角蛋白酶对羽毛的高效降解芽孢杆菌sp。

摘要

产生角蛋白酶的微生物越来越多地被用于家禽羽毛废弃物的降解和回收利用(枯草芽孢杆菌）和bf21（蜡样芽孢杆菌)完全降解角蛋白。产酶量大于10 KU/mL。菌株改良后，从菌株BF11和BF21中分别分离出MBF11和MBF21。在实验室范围内优化这些MBF分离株的营养和物理参数，使其角朊酶的总活性提高了50倍，产量为518-520 KU/mL。以淀粉为碳源、豆粕为氮源的发酵培养基可维持较高的酶产量。MBF11和MBF21的最佳产酶条件分别为pH 8.5和温度45-55℃和37℃。发酵滤液中半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸和总游离氨基酸的含量均显著增加。在培养滤液中，有机硫的浓度比无机硫酸盐的浓度也相当高，这表明分离株可以水解二硫化物。

1.介绍

在全球家禽养殖业中，羽毛作为副产品大量产生。它含有丰富的蛋白质β- 应素构成91％的羽毛蛋白质。角蛋白的存在使羽毛顽固地向胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等最常见的蛋白酶，从而减缓其在自然中的降解过程[1].通常，每只鸟最多有125只 全球每周有超过4亿只鸡被加工，每天累积的羽毛废料达到500万吨[2]。大部分羽毛废弃物在自然界中回收利用率很低，由于角蛋白的化学性质不活泼，其用途有限。传统上，这些废弃物已转化为饲料添加剂，导致饲料质量差，经济上不可行[3.]因此，这种副产品的回收既不盈利也不环保。这种废物的处理是一个全球性的环境问题，导致空气和地下水资源的污染[4]．

近年来，用微生物角蛋白酶处理羽毛引起了广泛的关注和应用。角朊酶处理的羽毛越来越被认为是食物和饲料补充剂中膳食蛋白质的可行来源，因为酶处理的最终产品保留了很高的营养价值。角朊酶预计将产生一个潜在的全球市场类似于其他蛋白酶。据报道，不同种类的微生物可产生角朊酶样真菌(doratomyces microsporus.，辐射链格孢，Trichurus spiralis.，曲霉属真菌sp。，Rhizomucorsp。，Absidiasp。，白穗葡萄等。),放线菌(pactum链霉菌、alvs、thermoviolaceus、S. fraradiae、热放线菌等。)，以及几种细菌(岛铁杆菌，铜绿假单胞菌，小细菌属sp.,许多种类的芽孢杆菌包括…在内地衣芽孢杆菌和b、)早些时候[2，5- - - - - -8]．在细菌,芽孢杆菌spp．似乎有望在商业规模上生产角朊酶[4，5，9- - - - - -11]然而，角蛋白酶的商业潜力尚未完全实现。应用rDNA技术提高角蛋白酶产量的成功率有限地衣芽孢杆菌PWD-1在大肠杆菌中克隆表达枯草杆菌，大肠杆菌，和毕赤酵母属pastoris表达产物的溶解度和/或克隆基因的稳定性问题尚未得到解决[12]．目前，该领域的主要重点仍在于利用常规和r-DNA方法鉴定具有高角蛋白酶活性的新菌株并提高产量，以及优化物理和营养参数以最大限度地提高角蛋白酶产量。目前的研究报告了使用这些方法来表征和提高两个角朊酶生产芽孢杆菌从印度蒂鲁帕蒂及其周边地区的家禽养殖场和羽毛堆中分离的sp。

2.材料和方法

样本是从印度安得拉邦蒂鲁帕蒂及其周边地区的当地家禽养殖场采集的羽毛粪便、家禽粪便和新鲜家禽垃圾。为了富集分离孢子菌，样品在80°C下热处理20分钟。在营养琼脂平板上用羽毛诱饵技术分离角朊酶产生菌[13]．潜在的角化酶分离物再次分离为纯培养物，并在基础培养基和完全培养基中确认角化酶生产[14]采用Lin等人的方法，通过偶氮角蛋白测定法测定角蛋白酶[4]采用Riffel等人的方法制备偶氮角蛋白底物[15]．

2.1.细菌分离物的鉴定

通过形态学、培养、生化和遗传特征鉴定角化细菌分离株。在营养琼脂上检测菌落形态、色素生成和扩散率。采用革兰氏亮场染色法研究分离菌株的微观形态[16，17]用1%磷钨酸阴性染色电镜检查[18]．通过测定生长温度(4°C ~ 65°C)、pH(5.5 ~ 8.5)、盐度(1 ~ 10%)、需氧量(1 ~ 10%)等条件，确定两株菌株的最佳培养特性。采用Collee等人所述的标准测试进行了进一步的生化表征[19]．

16S进行核糖体类型，用于表征物种水平和系统发育分析的分离物。通过使用2mL聚丙烯珠耳小瓶使用珠子母蛋白（OMNI模型8）提取基因组DNA，每个0.5g和3.0mM二氧化硅珠珠，4m / s均为40秒钟[20.]使用PB36作为正向引物（AGR GTT TGA TCM TGG CTC AG（R=G/M=A/C K=T/G A））和PB38作为反向引物（GKT ACC TTG TTA CGA CTT）进行.16S rDNA扩增[21]．引物对、dNTP、Taq聚合酶等缓冲液均购自Invitrogen公司。使用PCR-DNA纯化试剂盒(Qualigens)从凝胶切片中纯化DNA样品，然后用313 OXL毛细管DNA测序仪(Applied Biosystems)对PCR产物进行测序。对获得的基因序列进行BLAST搜索，找出同源序列。使用neighbor-joining方法分析CLUSTAL W对齐序列[22，系统发育分析使用Treecon软件包1.3b for Windows。序列保存在GenBank中，登录号分别为EU360724.1 (BF11)和EU360725.1 (BF21)。

2.2.最大限度地提高角蛋白酶的产量

选择的两个本地分离物进行物理（紫外光）和化学（盐酸羟胺（HA）和甲基磺酸乙酯（EMS））组合处理，诱变剂采用艾森塔特法[23]．这些生物在不同的时间间隔内暴露于突变原的亚致死剂量。在乳琼脂糖培养基上对蛋白酶活性较高的突变体进行筛选，选择清除区明显增加的分离株量化角朊酶[4]对分离物进行物理和化学诱变，分别从BF11和BF21分离物中分离出MBF11和MBF21。这些分离物用于角蛋白酶生产的优化。

2．3.营养和物理参数的优化

为了优化营养参数，基础培养基分别添加9种不同的碳源，浓度范围为0.2%至1%，5种氮源，浓度范围为0.2%至1.5%。进行7天发酵，并在24小时测定角蛋白酶产量 人力资源部。间隔。根据确定的最佳碳氮源和浓度设计了最佳发酵培养基。使用浓度在0.25%至1.5%之间的优化培养基，研究了底物浓度对改良MBF分离株产生角蛋白酶的影响。优化了温度（在25-55°C范围内）、pH（在5.5-9.5范围内）和搅拌等物理参数，以获得改良菌株的最大角蛋白酶产量。角蛋白酶发酵的降解产物概况，如含硫化合物半胱氨酸、半胱氨酸[24和蛋氨酸[25]，释放的无机硫总量[26]，以及游离氨基酸的数量[27使用分别指定的方法估计。

3.结果和讨论

分析总共80个样品用于产生潜在的角蛋白酶产生生物体。分离出400个角蛋白粒细胞微生物，其中120个分离物表现出角质溶解的活性。其中，55个分离物显示出羽底物的显着（> 50％）劣化，而27分离物显示出中等活性（具有25-50％的降解）。38分离物在低于25％的降解中降解羽毛差。测试中等至高角溶液的分离株用于基础培养基中的角蛋白酶产生蛋白酶。选择两个分离株BF11和BF21，其出现最大角质酶并在三种液体介质中比较角蛋白酶产生。与基底培养基相比，该分离株均显示出在水稻肉汤和营养肉汤中的角蛋白酶产生较低的角蛋白酶产生（最大10.2ku / ml），其中活性达到12.8-14.7ku / ml。在三种媒体中没有生物量产生的显着变化。因此，结果表明基础培养基支持的角蛋白酶产率更好。通过确定形态，文化和生物化学特性进行两种分离株的表征。 BF11 and BF21 isolates were aerobic, motile, and sporulating rods which were unable to grow below 10°C. The organisms were moderately thermo-tolerant (with growth up to 55°C) and halotolerant (tolerating up to 7% salt concentration). The BF isolates showed good growth between pH ranges of 5.5 to 9.5, with optimum at 8.5. In biochemical characters, both organisms were catalase positive and produced H₂S. BF11不利用乳糖、甘油和半乳糖，而BF21不利用阿拉伯糖、乳糖、木糖和半乳糖1)根据生化特性，将这两个分离物归为该属芽孢杆菌．在16S rDNA键入和系统发育分析（图1），BF11被指定为枯草芽孢杆菌和BF21芽孢杆菌。

以从BF11和BF21中分别获得的菌株MBF11和MBF21为基础培养基，采用分步诱变法对发酵参数进行优化。改良菌株的最大角朊酶产量达到75-90 KU/mL(图)2(一个)和2 (b))比较了九种不同碳源对两种MBF菌株角蛋白酶发酵产物的影响，结果如图所示3（a）. 淀粉和半乳糖（228-240 KU/mL）的角质酶产量最高，其次是果糖、麦芽糖和蔗糖（187-210） KU/mL）用于BF11。甘油和淀粉（365–299 KU/mL）是MBF21测试的九种碳源中最好的，其次是葡萄糖、半乳糖、麦芽糖和蔗糖，产量介于245和280之间 与对照基础培养基相比，在基础培养基中添加碳源可显著提高两株菌株的角蛋白酶产量。当淀粉浓度在0.5%到1%之间增加时，角蛋白酶活性增加1.5到2倍。淀粉浓度进一步增加到2.5%时，角蛋白酶的产生并没有显著提高。我们的结果表明，淀粉、半乳糖和甘油按上述顺序是良好的碳源。淀粉不是生产角蛋白酶的理想碳源[1]，但据报道，它是生产碱性蛋白酶的良好来源地衣芽。和b . polymyxa［9]与对照基础培养基相比，葡萄糖也支持更高水平的角蛋白酶，尽管它低于淀粉。观察到葡萄糖抑制几种细菌的角蛋白酶产生，如地衣芽孢杆菌,芽孢杆菌FK 46，部分高温放线菌属candidus［11，12，28]葡萄糖对角蛋白降解没有影响芽孢杆菌sp．FK46[10]然而，发现葡萄糖作为碳源的存在刺激细胞角蛋白酶的产生链霉菌属sp。Stenotrophomonassp。，小细菌属Sp .，等等，以及真菌[8，29]．因此，淀粉是最便宜和最可行的碳源，适合于试验生物培养基的设计。

氮源对角蛋白酶产生的影响结果如图所示3（b）。在测试的氮源中，豆粕是MBF11（212）的最佳氮源 KU/mL），而MBF21的最大产量（207 KU/mL）通过添加花生饼获得。随着有机氮源浓度从0.2%增加到1%，酶产量增加了2倍，之后两个菌株都出现了平台。酵母抽提物是支持酶生产的其他氮源。无机氮源的形式为新罕布什尔州₄Cl对MBF分离株的角蛋白酶产生没有显著影响，其产量低于或与对照组相当。观察到添加豆粕可提高MBF分离株中碱性蛋白酶和角蛋白酶的产生芽孢杆菌sp。12]．然而，没有发现它支持良好的角化酶产量地衣芽。［4]．C/N比例的优化，最终设计出在基础培养基中添加1%浓度的相对便宜的原料、淀粉和SBM/GNC。这种培养基支持角朊酶的最佳生产，也适合在扩大生产的同时降低总成本。

角蛋白酶的产生仅在羽毛基质存在的情况下观察到，表明它主要是可诱导的。底物浓度增加至10% mg/mL可提高两种MBF菌株的角蛋白酶产量。底物浓度进一步增加至20 mg/mL对角蛋白酶产量无显著影响。角蛋白酶的产生发生在指数后期或微生物生长的稳定期，在此期间羽毛基质发生相应的降解。在搅拌条件下（380和464），酶产量相差3-4倍 KU/mL）和静态条件（120和124 KU/mL）。一般来说，角蛋白酶的生产需要高通气和浸没条件，但高温厌氧细菌报告的角蛋白酶除外，在这种情况下，静态厌氧条件有利于酶的生产[7，30.]．MBF11的最适温度为45-55℃，表明酶的耐热性，而MBF21的最适温度为37℃(图)3（c）).pH值在5.5-9.5范围内对角蛋白酶产生的影响的结果（图3（d）)表明，当pH从5.5增加到8.5时，角朊酶产量逐渐增加，且两菌株的最适值均为8.5。在生长方面，在pH为4.5和8.5以上时，微生物的生长较慢，但在pH为5.5和8.5之间，微生物的生长相当，这表明所看到的影响不是由于总生物量的差异。在早期的报告中，也观察到碱性pH值可以提高角朊酶的产量[12]．在设计的培养基和优化的条件下，MBF菌株的酶产量提高到518-524 KU/mL单位，比本地菌株提高了50倍。这一产量显著高于之前报道的几种产角朊酶细菌，但与地衣芽孢杆菌PWD1 [12，31]．

研究发现，羽毛基质的降解与培养基pH到碱度的显著增加有关，因此可以作为降解效率的指标。在降解产物浓度的增加和底物降解水平之间观察到良好的相关性。在角蛋白降解过程中，脱氨反应导致蛋白质、多肽和氨基酸产生氨，从而使培养基倾向于碱性。碱度的增加也被观察到有利于进一步快速的酶攻角蛋白，导致更高水平的角化分解[15].在显微镜下观察到羽毛在不同降解阶段的降解模式（图4）.在第五天实现羽毛轴的劣化，并且第七天，基材完全降解到白色粉末质量中。降解开始于细菌对羽毛的粘附性。发现生物体首先将羽毛区域渗透到羽毛区域，然后分解成粉末状凝胶状物质。随后是蔓延到轴区域，导致轴的破裂和崩解在第六天的轴上的针状结构，导致羽毛的完全降解（图4）.

对培养滤液的分析表明，在发酵期间，半胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和总游离氨基酸的含量显著增加（图1）5）.半胱氨酸浓度从2.5开始逐渐升高μg/mL至12.5-14μMBF11和MBF21的第五天G / ml。胱氨酸水平达到峰值5-6天，18.1 μMBF21和12.8 . g/mLμ对于MBF11，g/mL，之后观察到下降。BF分离株释放的可溶性氨基酸水平，如半胱氨酸和胱氨酸，高于早期报告，其中5 μg到16. μg/mL在不同的研究中观察到[6，8].虽然35岁 μg/mL的胱氨酸被报道在头发的降解释放microprum gypseum.Malviya等人[32]孵育期为50天。从降解中释放的无机硫，肽/氨基酸或其他巯基化合物的比例被认为是生物体的角蛋白溶解活性程度指数[33]．从菌株释放的硫化合物比例来看，菌株培养滤液中无机硫酸盐的浓度显著低于有机硫。在MBF分离菌的培养滤液中，存在诸如肽、半胱氨酸、半胱氨酸和硫酸盐等亚硫酸盐水解产物，证实了二硫化物的分解。

4.结论

在碱性pH下具有最佳活性的角蛋白酶的耐热性具有明显的优势，从而增加了多功能性和应用潜力。在96至120小时之间释放的总有机降解产物中，70%构成含硫氨基酸，表明这些生物体具有良好的潜在应用前景因此，本研究是本土角蛋白酶生产过程中的一个进步。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢印度政府生物技术部提供的财政援助和由SPMVV中央仪器设施赞助的DST-CURIE的支持。

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