.[37.］．其他红霉素耐药决定因素(嗯（t）和Mef.（a））未在任何菌株中检测到。

在这项研究中，我们还测试了四环素抗性基因的存在删号(K),删号（m），删号（w），删号（沙删号（l）。这删号（k）和删号(M)基因均存在于所有供试菌株的质粒DNA中(图)就是S1C和S1D.)．这些决定因素具有不同的行动方式：删号（k）编码Efflux泵，而删号(M)提供核糖体保护[16.］．同时发生删号（k）和删号（m）基因与其他含有多个乳杆菌的报道一致删号基因(18.那20.那37.-39.］．遗传位置删号（k）小组织质粒的基因和删号(M)共轭转座子(Tn916.tn1545家庭）促进这些决定因素的传播[16.］．然而，在这项研究中，我们已经表明所有测试L.Fermentum.菌株缺乏偶联转座子Tn916.，携带删号（m）基因并能够水平，散列转移。当引物对时，不会产生扩增子㈡基因，编码允许动员TN的整体酶蛋白质916.，以及中间区域删号（m）和㈡使用序列（数据未显示）。我们没有找到任何删号（w），删号（沙删号(L)基因。

抗生素抗性决定簇PCR筛选结果L.Fermentum.菌株与表型分析结果仅部分一致。检测删号菌株HF-A1，HF-A4，HF-B1,3-4和5-2中的基因与其抗性表型同时。L.Fermentum.发现对四环素敏感的敏感性伴随着沉默基因删号（k）和删号（m），和L.Fermentum.3-4对红霉素敏感为阳性嗯(C)检测嗯（b）在L.Fermentum.5-1与其在盘扩散测定中所示的红霉素抗性表型同时吻合，但与MIC测定的结果相矛盾。这些有争议的结果可以通过对抗生素敏感性评估方法的依赖性依赖性来解释。结果表明，有些物种的抗生素MIC增加了增加的接种尺寸和延长的孵育时间[14.］．

3.4。转移抗生素抗性基因

我们研究了6个四环素抗性基因的筛选配伍L.Fermentum.菌株阳性删号（k）和删号(M)以若干革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌为-金黄色葡萄球菌那葡萄球菌表皮那李斯特菌那Acinetobacter Baumannii.那Citrobacter Freundii.,大肠杆菌。还，L.Fermentum.5-1携带嗯（b）基因和L.Fermentum.3-4携带嗯（c）基因被用作捐赠者葡萄球菌haemolyticus.作为红霉素耐药基因的受体。受体菌株是通过实验选择的，符合转偶联物反选择所必需的两个标准:(i)在表型和基因型上都对红霉素或四环素缺乏耐药性，(ii)对对试验活性抗生素存在耐药性乳酸杆菌菌株。此外，这些细菌是人胃肠道微生物的成员[40］．凝固酶阴性葡萄球菌S. Epidermidis.和S. haemolyticus.通常殖民正常的人体皮肤，也可以从人胃肠道中分离。已发现来自肠道的分离物表达表达其致病性潜力的毒力因子[41.］．

结果表明，从红霉素和四环素的耐药基因中检测到L.Fermentum.通过缀合，菌株不能转移到本研究中使用的其他细菌。在具有双重选择培养基的平板中没有观察到细菌生长，从而表明没有受体细胞患有红霉素或四环素抗性（数据未显示）。

乳酸菌和革兰氏阴性菌是研究抗生素耐药性决定因素的可转移性的罕见配对。到目前为止，关于抗生素抗性基因偶联转移的报道只有一例L.Fermentum.到其他细菌。这嗯（b）基因来自L.Fermentum.NWL24已成功转移到肠球菌粪便器181通过滤波交配[18.］．然而，证明通过缀合物的基因转移可以从革兰氏阳性到革兰氏阴性细菌进行，反之亦然[42.那43.］．链球菌缀合性转座子TN916.被证明能够在各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌之间穿过屏障，随后在新宿主中表达[42.］．因此，在进行过滤器交配实验中没有转频jugangers与缺乏TN缺乏916.在测试中L.Fermentum.菌株。

转移抗生素抗性基因的残疾被认为是选择食品工业和益生菌的实验室菌株的重要参数[15.］．这种性质对正常人类微生物群的乳酸杆菌同样重要，以避免不同物种之间的抗性决定簇的传播，包括潜在和迫使病原体，栖息地，患有密集包装的微生物如人类的肠道。在所有测试中L.Fermentum.菌株，删号（k）和删号（m）基因被显示为位于质粒中，因此可能被获取。三L.Fermentum.从乳制品中分离的菌株（3-4,5-1和5-2）代表着严重的安全问题，因为它们的四环素抗性表型（菌株3-4和5-2）以及四环素抗性基因的同时存在删号（k）和删号(M)(所有菌株)以及红霉素耐药基因嗯（b）（菌株5-1）和嗯（c）（菌株3-4）。在这项工作中，我们表明所有测试的乳杆菌都缺乏共轭转座子TN916.并且不能转移四环素抗性基因S.金黄色葡萄球菌那S. Epidermidis.那L.单核细胞增生那A. Baumannii.那C. Freundii.,大肠杆菌通过滤波配合。交配L.Fermentum.5-1携带嗯（b）基因和L.Fermentum.3-4携带嗯（c）基因没有产生经济包装剂S. haemolyticus.也是。这些发现减少了测试的乳酸杆菌对红霉素的影响的可能性和人类微生物组中的红霉素和四环素抗性的影响，并有利于他们的安全状况，但仍然没有建立完整的安全性。我们的结果突出了需要在应用之前将抗生素耐药性筛选到现有的安全评估实践中乳酸杆菌菌株作为起动性培养物或益生菌。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

作者的贡献

Elizaveta Anisimova进行了研究并起草了稿件。Dina Yarullina设计了实验，审查了手稿，并监督了工作。所有作者阅读并认可的终稿。

致谢

喀山联邦大学的竞争成长计划得到支持，RFBR授予没有。18-34-00268并部分由RFBR授予NO。17-00-00456（应变隔离）。该研究是通过使用跨学科的集体使用喀山联邦大学的跨学科，基因组和伏尔加地区后明癌症研究来进行。

补充材料

图S1：表型（A）和基因型（B，C和D）红霉素和四环素抵抗试验L.Fermentum.．(A)用琼脂盘扩散法得到的抑制晕L.Fermentum.5-1（1），L.Fermentum.HF-A1（2），L.Fermentum.HF-A4 (3),L.Fermentum.HF-B1（4），L.Fermentum.3 - 4 (5)L.Fermentum.5-2（6）。PCR产物的红霉素（B）和四环素（C和D）抗性基因。（b）扩增的PCR产品嗯（b）在质粒DNA（泳道1）中的1个引物对和总DNA（泳道2）L.Fermentum.5-1和嗯（c）质粒DNA（泳道3）中的引物对和总DNA（泳道4）L.Fermentum.3-4。PCR产品扩增删号（k）2（c）和删号（m）在质粒DNA中的1（d）引物对L.Fermentum.HF-A1（泳道1），L.Fermentum.HF-B1（泳道2），L.Fermentum.HF-A4（泳道3），L.Fermentum.5-1（泳道4），L.Fermentum.3-4（泳道5），和L.Fermentum.5-2（泳道6）。泳道m，1 kB DNA梯子。（补充材料）

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