文摘
IV型分泌系统(T4SS)由革兰氏阴性细菌可能促使蛋白质和DNA基质细胞信封到靶细胞。黄citri无性系种群。citri包含T4SS的两个副本,一个,另一个是plasmid-encoded染色体。了解T4SS的诱导表达的条件Xcc我们分析,在体外和在足底,从T4SS 18个orf的表达和7假设RT-qPCR侧翼基因。作为一个积极的控制,我们还评价了29个orf的表达从III型分泌系统(T3SS),因为这些基因表达在植物感染状况,但不一定是在标准培养基。从29日T3SS qPCR基因分析,hrpA在72 h后接种表达下调。与T4SS是相关联的所有基因表达下调柑橘类接种后叶子72 h。我们的结果表明,不同于T3SS, T4SS不是在感染过程中诱导。
1。介绍
黄citri无性系种群。citri(Xcc)是一种革兰氏阴性植物病原细菌,导致许多经济上重要的柑橘类植物(严重疾病1]。Xcc诱导的柑橘溃疡病是一种破坏性疾病,其特征是溃疡病变在叶、茎,和水果;此外病原体引起落叶,从而减少产量和过早落果[2]。控制的区域是困难的疾病已经建立,和植物根除是唯一有效的方法控制和防止疾病传播。复发性病原体和严重袭击负责全世界柑橘园(严重的经济损失2]。
本研究的重点是旨在了解细菌分泌系统的作用,特别是IV型分泌系统(T4SS)。七个分泌系统是已知的和描述的原核生物,和每一个相关的生理过程(3- - - - - -5]。其中,最好的研究是III型分泌系统(T3SS),使细菌病原体提供效应蛋白在真核细胞(6]。一些细菌病原体,包括物种衣原体、黄、假单胞菌、Ralstonia志贺氏杆菌,沙门氏菌,大肠,鼠疫,取决于T3SS诱导损坏主机。相比之下,其他生物体包括根癌土壤杆菌、幽门螺杆菌,嗜肺性军团菌依赖于IV型分泌系统(T4SS)毒性感应(7]。
T3SS包含至少20个不同的蛋白质,这是分为三个部分。系统的基体(8- - - - - -11)与一个atp酶和可能促进基质进入分泌器(12]。这种基体也与蛋白质相关针T3SS(第二部分),细菌对宿主细胞结合,并作为效应器分泌的管道。T3SS的第三部分是由三个蛋白质,通过细菌针和出口形成孔隙表面的宿主细胞,促进出口的毒素到目标细胞质(13]。
另一方面,T4SS multiprotein复杂,由一种通道(编码的蛋白质virB和virD)通过蛋白质或protein-DNA复合物之间可以进行细菌(细胞间通信),进入宿主细胞(14]。易位是由许多细胞质atp酶潜在激励大易位构象变化复杂的(15]。有三种功能类型的T4SS。第一种,发现在许多革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和古生菌,函数共轭和本文分别到植物细胞的转移农。第二种T4SS介导DNA在转换过程中吸收(中发现幽门螺旋杆菌)。第三种类型的T4SS用于有毒效应蛋白或蛋白复合物转移到宿主细胞的细胞质中发现百日咳博德特氏菌,嗜肺性军团菌,铜绿假单胞菌,Xcc)[15]。
基质T4SS运输的调节各种细胞过程包括细胞凋亡、水泡交通,和泛素化;此外,IV型效应蛋白的数量继续增加(16- - - - - -19]。然而,大多数这些基板没有功能的特点,及其在细菌作用发病机理仍然未知(20.]。
在许多细菌,这两个分泌系统类型特征;然而,在、黄种虫害只有T3SS已经深入研究[1),与数量有限的研究涉及T4SS [21,22]。在Xcc T4SS更值得关注,特别是因为这个系统的基因组包含两份(染色体和plasmid-borne) (23]。质粒复制是同源Xanthomonads包含T4SS在染色体外的DNA。然而,只有Xcc和黄定包含染色体T4SS的副本。
理解的条件刺激T4SS基因的表达Xcc我们使用qPCR分析在体外和在足底表达式的18个orf T4SS(染色体和质粒拷贝)和7假设orf T4SS侧翼。验证qPCR数据,我们表达的29个orf T3SS相比,这是已知的表达在足底。
我们的研究结果表明,T4SS不是在感染过程中诱导Xcc,但可能在细胞间的沟通是非常重要的。
2。材料和方法
2.1。微生物过程
Xcc菌株306年以前由da Silva测序et al。23]。Xcc保持在无菌自来水和生长在营养琼脂(NA)中包含3 g牛肉膏,5 g蛋白胨,15克琼脂在蒸馏水1 L 28°C。24小时后,三个单菌落转移到新NA盘子和孵化12 h 28°C。这些Xcc坚实的文化被用作pre-inoculum在足底和在体外研究。为在足底研究中,pre-inoculum文化被包含50毫升无菌转移至无菌瓶营养肉汤(NB)和细菌浓度调整到108CFU /毫升(OD600年= 0.3)。这种细菌悬液1毫升了针头注射器,用渗透橙树叶(素类简历。啤梨)生长在20 L容量锅。总共有九个植物接种每植物叶子(20)72 h增长和维护房间28°C, 12 h光周期和光强度2000勒克斯。三种植物被用于每个潜伏期。乘法运算后,接种叶收集,用刀片切成细条,放置在一个无菌蒸馏水的烧杯在冰浴温柔的风潮。每个工厂的样本被放置在不同的细菌分泌的烧杯。5分钟后,叶碎片被通过纱布过滤,离心和细菌细胞恢复的5000g在4°C为5分钟。立即总RNA提取,如下所述。为在体外研究中,1毫升Xcc悬挂在108CFU /毫升无菌转移到三厄伦美厄烧瓶和孵化12 h在28°C (200 rpm)。孵化后,细菌细胞在5000年被离心收获g为5分钟。总RNA提取如下所述。因此,我们获得了三个独立的生物复制Xcc增长在体外和在足底。培养媒体都从Difco化工有限公司获得美国底特律。确认RT-qPCR,一切程序都是相同的,除了植物潜伏期只有72 h,由于RNA质量和浓度足以产生可靠的结果。72小时时间点是最短时间内允许获得满意的细菌质量提出的涉及基因表达的分析。细菌细胞的浓度在短时间内(12或24小时)不允许。出于这个原因,一些作品使用培养基模拟植物环境调查感染过程在这些时间尺度(24,25]。
2.2。RNA的提取Xcc
每个接种瓶代表一个独立的生物复制。RNA提取使用Illustra-RNAspin微型RNA隔离设备(Amersham生物科学)后,制造商的指示。以确保没有包含DNA样本,使用RNA PCR进行样品处理DNase我作为模板。PCR条件由最初的94°C的变性一步3分钟,其次是35周期在94°C的变性30年代,30年代退火60°C,伸长为2分钟72°C。最后一个72°C的伸长一步执行4分钟,然后样本保持在4°C,直到需要。放大反应进行的总量25μ包含200 ng RNA在2.5 Lμ(2.5 L, PCR缓冲μL,表达载体),1.5毫米MgCl20.2毫米核苷酸,300 nM 16 s rRNA底漆(26),和1 U Taq DNA聚合酶(表达载体)。产品在1%琼脂糖凝胶电泳TAE缓冲区,和溴化乙锭染色,使用紫外线透照器可视化。没有观察到产品(数据没有显示)。验证提取RNA的质量,分析的样本使用TAE在1%琼脂糖凝胶电泳缓冲溴化乙锭染色紧随其后。A260/280比率的RNA样品测量,RNA是量化使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德、美国)。RNA样本存储在−80°C,直到需要。
2.3。使用RT-qPCR基因表达
首先RT-qPCR链cDNA合成和反应是使用上标III第一链合成SuperMix RT-qPCR(表达载体)推荐的制造商的规范除了在每个反应的cDNA, 20 ng。所有与SYBR PCR进行绿色7500实时PCR仪(应用生物系统公司)使用三个生物复制和三个技术复制(每个生物复制)。PCR为2分钟50°C, 10分钟在95°C,紧随其后的是40 15秒的周期在95°C,和1分钟60°C。确定聚合酶链反应效率,标准曲线生成使用互补脱氧核糖核酸样品五稀释,以一式三份。rpoB, atpD,gyrB被用作参考基因在所有实验(26]。执行相对表达分析,我们使用了CT方法(27]。引物特性展示在表1。
3所示。结果与讨论
3.1。T3SS qPCR结果
的结果Xcc日益增长的在足底或在体外提出了在图1。从29日T3SS qPCR基因分析,hrpA是表达下调72 h后接种(图1 (b))。hpa1,hpaB,hrpD6,hrpE,hrpF显示的表达率最高,而阶段,hrpG,hrpX,hrcA显示表达式的最低水平。有趣的是,hrpB4和hrpXct,这被证明是必要的Xcc发病机制(28),没有最调节基因在这个研究。
(一)
(b)
3.2。T4SS qPCR结果
结果T4SS基因的表达水平在足底和在体外如图2。与T4SS是相关联的所有基因表达下调柑橘类叶子72 h后接种(图2 (c))。我们还假设基因附近的表达分析virB在染色体DNA (XAC2606 XAC2611、XAC2613和XAC2622)和质粒pXAC64 (XACb0035, XACb0042, XACb0043 XACb0048, XACb0049)(图2 (d)和表1)。orf代表假设基因在染色体和质粒时被抑制Xcc培养在素类72 h。一个例外是XAC2611,表达时类似Xcc培养在培养基还是在足底(图2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
我们的研究结果清楚地表明不同基因表达谱T3SS T4SSXcc在柑橘类感染。描述的T4SS以前农,它介导的DNA和蛋白质基质,植物和其他生物通过细胞contact-dependent机制(14]。在Xcc基因组序列显示,两个的存在virB操纵子,一个在64 kb的染色体和第二个拷贝质粒pXAC64 [23]。染色体的基因virB1,virB3,virB4,virB8,virB9,virB11和plasmid-encoded基因virB1,virB2,virB4,virB6,virB9,virB11都是下调在足底(图2 (c))。这有点奇怪,因为T4SS对于成功是至关重要的许多革兰氏阴性致病菌感染(29日]。这一事实并代表假设基因在染色体和质粒附近virB也被下调基因在同等条件下(图2 (d))表明,他们可能与T4SS系统Xcc。最近的研究在布鲁氏菌是(30.),在农(31日)表明,改变VirB8导致蛋白质二聚作用,这一过程修改T4SS结构和影响细菌的毒性。在猪链球菌(32],淘汰赛的vird4 - 89 k和virb4 - 89 k的T4SS消除高度致命的毒株的杀伤力和受损引发小鼠宿主免疫反应的能力。最近的研究继续演示的重要性T4SS毒性及其组件;因此缺乏诱导Xcc T4SS基因在目前的研究是有趣的。然而,在黄定pv。定T4SS-deletion显示突变体与野生型相同的毒性和作者得出这样的结论:T4SS没有参与致病性、黄(33]。
王等人。34]提出的证据表明,在足底37 kb转移质粒(pXcB)黄aurantifolii来黄citri可以通过T4SS发生。因此,至少在T4SS副本Xcc水平基因转移质粒可以扮演一个洞。
除了29个T3SS的基因之一Xcc被上调在足底。拉娅et al。28)表明,Xcc突变体包含突变hrpB4或hrpXct未能引起疾病和柑橘叶片增长低于野生型Xcc306菌株。这两个基因,不最上调基因在目前的研究中,的一部分合(高度敏感反应和致病性)系统和组成部分T3SS [35]。在相关病原体,黄定pv。实验(Xcv),一个hrpB4突变体不能引起疾病的易感胡椒植物或过敏的反应在胡椒植物携带各自兼容的R基因(36]。在此之前,hrpXv被证明是必要的转录激活五合基因(基因座hrpB来hrpF)[37),而hrpB4需要完成的功能T3SSXcv(36]。因此显而易见,基因不需要强烈的差异在感染毒性中发挥重要作用。多种基因,包括hpaA,hpaE,hpaF,hpaP,hrpB, hrpB1,hrpB2,hrpB7,hrpD5,hrpM,hrpW,hrcC,hrcQ,人权组织,hrcT。和hrcV都表达了类似的水平hrpXct和hrpB4,都非常适合他们的角色在柑橘溃疡疾病的进一步研究。
最上调基因,hrpD6需要进一步关注。一个hrpD6突变体的黄oryzaepv。oryzae(Xoo语)未能在烟草和引发过敏的反应是不致病的大米,因为突变hrpD6影响T3SS效应器的分泌,比如Hpa1通过T3SS转移(38]。我们的qPCR数据显示hpa1是最上调基因在吗素类感染Xcc,紧随其后的是hrpD6(图1 (b))。相反,hrpA编码的一个重要组成部分,T3SS纤毛(39),是抑制在我们的研究。在此之前,hrpA突变体的两pv。番茄DC3000显示减少的积累结构组件合菌毛(39]。Haapalainen et al。40)表明,可溶性植物细胞信号诱导的表达合/ hrc特别是上调基因hrpA。有趣的是,他们发现HrpA不积累高水平细胞,这表明某种反馈调节分泌和生产HrpA之间发生,也许通过降解细胞内HrpA。我们的工作表明,这可能也适用hrpA基因Xcc:它的信使rna可能是退化的速度,就像发生在HrpA两。
4所示。结论
我们发现确认T3SS基因诱导成功的感染素类通过Xcc,因此优秀的目标来帮助控制或减少柑橘溃疡病的严重程度,而与毒性T4SS似乎没有任何关系。另一方面,我们的结果表明,T4SS不是诱导感染相同的条件下,这可能表明,没有必要为感染但只有细胞间的沟通。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是支持由Fundacao德帕罗尽管做Estado de圣保罗(FAPESP)必须占州政府,底部de Defesa da Citricultura (FUNDECITRUS) Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)生物测试和奖学金资助,并由Fundacao德帕罗尽管做Estado de米纳斯吉拉斯(cbb - apq - 04425 - 10)Xcc功能创建数据库。资助机构没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。