六个 乳酸菌粪便的菌株分离健康人(HF-A1、HF-A4 HF-B1)和商业乳制品(3 - 4、5 - 1和5 - 2)连续稀释样品的无菌磷酸盐(PBS),后续电镀到de Man-Rogosa-Sharpe(夫人)琼脂(HiMedia、印度),和在厌氧条件下孵化(Anaerogas包;妮基MLT、俄罗斯)在37°C。选择单一的殖民地、纯化和保持在20%琼脂夫人立即使用和甘油为存储−80°C。所有实验之前,细菌隔离是亚文化至少两次。

属的细菌菌落被分配 乳酸菌MALDI-TOF质谱(力量生物型系统,力量Daltonics,德国),如前所述[ 27]。总之,一个新的殖民地从琼脂夫人抹到地面钢目标(力量Daltonik),覆盖和1 μl alpha-cyano-4-hydroxycinnamic饱和溶液的酸在50%乙腈和2.5%三氟乙酸矩阵,并在室温下晾干。对于每个应变,殖民地的两个准备材料进行了分析。质谱记录根据制造商的指示。获得的光谱与参考光谱比较综合数据库(3.2.1.1版)。应用标准的力量解释标准。分数≥2.3接受可靠的物种作业和分数≥2.0但< 2.3可靠鉴定到属的水平。分数低于2.0被认为是不可靠的。

最精确的物种鉴定、16 s rRNA基因PCR方法扩大了使用通用16 s rRNA细菌引物27 f - 1392 r(表 1下面描述)和PCR程序。扩增1.4 kbp菌进行基因的DNA片段被解决通过琼脂糖凝胶电泳,纯化,测序ABI棱镜3730测序仪(应用生物系统公司)。细菌分离鉴定物种水平通过比较他们的16 s rRNA基因序列与NCBI数据库中。

对红霉素、四环素是由阀瓣扩散方法,如前所述[ 27]。总之,细菌生长在汤夫人一夜之间在37°C在厌氧条件下(Anaerogas包;NIKI MLT、俄罗斯)和pour-plated夫人琼脂板(0.5麦克法兰接种后)。抗生素光盘(药物治疗的科学研究中心,俄罗斯)表面被接种盘子。48 h后孵化在厌氧条件下在37°C,抑菌圈的直径测量和解释为易感(S),中度敏感(MS),或者耐药(R)的方法 27]。下面的标准解释的抑制区使用抗生素:细菌被认为是红霉素耐药(R) (15 μg /盘)的区抑制(mm)≤10,适度敏感(MS)在11日至20日,和易感(S)≥21岁;细菌被认为是抗四环素(30 (R) μg /盘)的区抑制(mm)≤16,中度敏感,17 - 21 (MS)在区间和易感(S)≥22。

抗生素的麦克风是由汤采用微量法在96年汤夫人参与细胞培养板(埃普多夫)。四环素(Sigma-Aldrich)和红霉素(Sigma-Aldrich)是在-256年0.12浓度范围进行测试 μg / ml后得到一系列的双重的夫人肉汤稀释。威尔斯接种200 μ细菌培养的l (3×10⁷CFU /毫升)和孵化37°C。麦克风是读48 h后孵化的最低浓度抗生素在可见的增长被抑制。提出了根据微生物断点 酵母由欧洲食品安全署( 11),压力与中等收入国家高于1 μ对红霉素和8 g / ml μ被认为是抗四环素的g / ml。

一夜之间,细菌被种植在37°C夫人在30毫升的浓汤。细胞被离心收获(5分钟,13个000 RPM),然后resuspended 3毫升的裂解缓冲(50毫米Tris-HCl溶菌酶和3毫克/毫升、pH值8.0)。resuspended颗粒是孵化3 h在37°C。在这一步中,100年 μl(十二烷基硫酸钠(SDS;10%,w / v)叠补充道,和样本轻轻倒细胞破坏。500年 μl苯酚:氯仿(1:1,v / v)补充道。离心步骤(5分钟后,13个000 RPM,室温),被转移到一个新的得到上清液管。DNA沉淀了500年 μl冷异丙醇,DNA与塑料的小费了。DNA用乙醇洗净96% (w / v),干后,它在100年被稀释 μl的蒸馏水。所有的DNA样本都储存在−20°C。

质粒DNA得到使用GeneJET质粒Miniprep工具包(热科学),根据制造商的指示。

红霉素、四环素抗性基因的存在是由使用表中列出的引物PCR扩增 1。转座子Tn的存在 916年被放大的integrase-encoding基因( Int),检查interregion之间 春节(M)和 Int基因的引物 Tet-int描述在表 1。

PCR反应的总量进行了25 μl包含DNA模板,每个引物(表10 pmol 1),1 U Taq DNA聚合酶,每个四核苷酸浓度为200 μ包含Tris-HCl M, PCR缓冲,氯化钾,(NH₄)₂所以₄,MgSO₄,特里同x - 100。扩增程序如下:最初的变性在95°C 4分钟,35周期为30年代在94°C, 46-60°C(根据个人引物的退火温度;表 130年代,72°C 1.5分钟,最终在72°C扩展步骤7分钟。积极的和消极的控制从我们实验室用于所有PCR反应。PCR产品(5 μl)被在1%琼脂糖凝胶电泳分离,这是沾美岛绿绿DNA染色(日本遗传学欧洲,德国)。

可转让性乳酸杆菌的抗生素耐药性检测过滤交配,如[ 24),革兰氏阳性数( 金黄色葡萄球菌无性系种群。 葡萄球菌写明ATCC®29213™, 葡萄球菌haemolyticus, 葡萄球菌epidermidis(临床分离株), 单核细胞增多性李斯特氏菌88 k (Alexey Vasilchenko博士的礼物,奥伦堡市的州立大学))和革兰氏阴性( 鲍曼不动杆菌, 枸橼酸杆菌属freundii, 大肠杆菌(临床分离株))的细菌。临床分离株 美国haemolyticus, 美国epidermidis, 大肠杆菌得到的喀山研究所流行病学和微生物学(喀山、俄罗斯)。临床分离株 答:baumannii和 c . freundii获得医学微生物学研究所的(德国吉森)。文化的病原体是孵化Luria-Bertani(磅)中。抗生素耐药性的接受者菌株是中等收入国家的特点是决心,如上所述。缺乏红霉素和四环素抗性基因PCR证实了,刚才说的。 美国haemolyticus对红霉素、四环素敏感但把 春节(K)基因,因此作为接收者红霉素耐药性菌株的基因。其他测试菌株对红霉素耐药(革兰氏阴性菌株)或拥有一个沉默 嗯(B)基因( 金黄色葡萄球菌, 美国epidermidis, l . monocytogenes)。他们对四环素和缺乏敏感 春节基因,他们作为接受者四环素耐药性菌株的基因。氯霉素(40 μg / ml)是用作transconjugants选择性抗生素标记的 美国epidermidis, 美国haemolyticus, 答:baumannii利福平(2.5 μg / ml) 金黄色葡萄球菌, l . monocytogenes, 大肠杆菌和氨苄青霉素(40 μg / ml) c . freundii。这些浓度足以完全抑制增长 乳酸菌,而接受者细菌未受影响。

过滤交配实验,汤女士和LB培养基接种(1:100)在一夜之间变得捐献者 酵母文化和文化接受者病原体,相应地,孵化大约37°C。4 h mid-exponential阶段的增长。一毫升的文化是复杂的、无菌过滤0.45 μ美国米孔隙大小硝化纤维膜过滤器(微孔)。之后,无菌蛋白胨生理盐水(PPS)解决方案(8.5 g / l氯化钠和1 g / l细菌蛋白胨)是通过过滤器使细胞更加紧密的成膜。一夜之间,过滤器被孵化的磅琼脂37°C。细菌和2毫升pp过滤器的清洗。稀释的交配混合物被传播到包含10磅琼脂板 μg / ml四环素或红霉素(Sigma-Aldrich)和选择性抗生素(氯霉素、利福平、或氨苄青霉素,所有从Sigma-Aldrich)(双选择性培养基),琼脂板包含10 μ克/毫升四环素或红霉素(Sigma-Aldrich)或选择性抗生素(单一选择性培养基),没有抗生素和非选择性培养基。控制文化的供体和受体菌株也分别镀上三种类型的琼脂板上。盘子在37°C孵化24 - 48 h。

在我们以前的工作,在15 乳酸菌健康志愿者的菌株分离粪便(未发表的数据)和19 乳酸菌从商业乳制品和益生菌菌株分离 27),六株显示耐红霉素或四环素的阀瓣扩散法。阻力这两种抗生素在益生菌被认为是最危险的一个,因为它往往是收购和潜在的可转让的 16, 17]。因此,这六个 乳酸菌菌株被用于这项研究,全面描述红霉素或四环素耐药性资料并评估相应的抗性基因的可转让性,其他细菌。所有测试菌株被推定地分配 酵母物种MALDI生物型质谱作为示例共享最大相似性的标准质谱 酵母从MALDI生物型软件(分数值介于2.019和2.083之间)。这一发现是由16 s rRNA验证基因分析我们确定样品后16 s rDNA序列的相似性得分≥99%与参考序列在NCBI数据库分类 酵母。

表型的 酵母耐红霉素、四环素提出了表 2。所有压力测试在这个研究中被盘扩散敏感或适度容易红霉素,除了应变5:1,耐药。与中等收入国家在0.25和1之间 μg / ml,所有菌株被认为容易红霉素基于麦克风断点建立了欧洲食品安全署( 11]。5测试 酵母隔离显示耐四环素,而应变5:1中度敏感。完全一致的结果纸片扩散法,这五个隔离的 酵母显示高16 - 64的中等收入国家 μg / ml四环素,因此被指定为耐四环素根据( 11]。四环素抗性普遍人类的隔离可能解释为集约使用四环素,单独或结合,在医学上用于预防或治疗和消费食品,可以提供所需的选择压力导致抗药性细菌发展和传播。抗菌素耐药性的表型特征主要由阀瓣扩散之际,观察到中等收入国家,除了压力 酵母5 - 1,对红霉素耐药盘扩散法,但最终被认为是根据麦克风不抵抗的价值。

因此,表型分析显示 酵母菌株HF-A1、HF-A4 HF-B1、3 - 4和5 - 2具有四环素抗性可能是可转让的。

抗生素抗性基因检测PCR,这项研究的结果发表在表 2。所有的压力都是检测红霉素抗性基因的存在 嗯(一), 嗯(B), 嗯(C), 嗯(T) mef(一)只 酵母5 - 1是积极的 嗯给425个基点(B)基因,乐队,对应的抗性表型纸片扩散试验(图 印地,弄2)。 嗯(B)基因,编码一个rRNA甲基化酶作用于23 s核糖体亚基,是最常见的红霉素抗性基因 乳酸菌物种( 15]。根据PCR结果, 嗯(B)基因是由于染色体DNA 酵母5 - 1,因此不可能转让。然而,耐红霉素的收购 嗯(B)经常被报道在不同来源的乳酸杆菌( 9, 18, 20., 21, 23, 35]。红霉素抗性基因 嗯(C)在质粒DNA被发现 酵母3 - 4(图 印地巷3),据我们所知,这个基因还没有前面描述的特定的物种。患病率较低在乳酸杆菌与先前的报道是一致的( 20., 35]。的 嗯(C)基因中只发现了一些 l .杆菌菌株的发酵干香肠( 36)和几个鸡隔离的物种 唾液l ., l . agilis, l . crispatus, 这种l ., l . saerimneri( 37]。其他红霉素抗性因素( 嗯(T)和 mef(一)没有检测到任何压力。

在这项研究中,我们还测试了四环素抗性基因的存在 春节(K), 春节(M), 春节(W), 春节(年代), 春节(L)。 春节(K)和 春节(M)基因被发现在所有测试菌株的质粒DNA(数字 就是S1C和 S1D)。这些因素有不同的行动模式: 春节(K)编码射流泵,而 春节(M)提供核糖体保护( 16]。同时发生的 春节(K)和 春节(M)基因与报告的其他协议包含多个乳酸杆菌 春节基因( 18, 20., 37- - - - - - 39]。基因的位置 春节(K)基因在小multicopy质粒 春节共轭转座子(Tn (M) 916年tn 1545年家庭)促进这些决定因素的蔓延 16]。然而,在这项研究中,我们已经表明,所有的测试 酵母菌株缺乏共轭转座子Tn 916年,带着 春节(M)基因和能力水平,种间转移。没有扩增子当底漆对特定的 int基因,编码允许动员Tn的整合酶蛋白 916年,干预之间的地区 春节(M)和 int序列,使用(数据没有显示)。我们没有找到任何的 春节(W), 春节(年代), 春节在这项研究中(L)基因。

结果PCR筛选抗生素耐药性决定因素的 酵母菌株只有部分与表型分析的数据一致。检测 春节基因的菌株HF-A1、HF-A4 HF-B1, 3 - 4和5 - 2协议抗性表型。 酵母5 - 1对四环素敏感被发现携带沉默基因 春节(K)和 春节(M) 酵母3 - 4对红霉素敏感阳性 嗯(C)检测 嗯(B)在 酵母5 - 1是在协议与红霉素耐药表型纸片扩散试验中显示,但在矛盾与MIC测定的结果。这些有争议的结果可以解释为依赖的敏感性抗生素敏感性的方法评估结果。结果表明,接种体的大小和延长培养时间增加导致高架抗生素麦克风对一些物种( 14]。

我们研究四环素抗性基因的转移从六个过滤器交配 酵母菌株为阳性 春节(K)和 春节(M)对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的数量 金黄色葡萄球菌, 葡萄球菌epidermidis, 单核细胞增多性李斯特氏菌, 鲍曼不动杆菌, 枸橼酸杆菌属freundii, 大肠杆菌。同时, 酵母5 - 1携带 嗯和(B)基因 酵母3 - 4带着 嗯(C)基因被用作捐助者 葡萄球菌haemolyticus担任红霉素抗性基因的受体。收件人菌株选择实验,遇到了两个标准所需counterselection transconjugants: (i)缺乏耐红霉素或四环素在表型和基因型,(2)耐抗生素的存在活跃与测试 乳酸菌菌株。此外,这些细菌是人类肠道微生物群的成员( 40]。Coagulase-negative葡萄球菌 美国epidermidis和 美国haemolyticus通常在正常人体皮肤也可能是孤立的从人类胃肠道。隔离的肠道被发现表达毒性因素来显示他们的致病性势( 41]。

结果表明:红霉素、四环素抗性基因测试 酵母不能转移到其他菌株用于本研究通过接合。没有观察到细菌生长板与双选择性培养基,因此表明所有的受体细胞存在红霉素或四环素抗性(数据未显示)。

乳酸杆菌和革兰氏阴性细菌是一种罕见的对抗生素耐药性的研究可转移性因素。到目前为止,只有一个报告共轭的抗生素抗性基因转移 酵母其他细菌。的 嗯(B)基因 酵母NWL24被成功转移到 粪肠球菌181年由过滤器交配( 18]。然而,这是证明了基因转移通过接合可以发生革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,反之亦然( 42, 43]。链球菌共轭转座子Tn 916年被证明能够跨越障碍之间的各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,与新主机(后来的表达式 42]。因此,没有transconjugants执行过滤交配实验恰逢Tn的缺乏 916年在测试 酵母菌株。

残疾的抗生素耐药性的基因转移被认为是一个重要参数的选择实验室菌株食品工业和益生菌 15]。这个属性是同样重要的是乳酸杆菌的正常人类微生物群为了避免扩散阻力因素在不同的物种,包括栖息地的潜力和专性病原体,密切联系的密集的微生物,如人类的肠道。在所有的测试 酵母菌株, 春节(K)和 春节(M)基因位于质粒,从而有可能被收购。三个 酵母菌株(3 - 4、5 - 1和5 - 2)隔绝乳制品代表一个严重的安全问题,因为它们tetracycline-resistant表型(3 - 4和5 - 2菌株)和同时四环素抗性基因的存在 春节(K)和 春节(M)(所有菌株)和红霉素抗性基因 嗯(应变5:1)和(B) 嗯(C)(应变3 - 4)。在这项工作中,我们已经表明,所有检测乳酸杆菌缺乏共轭转座子Tn 916年和不能转移四环素抗性基因 金黄色葡萄球菌, 美国epidermidis, l . monocytogenes, 答:baumannii, c . freundii, 大肠杆菌通过过滤交配。交配的 酵母5 - 1携带 嗯和(B)基因 酵母3 - 4带着 嗯没有产生transconjugants (C)基因 美国haemolyticus。这些发现减少的可能性的影响测试乳酸杆菌的传播人类微生物组和红霉素、四环素耐药性支持他们的安全状态,但仍不建立完整的安全。我们的结果凸显了需要包括筛选抗生素耐药性的当前实践的安全性评价强制应用程序之前 乳酸菌菌株作为发酵剂或益生菌。