文摘

乳酸菌(实验室)是无处不在的,著名的共生的细菌在人类和动物的微生物区系。实验室进行了广泛的研究和应用在各种工业和食品发酵。它们广泛应用于人类和动物作为佐剂,益生菌配方,膳食补充剂和其他食品发酵的应用程序。在目前的调查,实验室被孤立的从原料奶样本收集当地奶牛场的哈里亚纳邦,印度。此外,分离筛选同时生产生物表面活性剂和细菌素。生物表面活性剂产生被发现是一个类似于糖脂的脂质和糖的混合物。获得的细菌素被发现热稳定在100°C(5分钟)。此外,菌株的DNA提取并放大了16 s rRNA使用通用引物测序。的隔离干酪乳杆菌MRTL3被发现一个强有力的生物表面活性剂和细菌素生产商。似乎食品工业作为一个潜力巨大biopreservative和/或食品成分。

1。介绍

益生菌是活的微生物制剂,有好处在主人的健康管理在适量(1]。一系列有益的益生菌已报告,包括改善消化(2),止泻的属性(3),和预防食源性致病菌的4]。食源性致病菌如单核细胞增多性李斯特氏菌,l . innocua,铜绿假单胞菌,伤寒沙门氏菌,金黄色葡萄球菌,美国epidermidis,蜡样芽胞杆菌不仅对人体健康是有害的,而且还会导致食品变质。尽管化学防腐剂有效地抑制食源性致病菌的生长,其使用在食品工业仍在审查,其中一些已经被报道是不安全的对人类健康和环境。实验室生产大量的抗菌化合物如有机酸、H₂O₂双乙酰,酶、细菌素和生物表面活性剂对食品变质和病原菌有效。在这些抗菌药物代谢物,发现了细菌素作为一个潜在的安全类biopreservatives。例如,乳酸链球菌肽产生的细菌素Lactococcus lactis,近十年以来一直使用扩展保存食品的保质期(5,6]。细菌素是潜在biopreservatives,特别是肉类,包装食品,乳制品(7]。大量的报告显示细菌素的潜在用途的控制特别重要的胃病原体沙门氏菌sp。8),空肠弯曲杆菌,l . monocytogenes(9),而大肠杆菌O157: H7 (10]。

微生物生物表面活性剂两亲性代谢产物有明显的表面活性与广泛的化学结构(如糖脂、lipopeptides polysaccharide-protein复合物,磷脂、脂肪酸,和中性脂质)与几个优于化学表面活性剂,也就是说,低毒性、生物可降解,和有效的在不同的温度和pH值范围(11,12]。他们被用于制药工业应用,生物医学,和食品加工行业11,13,14]。本文处理的生物技术潜力的研究菌株l .干酪乳杆菌MRTL3。选择性的潜力菌株细菌素和生物表面活性剂产品被描述。

2。材料和方法

2.1。乳酸菌的分离

各种病毒的实验室被浓缩分离原料奶100毫升无菌基本培养基(MM)与2%石蜡为碳源。悬架是在37°C 48 h孵化器孵化及瓶(新南威尔士州、印度)和夫人亚文化在介质(15]。进一步,这些孤立的文化受到一系列的生理、生化和特有的标准识别测试16]。隔离是储存在−20°C夫人汤含有20% (v / v)甘油股票为主股票直到他们进一步使用。的隔离MRTL3被选作进一步的研究。

2.2。生物表面活性剂和细菌素提取

隔离是生长在汤夫人在37°C 72 h。细胞自由浮层(CFS)与5 M盐酸调整pH值6.5,在100°C加热3分钟,离心机在10000克15分钟10°C细菌素的复苏。另一方面,生物量与软化水清洗两次,离心机(10000克,15分钟,10°C), resuspended在磷酸缓冲盐的体积(PBS;pH值7.0),在室温下2 h,孵化和离心机(10000克,15分钟,10°C) PBS提取的生物量。

2.3。生物表面活性剂的生产

隔离产生的生物表面活性剂MRTL3测定通过测量表面张力(ST)的文化上层清液,以防分泌生物表面活性剂和PBS的提取物的cell-bound生物表面活性剂。复苏的cell-bound生物表面活性剂,发酵培养基是离心机(10000克,15分钟,10°C)的细胞恢复洗两次软化水和resuspended PBS (pH值7.0),在室温下2 h孵化,离心机(10000克,15分钟,10°C)。圣环样品测定的方法(17使用张力计(劳达、德国)配备了1.9厘米德诺伊在室温下白金戒指。约10毫升样品被撤回每12 h和表面张力测量。

2.4。细菌素的生产

样品的pH值调整到6.5,5 M氢氧化钠,在100°C加热3分钟,离心机(10000克,15分钟10°C)。细菌素的提取是定性的存在取决于琼脂扩散试验方法金黄色葡萄球菌(写明ATCC 6538 p),美国epidermidis(写明ATCC 12228),弗氏志贺菌(写明ATCC 9199),伤寒沙门氏菌(MTCC 733),铜绿假单胞菌(写明ATCC 15442),蜡样芽胞杆菌(写明ATCC 11770),单核细胞增多性李斯特氏菌(MTCC 657)l . innocua(写明ATCC 33090)生长在脑心浸液37°C (BHI;Himedia、印度)。慢性疲劳综合症的抗菌活性是由扩散法(17)与轻微的修改。隔夜的慢性疲劳综合症(16 h)的文化l .干酪乳杆菌MRTL3生长在汤夫人在37°C是通过离心(10000克15分钟4°C)和pH值调整到6.5。为了避免细菌素的蛋白水解降解,CFS是煮3分钟。软营养琼脂(0.8%,w / v)被允许冷却后无菌培养皿中添加测试生物文化、成长早期的固定相。井是在草坪上的硬软琼脂和整除50μL上层清液倒在井。孵化24小时后菌株的最佳生长温度指标,明确的抑制区至少2毫米直径减少井是记录为积极的(18]。此外,生物表面活性剂产生的抗菌活性也由相同的程序。

2.5。菌落PCR (16 s rRNA基因扩增)

菌落PCR隔离的执行根据许凤et al。19]。优化的菌落PCR反应混合物包含1 x PCR扩增缓冲区(NH(20毫米₄)₂所以₄Tween-20 72.5毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液0.1%,和pH值9.0),2.5毫米MgCl₂,200年μ2.5 M每个deoxynucleotide三磷酸μ27 M每个引物(f 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1385 r 3′-AATTCAAATTTAATTTCTTTCC-5′),并在50 1.25 U DNA聚合酶μL PCR反应混合物。殖民地(大约1毫米直径)拿起消毒牙签和直接转移到PCR管DNA模板。热循环计划,运行在一个thermocycler PCR系统(埃普多夫,德国)由一个周期94°C的10分钟,51°C 2分钟,2分钟72°C,和35周期94°C的20年代,57为45°C s(每周期下降了1 s),和1分钟72°C,然后孵化72°C 5分钟,并在4°C最终孵化。

2.6。PCR检测产品

扩增DNA片段菌进行琼脂糖凝胶电泳观察到在1.3%琼脂糖凝胶在TAE缓冲区(0.04三乙酸,乙酸0.02米,0.001米EDTA),含1克/毫升SYBR绿色。短暂,10毫升每个放大的混合物和分子质量标记进行琼脂糖凝胶电泳和SYBR绿色染色。放大DNA片段被紫外线光照可视化。

2.7。16 s rRNA基因的测序和分析

ABI棱镜大染料终结者循环测序反应准备工具包(应用生物系统公司)是用于PCR产物测序。结合通用引物选择序列的基因序列。ABI棱镜上运行3730 xl DNA样本分析仪(应用生物系统公司)。每个手动对齐检查,纠正,然后采用UPGMA法分析(19]。系统发育树构建使用大型5(分子进化遗传学分析)软件(20.,21]。

2.8。产品描述

2.8.1发布。薄层色谱法

样品溶解在乙酸乙酯并应用于干预镀二氧化硅TLC板(默克公司、印度)。简单地说,生物表面活性剂分子之前提取如下。整除(4毫升)的CFS与乙酸乙酯提取两次(Rankem、印度)1:1.25为2分钟激烈的涡流。然后上阶段提取两次与乙酸乙酯和乙酸乙酯在室温下蒸发(22,23]。特征提取的产品是通过分析薄层色谱、硅胶板上。短暂,一毫升整除的原油生物表面活性剂样本集中,resuspended在5μL的乙酸乙酯,和分离的预镀硅胶板(默克公司、印度)使用氯仿/甲醇/冰醋酸(65:15:2,v / v)为展开剂系统不同post-color-developing试剂。糖是半个沾茴香醛,而脂肪酸根沾染了钼酸铵/硫酸铈(24,25]。

2.8.2。净化的生物表面活性剂

原油生物表面活性剂残留部分纯化的硅胶(60 - 120目)列筛选了梯度的氯仿和甲醇从20:1到2:1 (v / v)。分数都集中在TLC分析和溶剂蒸发。一旦干,生物表面活性剂是储存在20°C。

2.8.3。部分纯化的细菌素

CFS一夜之间从0.5 L的文化隔离MRTL3准备如前所述(部分2。4)。硫酸铵温柔地添加到上层清液保持在4°C获得60%饱和度和混合搅拌4 h在4°C。在10000 g离心1 h后在4°C,由此产生的颗粒在30毫升的25毫米resuspended乙酸铵缓冲(pH值6.5),直到进一步的使用。

2.8.4。傅里叶变换红外光谱(FTIR)

与原油生物表面活性剂分子特征进行样本,这是透析对软化水在4°C透析膜(分子量截止10000 kDa, Himedia,印度),然后冷冻干燥。生物表面活性剂的特性是由红外光谱分析通过扫描的范围4000 - 400厘米⁻¹4厘米的决议⁻¹(Model-ABB和mb - 3000)。

2.8.5。核磁共振光谱学

纯化的生物表面活性剂溶解在氘氯仿和1 h 300光谱仪使用力量进行了分析。生物表面活性剂是溶解在氘毫升氯仿(50毫克⁻¹)和光谱被记录。1 h化学变化表现在ppm相对于溶剂化学标准的转变。

2.9。统计分析

所有的值都记录在一式三份,受到标准偏差的分析通过使用SPSS统计软件包(v 16)。

3所示。结果与讨论

3.1。生物表面活性剂的生产的筛检化验

最初的分离筛选的能力生产生物表面活性剂和细菌素使用各种定性和定量方法。随着应变点接种血琼脂板,它导致一个重要区域的间隙殖民地证实了生物表面活性剂的生产。下降的崩溃测试,CFS的扁平滴油涂层表面还表示生物表面活性剂的存在。一个清晰的光环区(< 3厘米²)在驱油试验,观察到显著的乳化活性对煤油(表1,图1)。

3.2。生物表面活性剂和细菌素产量

在当前的研究中,干酪乳杆菌MRTL3测试对生物表面活性剂和细菌素产量(图使用不同的定性和定量方法1)。干酪乳杆菌MRTL3发现阳性cell-bound和分泌生物表面活性剂和胞外细菌素产量。原油细菌素和生物表面活性剂与压力干酪乳杆菌MRTL3显示显著的抗菌活性与广泛的病原体,包括革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538便士,美国epidermidis写明ATCC 12228,蜡样芽胞杆菌写明ATCC 11770,单核细胞增多性李斯特氏菌MTCC 657,l . innocua写明ATCC 33090)和革兰氏阴性细菌(弗氏志贺菌写明ATCC 9199,伤寒沙门氏菌MTCC 733,铜绿假单胞菌写明ATCC 15442)。一些生物表面活性剂和细菌素具有抗菌活性之前描述(12),但他们同时生产没有早些时候报道。Gudina et al。26)提出各种方法成功复苏的生物表面活性剂和细菌素在不同pH条件下使用Lactococcus lactis他们分别恢复这两个产品。抗菌生物表面活性剂的特性和细菌素分离干酪乳杆菌MRTL3对病原菌被发现类似获得原油生物表面活性剂恢复乳酸链球菌与不同浓度(25毫升至100毫克⁻¹)。生产媒体的表面张力降低到40.8 mN / m的初始值53 mN / m(表2)。表面张力的降低确认生产生物表面活性剂的分离及其媒体内部的积累。这样减少表面张力在对数和固定相已被报道为各种生物表面活性剂生产微生物(27,28]。

降低表面张力的文化观察肉汤的菌株72 h孵化后,尽管这些变化明显减少从9到14 mN / m夫人相比,表面张力的肉汤(53.0 mN / m)。生物表面活性剂的能力来降低水的表面张力从72.4到40.8 mN / m被认为是一个很好的一个强有力的表面活性剂的特点。生物表面活性剂的生产被发现增长相关,之间的平行关系观察生物质生产和减少文化肉汤表面张力。类似的结果已经被Gudina报道et al。26]在使用不同的乳酸杆菌在最优条件下生物表面活性剂的生产。表面张力的最小值是摇瓶实验结束时获得的。应变MRTL3显示最高的分泌生物表面活性剂产量和减少文化肉汤表面张力从53.0到40.8 mN / m。由于高产量和生物量增长受到限制的乳酸生产在摇瓶实验。文化上层的积极回应石油崩溃法和乳化能力,并减少观察表面张力。

3.3。薄层色谱分析

分离化合物检测到板作为一个粉色现货(图2)为脂肪酸和深蓝色的斑点。它证实了糖脂类生物表面活性剂的存在。

3.4。孤立的分子表征MRTL3使用16 s rRNA测序

放大DNA片段测序使用桑格双脱氧方法(29日]。正向和反向隔离是加入使用DNA序列不纯正的v 3.5.3软件最后被确认为干酪乳杆菌。从分离获得16 s rRNA基因序列与其他细菌序列通过NCBI大型爆炸(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi成对的身份)。隔离显示99%的身份干酪乳杆菌写明ATCC 334最大查询覆盖率98%。进一步,共识序列一致,相比之下,可用在NCBI数据库。16 s rRNA的孤立的细菌序列提交的基因库(NCBI)加入KC568563数量。

3.5。红外光谱谱分析

分子的组成部分纯化生物表面活性剂是由红外光谱(图3),揭示了存在的碳水化合物和脂类的组合。最重要的乐队是1736厘米⁻¹(C = O酯键),1057厘米⁻¹(多糖),3310厘米⁻¹确认哦拉伸,1400 - 1460厘米⁻¹C = H拉伸证实醣脂类根的存在。透光率的复合显示碳氢键伸展振动范围2924厘米⁻¹表明脂肪链。

3.6。核磁共振分析

复合(1 h - nmr谱的数据表3;图4)表明,复合醣脂类。质子核磁共振分析证实存在的脂质和糖生物表面活性剂的一部分。甲基酯的存在相关的生物表面活性剂的结构可以增加其疏水性,因此这将导致增加表面活性剂的权力和抗真菌和溶血性活动。

3.7。细菌素的抗菌性能和生物表面活性剂

细菌素的抗菌活性和生物表面活性剂产生的孤立l .干酪乳杆菌MRTL3测试对8致病性的文化。结果表明,文化对这些食源性致病菌(表表现出抗菌活性4)。

3.8。系统发育关系

系统发育树构建使用大型5.05软件来确定进化关系的隔离(图5)。

4所示。结论

在目前的研究中,分离(干酪乳杆菌MRTL3)拥有同时细菌素和堆肥能力识别和特征。干酪乳杆菌MRTL3显示显著的降低表面张力的能力,也展示了对各种食源性致病菌的抑制作用。此外,结构特点确定使用薄层色谱,红外光谱、1 h NMR光谱证实了醣脂类化合物。

因此,结果表明,分离获得l .干酪乳杆菌MRTL3是一个强有力的乳酸细菌作为生物表面活性剂和细菌素生产商,可能可以用作biopreservatives的来源(细菌素和/或生物表面活性剂)在食品加工行业,是一个合适的替代传统化学/防腐剂。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

格兰特从大学拨款委员会(UGC、印度)的主要研究项目(Baljeet辛格撒哈拉博士批准)是完全承认。