优化培养基用于生产细胞外淀粉酶的介质Pseudomonas StutzeriISL B5从市政固体废物隔离

抽象的

城市生活垃圾的管理是当今世界面临的重大问题之一。利用微生物酶对固体废物进行可持续管理是时代的需要。在本研究中，我们从城市生活垃圾中分离到一株产淀粉酶的菌株(ISL B5)。菌株被鉴定为stutzeri假单胞菌（P.stutzeri）通过生物化学和16S rDNA测序。优化结果表明，菌株ISL B5在含2%淀粉(2.77 U/ml)、0.8%蛋白胨(2.77 U/ml)和0.001% Ca的液体培养基中活性最高²⁺pH 7.5 (2.59 U/ml)，温度40℃(2.63 U/ml)，孵育25 h (2.49 U/ml)。在pH为8 (2.49 U/ml)的条件下，粗酶活性最高。

1.介绍

微生物是产生酶的最重要的来源，酶可用于人类的各种目的。微生物酶具有生产成本低、工业发酵罐大规模生产的可能性、广泛的理化特性、基因操作范围和快速培养发展等优点[1]微生物产生的酶也比植物和动物产生的酶更为活跃和稳定[2］.上述特性使微生物酶适用于各种工业应用[3.］.此外，由于微生物可以通过发酵在短时间内大量培养，它们是酶的另一种来源。目前，微生物酶被认为对可持续技术和绿色化学越来越重要[2，4］.

淀粉酶是生物技术领域的重要酶之一。它进行淀粉的水解以产生葡萄糖[5]近年来，微生物生产因其在食品、烘焙、洗涤剂和纺织行业的广泛应用而取得了优势[6]使用微生物有许多优点，因为它们能够大规模生产淀粉酶，并且很容易对所需产品进行操作[7］.α-淀粉酶已经从许多真菌、酵母、细菌和放线菌中获得;然而，来自真菌和细菌来源的酶被认为最适合应用于工业部门[8］.几种微生物能够制造淀粉酶，包括芽孢杆菌spp。乳酸菌，假单胞菌服务提供商。，普罗透斯，大肠杆菌,链霉菌SP。［9］.

城市生活垃圾管理是当前世界面临的重大问题。固体废物的可持续管理之一是将其消化，产生可作为资源使用的最终产品。据报道，包括生物肥料在内的几种产品是从城市固体废物中生产出来的。一些报道认为，城市生活垃圾可以转化为多功能高效的生物肥料。从城市固体废物中产生的生物肥料富含具有各种能力的微生物，因为这些产品是由微生物活动产生的，微生物使用各种基质，如淀粉、纤维素和蛋白质。堆肥是将有机废物转化为生物肥料的一种方法，以减少可能导致环境污染的无机化合物的使用。这种转化是微生物作用的结果，微生物将复杂的碳源转化为产生的能量。微生物对环境产生的酶导致了这一过程[10］.

本研究旨在探索城市垃圾中存在的淀粉分解菌的淀粉物质转化能力。为了实现这一目标，对淀粉分解菌进行分离、鉴定和鉴定，并对淀粉酶的部分特性进行研究，包括底物、温度、温度和酶解时间的影响进行nd-pH测定。

2.材料和方法

2．1．样品收集

在本研究中，为了分离淀粉酶生产者，从印度西孟加拉邦马尔达镇的市政固体废物沉积区收集土壤样品。将土壤样品收集在灭菌的聚乙烯袋中，并将冰袋带到实验室。

2.2.淀粉酶产生菌的分离

一克 g） 称量土壤样品的重量，并将其添加至9 毫升无菌蒸馏水。连续稀释至10毫升⁻⁴稀释，然后0.1 使用铺展平板法，向添加1%淀粉的营养琼脂中添加每毫升稀释液。琼脂平板在37°C下培养24-48小时 产生光晕区的菌落被指定为淀粉酶产生菌，采摘并保存在添加1%淀粉的钠斜面中。

2.3.特性和识别

通过以下形态学和生化测试，如革兰氏染色、日立扫描电子显微镜(S-530)扫描电镜(SEM)、过氧化氢酶测试、碳水化合物产生酸和气体、硝酸盐还原、蛋白质水解、明胶液化、和Voges-Proskauer (VP)测试[11，12］.

该菌株通过生化和分子方法鉴定。生物化学上，使用BiomerieusVitek 2系统对该染色进行鉴定。

为了进行分子鉴定，按照Stafford等人的方法从24小时龄的培养物中提取基因组DNA[13］.DNA用冷冻乙醇(100%)从水相中沉淀，12000 rpm离心15 min成球，然后用70%乙醇洗涤离心。球团风干后悬浮在pH为8的TE缓冲液中。

对于PCR扩增，通过将模板DNA（50ng）与聚合酶反应缓冲液，DNTP混合物，引物和TAQ聚合酶混合来扩增DNA。聚合酶链反应在总体积为100 μ.l，包含78 μ.l去离子水，10 μ.l 10倍Taq聚合酶缓冲液，1 μ.1U Taq聚合酶，6μ.l 2 mM dNTPs, 1.5μ.100 mM正反向底漆，3.5μ.l/50 使用正向（704F 5′GTAGGGTGAATGCGTAGA 3′）和反向PCR扩增16S rRNA基因（907R 5'CCGTCAATTCMTTTGAGTTTAG 3 ')引物。PCR在94°C程序,最初变性5分钟,紧随其后的是30个周期为30秒94°C的变性,退火30秒的61°C,在70°C和扩展2分钟和最后一个扩展在72°C 7分钟thermocycler(应用生物系统公司,2720)。扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳，PCR扩增产物得到纯化。从印度艾哈迈达巴德的Xcelris实验室对纯化的DNA进行测序，从PCR产物中获得的16S rDNA序列进行BLAST分析。DNA序列通过BankIt程序存入NCBI GenBank，完成注释并给出登录号后作为序列获得批准。进化历史是由邻居连接方法推断出来的[14］.系统发育分析在MEGA 4.0软件中进行[15］.

２.４.测定淀粉酶的

对于测定，先前接种的营养淀粉肉汤在8000℃下离心取上清液为粗酶源。淀粉酶的测定方法参照Jamieson等[16].简言之，一 将ml稀释酶溶液添加至1 ml底物，然后在37°C下培养三分钟；两次 添加ml显色剂以停止酶反应；在沸水浴中加热试管5分钟以影响颜色变化，然后用自来水冷却，并在470℃下在分光光度计中读取吸光度 分光光度计波长[17］.淀粉酶活性的单位用每分钟释放的麦芽糖的微摩尔来表示。

2.5。淀粉酶生产优化

对培养时间、温度、pH、碳源、氮源和金属离子等参数对分离菌株淀粉酶产量的影响进行了标准化。

2.6.潜伏期的影响

接种后，将烧瓶在35°C下培养5 ~ 30小时。

2.7.温度的影响

研究了不同温度(28°C ~ 48°C)下，营养淀粉培养液中温度对淀粉酶生产的影响。

2.8。pH.的影响

将该细菌接种在营养淀粉培养液中，调节pH从5.0到8.0，研究淀粉酶的产生与初始培养基pH的关系。

使用缓冲液（0.1）测试反应混合物的pH值对淀粉酶产生的影响 M） 不同pH值。通过使用磷酸钠（pH 6）、磷酸钾（pH 7）、tris-HCl（pH 8）和甘氨酸-NaOH（pH 10）缓冲液，在酶分析期间保持反应混合物的不同pH值[18，19］.

2.9。碳源效应

研究了不同碳源如淀粉、蔗糖、葡萄糖和甘露醇在浓度为2%时对淀粉酶产生的影响。通过添加不同浓度的淀粉(0.2% ~ 4%)，测定淀粉浓度对淀粉酶产量的影响。

2.10。氮源效应

通过使用不同的有机和无机氮源（0.6％），例如牛肉提取物，氯化铵，蛋白胨和胰蛋白胨来确定氮源对淀粉酶产生的影响。通过补充具有不同浓度的蛋白胨的营养淀粉肉汤，检查蛋白胨在不同浓度对淀粉酶产生的影响，范围为0.3-2.0％。

2.11.金属离子的影响

通过用不同的金属离子，铁离子，锌，锰和钙浓度以营养淀粉肉汤（0.001％）以0.001％的浓度进行检查，检查金属离子对淀粉酶产生的影响。20］.

2.12。统计分析

所有优化研究一式三份进行，并使用单向分析（ANOVA）进行分析数据。所有数据都以图形方式显示为三倍体的平均值±SD（)使用SPSS软件进行方差分析。P值< 0.05被认为是显著的，置信限为95%。

3.结果

共分离到25株具有淀粉酶活性的菌株。其中，ISL B5菌株在用Lugol碘溶液浸水时，菌落周围的清除率最高。对分离株ISL B5进行了形态学和生物化学特征分析。光镜观察结果为杆状革兰氏阴性菌。扫描电镜证实了分离物的形态。

通过生物化学和分子生物学技术鉴定了该菌株的特性。从生物化学角度，采用生物梅里厄斯- vitek 2体系对该菌株进行鉴定Pseudomonas Stutzeri基于16S rDNA基因同源性的分子分析鉴定ISL B5为Pseudomonas Stutzeri与NCBI Genbank数据库中的相应菌株相似于99％，查询覆盖率为95％。得到的序列与来自NCBI Genbank的em-型分离序列对齐，用于鉴定以及研究与其他离型序列的系统发育关系（图1）.进化距离采用最大复合似然法计算[21，22］.核苷酸序列保存在NCBI GenBank数据库中，登录号为KT748761。

淀粉酶的发酵生产p . stutzeriISL B5在培养期、温度、pH值、碳氮源和金属铁方面进行了优化。接种后，在30°C下培养烧瓶，并在不同时间间隔测量酶活性（图2）.在孵育25小时后，分离物在25小时后显示出最高产量的淀粉酶（2.49u / ml）。由于分离物的生长减少，25小时后，酶的产率降低。

通过将烧瓶保持在28°C到48°C的不同温度下25 h来评估温度对酶生产的影响(图)3.）.在40℃（2.63 U / mL）下检测最大酶产生。酶产生低于低于40℃的温度。

介质pH从5.0至8.0调节，以进行淀粉酶生产的评估（图4（a）).25岁以后 培养h后，观察到在pH值为7.5时，酶的产生量最大（2.59 U/ml）通过ISL B5菌株获得。在酶分析期间，还通过使用磷酸钠（pH 6）、磷酸钾（pH 7）、tris-HCl（pH 8）和甘氨酸-NaOH（pH 10）缓冲液测试反应混合物的pH值对淀粉酶生产的影响（图4（b）) [18，19］.观察到，在孵育25小时后，含有三盐酸缓冲液(pH 8)的反应混合物淀粉酶产量最大(2.49 U/ml)。

将分离菌株ISL B5接种在含有淀粉、蔗糖、葡萄糖和甘露醇的营养肉汤中，以显示碳源对淀粉酶生产的影响(图)5(一个))淀粉在浓度为2%时产酶量最高（2.77%） U/ml）（图5 (b)）.

以牛肉提取物、氯化铵、蛋白胨和胰蛋白酶胨为试验材料，研究了不同氮源对淀粉酶产量的影响，在0.8%蛋白胨浓度（2.77%）下酶产量最高 U/ml），而氯化铵的酶生产能力最低（图6（a）和6（b））.

铁、锌、锰和钙离子在非常低的浓度被用来确定金属离子对淀粉酶生产的影响(图)7)25小时后，含钙离子的肉汤表现出最高的产酶能力（2.49%） 而亚铁离子的产酶能力最低。

4。讨论

从城市垃圾中分离出25株细菌；从中分离出ISL B5，鉴定为stutzeri假单胞菌，显示出最高的淀粉酶活性。几份报告表明，许多从固体废物中分离的细菌显示出具有显着效率的淀粉酶活性[23］.在细菌隔离,芽孢杆菌SP。［24),假单胞菌SP。［25]他们经常生产淀粉酶。

p . stutzeriISL B5在孵育25小时淀粉酶产量最高。超过这个潜伏期，淀粉酶活性开始下降。这可能是由于该菌株的生长减少所致。大多数研究报告说，在35到48小时之间酶的产量最高[26，27];而ISL B5在25 h后表现出最佳产量，为工业应用提供了早期采收时间。

压力p . stutzeri在40℃及以上，淀粉降解活性低。这可能是由于生长速度下降和负责淀粉降解酶的基因失活[28］.大多数产淀粉酶菌株的pH值在6.0 - 7.5之间，以保持正常生长和产酶[29]目前的细菌菌株在pH 7.5时显示出最大的酶产量。反应混合物中的酶活性在pH 8时达到最高。Samanta等人[30]也报道了最高的淀粉酶活性Cronobacter坂乔pH值为8时为52。

以单糖或多糖形式补充碳源可诱导淀粉酶的产生。在我们目前的研究中，淀粉的影响比其他碳源的影响更大。甘露醇是第二个最佳补充碳源。葡萄糖的淀粉酶活性最低。据报道，不同的碳源对淀粉酶的产生有不同的影响[31]类似的发现表明，在嗜热古菌的情况下，葡萄糖抑制淀粉酶的产生硫化叶菌solfataricus［32]他们还报道了葡萄糖抑制淀粉酶基因的表达。

氮源是生物体的二次能源，在生物体的生长和有价值的酶的产生中起着重要的作用。化合物的性质和我们使用的浓度可能会影响或下调酶的产生[27］.在本试验中，氮源对淀粉酶生产的影响表明，蛋白胨是较好的氮源p . stutzeriISL B5。

金属离子对来自细菌和真菌的几种淀粉酶的影响已经得到了很好的研究。众所周知，大多数淀粉酶是金属离子依赖的酶，这些离子是二价阳离子，如锰²⁺，Zn.²⁺，毫克²⁺，约²⁺，及²⁺［17]在离子存在下淀粉酶活性的增强可能是基于其与带负电的氨基酸残基（如天冬氨酸和谷氨酸）相互作用的能力[33］.该研究显示了钙离子存在下最高的酶活性。根据Burhan等人的说法。［34]， 的情况下芽孢杆菌服务提供商．钙离子增加了淀粉酶的产生[35也报道了不同浓度的钙影响淀粉酶的产生及其活性。淀粉酶的晶体结构表明，钙离子在与淀粉酶a结构域Asn 100和His 201残基以及与B结构域Asp 159和Asp 167残基的离子相互作用中起有害作用。也有报道称淀粉酶的活性位点位于A域和B域之间，钙通过连接这两个域来促进酶的稳定性和催化活性[36，37］.

在本研究中，我们从城市生活垃圾中分离并鉴定了产生淀粉酶的细菌。我们的研究表明，城市固体废物可以作为有益微生物的生产来源;可成功地大规模应用于城市生活垃圾中淀粉类废弃物的处理。的隔离Pseudomonas StutzeriISL B5能够耐受各种不利条件，如广泛的pH值和温度范围，并且具有显著的有毒金属离子耐受性，这使其成为酶工业以及固体废物管理领域的一种有前途的接种剂。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

Prajesh Dutta和Akash Deb进行了分离、鉴定和优化等实验室工作，并撰写了手稿。Sukanta Majumdar参与了统计分析并监督了整个工作。

致谢

作者感谢位于印度艾哈迈达巴德的Xcelris实验室在16S rDNA测序方面的帮助。

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