磁化率的溃疡分枝杆菌加纳东部地区两个地区对链霉素和利福平的分离株

摘要

背景耐药性是抗生素化疗的主要挑战。评估病原体的耐药性是传染病流行病学和控制的重要监测工具，包括布鲁里溃疡（BU）随着使用利福平和链霉素成功地对BU进行最终治疗，很少有人关注耐药菌的出现溃疡分枝杆菌在流行社区隔离。本研究调查了溃疡分枝杆菌从加纳两个布鲁里溃疡流行地区分离到链霉素和利福平。方法。70例患者的抗生素敏感性溃疡分枝杆菌同时测定利福平和链霉素的临界浓度为40µg / mL和4µ分别通过Canetti比例法测定g/mL。结果。对利福平耐药12例(17.1%)溃疡分枝杆菌检测的分离株中，有2株(2.9%)对链霉素有耐药性。未检测到对利福平和链霉素有双重耐药性。结论。这项研究的结果可能不能反映所有布鲁里溃疡流行社区;然而，它提供了关于分离株耐药性状况的信息，这对监测是有用的溃疡分枝杆菌，以及布鲁里溃疡疾病的监测和控制。

1.导言

布鲁里溃疡（BU）病是一种皮肤慢性坏死性分支杆菌病，其特征是病变包括结节、丘疹、斑块、水肿和大面积坏死性溃疡[1，2］．它会导致受影响的人发病，并对患者及其家属造成不利的社会经济后果[3.］．这种疾病是由溃疡分枝杆菌，已在全球30多个热带和亚热带国家报告，包括加纳[4，5］．以往，布鲁里溃疡的治疗依赖于外科切除结合整形手术和皮肤移植[6］．目前，利福平和链霉素给药8周已成功使用[7- - - - - -9］．这是在Etuaful等人在加纳Agroyesum成功进行临床试验后，世界卫生组织(WHO)提出的建议的基础上得出的[10，11]尽管取得了这些成功，但在流行地区报告了新的、复发的和无反应的布鲁里溃疡病例[12- - - - - -14］．这些挑战，加上误用、滥用推荐剂量的抗生素，以及患者不遵守规定，有可能产生具有耐药特性的突变菌株，正如在其他分枝杆菌病特别是结核病病例中所报道的那样[14，15］．溃疡分枝杆菌据报道，即使利福平的突变率也很低(0.9%)，但仍存在突变，并有可能破坏为控制疾病而制定的干预措施[14］．

目前，关于耐药性状况的信息很少溃疡分枝杆菌在流行社区内传播的毒株。据报道的低突变率也可能是自世卫组织提出建议以来，很少有研究报告链霉素和利福平耐药性的自满惰性的原因[11，13］．然而，有效的控制措施需要使用有效的公共卫生工具进行疾病监测。

定期调查微生物分离物的敏感性，包括溃疡分枝杆菌通过实验室方法确定药物方案就是其中一个重要的公共卫生监测工具。监控溃疡分枝杆菌因此，在布鲁里溃疡流行地区传播的分离菌株对有效控制疾病至关重要[12］．这将有助于评估当地的循环耐药率溃疡分枝杆菌隔离是有效控制疾病的关键。获得的信息对于制定关于疾病和患者的政策、审查和实施以及优化药物治疗(特别是在布鲁里溃疡流行地区)至关重要。因此，本研究报道的是溃疡分枝杆菌从加纳的Akuapem南部地区的Paakro和东部地区的suhuma - kraboa - coaltar地区的Asuboi分离得到的菌株，这两个地区是加纳的布鲁里溃疡流行区，研究基本上不足。

2.方法

这是一项前瞻性设计的实验研究，数据是在获得加纳卫生服务伦理审查委员会(GHS)和野口医学研究所(NMIMR)的伦理许可后收集的(研究编号040/09-10)。

2．1．研究地点，样本收集和制备

在2010年6月至2012年4月的两年期间，共从向Paakro和Asuboi两个卫生中心报告的135名临床确诊布鲁里溃疡患者中获得540份拭子样本，这些患者治疗失败，慢性伤口持续时间超过预期。这些拭子标本含有布鲁里溃疡病例的病变渗出物，并用于实验室确认是否存在溃疡分枝杆菌。渗出液在Lowenstein-Jensen (L-J)培养基上培养8-12周。典型的增长溃疡分枝杆菌在来自70个不同患者的70个培养物上检测到菌落，在L-J上32°C的8 - 12周潜伏期后[16］．溃疡分枝杆菌菌落经常规实验室方法确认[17通过Ziehl-Neelsen染色和验证性的IS2404 PCR [17］．简单地说，对于Ziehl-Neelsen染色程序，从生长的培养物中制备涂片，并让其干燥，然后进行热固定和用卡波尔品红染色。然后加热，直到蒸汽出现。然后放玻片5分钟，同时间歇加热。用自来水将多余的碳品红洗掉，并将多余的水排掉。然后用20% H覆盖玻片脱色₂所以₄然后离开2-5分钟。用3%亚甲基蓝复染，静置2分钟后，用大量水洗，沥干，晾干。将染色后的载玻片置于光学显微镜下油浸观察。隔离的溃疡分枝杆菌对链霉素进行药敏试验(4μg/mL)和利福平(40μg/mL)，采用Canetti比例法测定分枝杆菌抗生素(18］．对于这种方法，简单地说，将配制好的标准接种菌稀释后接种到含药(试验)和无药(对照)Lowenstein-Jensen培养基上。通过比较对照和试验的数量，很容易推断出耐药菌株的比例。溃疡分枝杆菌在与各种试验药物结合的斜面上表现出生长的分离株被描述为双耐药分离株，而只在一种药物结合的斜面上生长的分离株表现出单耐药。两种药物结合培养基上的生长均构成单耐药，而可能的敏感菌株在所有药物结合培养基上均无生长。

2．2.的制备溃疡分枝杆菌接种悬浮液

溃疡分枝杆菌取2 ~ 3个继代的幼体和纯菌落制备接种悬浮液溃疡分枝杆菌，一次性200μL容量接种环。为获得统一的样品悬浮液，将菌落转移到7ml无菌瓶中，瓶中含有10-15个无菌玻璃珠(3 mg)和500个μL为无菌蒸馏水。通过60秒的间歇旋涡促进了混合。加入3毫升(3毫升)无菌蒸馏水，最终体积为4毫升。容器放置在平面上，使悬浮体中的粗颗粒能够沉淀。用一次性无菌移液管小心地将上清转移到无菌管中[19，20.］．

海水的浑浊度溃疡分枝杆菌然后调整悬浮液，使其与McFarland的标准1溶液相等。这涉及到添加蒸馏水并与相当于1%浓度的标准溶液匹配 毫克/毫升的杆菌。通过添加0.2倍稀释标准悬浮液 悬浮液（10）至1.8毫升 mL无菌蒸馏水，以获得双倍稀释（10⁻¹）.重复上述步骤，共获得四倍稀释的菌悬液(10⁻²， 10⁻³, 10⁻⁴）.

2.3.敏感性试验和结果解释

对于每个测试，100 μL (溃疡分枝杆菌接种稀释剂接种到含有链霉素的Lowenstein-Jensen (L-J)培养基上，最终药物稀释为4μg/mL，利福平为40μ克/毫升。对照为在无药L-J培养基上接种细菌。一个加纳溃疡分枝杆菌菌株ATCC 970321-Ghana D19F9在无药培养基和含药培养基上作为对照。L-J斜坡在32°C下培养。在第28天和第42天再次阅读比例测试。对于融合生长，记录为+++;对于超过100个菌落，记录为++;对于1-99个菌落，记录为实际菌落数量。所有测试的解读都是基于42天的读数。对于每一个被测试的分离物，对每种药物浓度具有耐药性的微生物数量以生长在无药斜坡上的微生物数量的百分比表示。选择L-J斜率来估计在无药和含药介质上的生长。溃疡分枝杆菌与无药培养基相比，在含药培养基上表达≥1%生长的菌株被认为对试验浓度为40的抗生素利福平和链霉素耐药μg / mL和4μ分别g / mL。

3.结果

七十年溃疡分枝杆菌分离株对链霉素和利福平进行了敏感性试验。一般为14 (14)溃疡分枝杆菌分离株在体外表现出对这两种药物的耐药性(见表)1）.总耐药表示为对某一特定药物单独或同时耐药的总和。在这项研究中，最高的抗性表现在溃疡分枝杆菌40时分离株以利福平(17.1%，12/70)为主μg/mL稀释，链霉素在4μ克/毫升(表1）.多数的溃疡分枝杆菌显示出耐药性的分离株来自suhuma - kraboa - coaltar地区的Asuboi卫生中心(10/70)(见表)1）.在70株被检测的分离株中，没有发现对两种抗生素都有耐药性的分离株。

4.讨论

本研究确定了临床药敏谱溃疡分枝杆菌用卡内蒂琼脂比例法分离利福平和链霉素[18］．总共十四个溃疡分枝杆菌分离株在体外表现出对链霉素或利福平的耐药性；其中12株在临界浓度为40%时表现出对利福平的耐药性 μg/mL，而对链霉素的耐药性表现为溃疡分枝杆菌隔离测试。其他BU研究也报道了对链霉素和利福平的体外和体内易感性[21，22］．在大多数这些研究中，主要目标是发现药物或改进现有的方案。评估临床分离菌株的易感性的研究很少，尽管它是一种对有效疾病监测有用的重要公共卫生工具，因为它提供了有关循环耐药性的信息溃疡分枝杆菌在布鲁里溃疡流行社区内[14］．

耐药MTB菌株可能同时对两种或三种抗分枝杆菌抗生素表现出耐药性，这通常是由于多药暴露，这是在美国很少遇到的耐药水平溃疡分枝杆菌.最初在寻找有效抗生素方面具有挑战性的努力需要更加警惕的方法。在这项研究中，没有溃疡分枝杆菌对利福平和链霉素双耐药的分离株;这并不奇怪，因为低比率溃疡分枝杆菌Jansson等人进行的一项研究报告了突变[14在加纳。尽管如此，仍需要对可能出现的耐药性保持警惕/监测溃疡分枝杆菌在布鲁里溃疡流行社区，特别是在可能有合并感染病例的地方溃疡分枝杆菌以及结核分枝杆菌，这可能会加剧目前的状况。本研究还报告了目前的现状溃疡分枝杆菌从公共卫生角度对疾病控制进行研究的两个布鲁里溃疡流行社区的分离株。这方面的研究相当少，特别是对耐药菌株的监测溃疡分枝杆菌.体外测定从临床样本中获得的分离物的敏感性是有效病例管理和公共卫生的重要组成部分[23，24］．

目前，利福平和链霉素在特别大的病变(> 15厘米)和报道愈合时间短(2-4周)的有效使用提高了对持续使用抗生素有效管理疾病的期望[8，22］．在本研究中，两(2)溃疡分枝杆菌分离株在临界浓度为4μ克/毫升。这些结果与Thangaraj等人在2000年进行的研究结果类似，他们也证明了加纳分离株在体外和小鼠体内对利福平的敏感性，Dega等人在2000年[21，22］．

抗菌素的活性主要是消除或抑制病原体的生长，这种现象有可能促进对推荐抗生素治疗水平的耐药性的选择[21，25］．耐药现象是包括分枝杆菌病在内的传染病所面临的全球卫生挑战之一。几项研究的结果证实了这一论断[10，22，26，27]。在使用抗生素之前，调查分离的传染源的敏感性非常重要，强烈建议这样做。这将有助于防止传染源不适当地接触到剂量不足的药物，从而构成滥用，从而有可能导致选择突变的分离物，这些分离物可能hibit对推荐药物的耐药性[28］．分枝杆菌治疗有其合理份额的多药耐药(MDR)，特别是许多病例报告结核分枝杆菌(MTB) [23，29- - - - - -31］．然而，到目前为止，很少有紧急耐药性的报告溃疡分枝杆菌隔离[8，32］．这就需要对抗性进行更多的研究溃疡分枝杆菌隔离。有效的药物制定政策将取决于可获得的有关耐药情况的信息溃疡分枝杆菌隔离。这将为抗生素使用的决定提供信息，帮助审查药物政策，并引入更有效的药物组合。

目前的研究是在两个被加纳卫生局确认为BU流行地区的社区进行的[12］．尽管这项研究可能不能代表全国布鲁里溃疡耐药挑战的总体状况，但了解这些流行地区的情况并监测可能出现的耐药菌株是很重要的。这种监测活动是非常必要的，特别是在目前使用抗生素治疗布鲁里溃疡的情况下。一般来说，临床耐药流行率较高溃疡分枝杆菌据报道，加纳的隔离率很低(0.9%)[32］．与此同时，也无法保证利率会继续保持在低水平。这是因为由于各种因素造成的耐药性确实时有发生，因此需要监测[22］．在电流中使用的分离物所表现出的电阻类型超出了本研究的范围，值得研究。

未发现对链霉素和利福平均有耐药性的分离株。这是大多数链霉素和利福平药物敏感性研究报告的全球性和区域性现象，支持链霉素-利福平联合治疗的高效性[33］．也有报道利福平作为单药治疗时出现耐药性[23，与目前的观察结果相似，因为利福平和链霉素已经使用了近10年，这清楚地表明(i)循环的突变率相对较慢溃疡分枝杆菌分离株和(ii)抗生素被充分使用，最重要的是，患者的有效依从限制了循环分离株变异的潜力。如前所述，尽管用于研究的分离株来自治疗失败和慢性创伤持续时间超过预期的患者，但大多数分离株在体外没有表现出耐药性。因此，这些慢性溃疡对治疗无反应可能归因于受影响病变的药物灌注挑战，因为这些慢性溃疡也明显是坏死的。此外，该研究的结果不能预测到临床溃疡分枝杆菌从正常愈合的伤口中提取的分离物。

5.结论

本研究提请注意溃疡分枝杆菌在加纳一些布鲁里溃疡流行社区中分离出对链霉素和利福平耐药的菌株。尽管突变率很低，但仍然需要定期确定分离株的DST值，作为一种有效的监测和疾病监测工具。这将加强控制布鲁里溃疡病的努力，这是一项重要的公共卫生挑战。

缩写

部:	布鲁里溃疡
巴德:	布鲁里溃疡疾病
溃疡分枝杆菌：	溃疡分枝杆菌
NMIMR:	野口纪念医学研究所
“大酒店”:	加纳卫生局
菌落:	集落形成单位
耐多药:	多药耐药性
人:	世界卫生组织
L-J:	Lowenstein-Jensen
RIF:	利福平
STR:	链霉素
NBUCP:	全国布鲁里溃疡控制规划
百慕大:	结核分枝杆菌
结核病：	肺结核。

竞争利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

伊妮德·奥乌苏构思并设计了实验;Mercy Jemima Newman, Nana Konama Kotey和Amos Akumwena参与了数据的收集和分析以及手稿的起草工作。Enid Owusu, Elizabeth Bannerman和Amos Akumwena对数据的解释做出了贡献。伊丽莎白·班纳曼和梅西·杰迈玛·纽曼共同开发了手稿的结构和论据。Mercy Jemima Newman和Enid Owusu进行了关键的修改并批准了最终版本。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

这项工作是在德国学术交流(DAAD)的财政支持下进行的。作者要感谢卫生部公共卫生参考实验室和加纳大学生物医学和联合健康科学学院医学微生物系的所有工作人员。他们也感谢Eric Aboga先生、Ansah先生、Honesty Ganu先生和Maxwell Quartey先生这些人提供的友好援助。

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