羽毛可以大批量地生成的副产品全球家禽业。这是一个非常丰富的蛋白质来源 β羽毛角蛋白构成91%的蛋白质。羽毛角蛋白的存在使顽固的最常见的蛋白酶和胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶,等等,从而延缓了其降解过程在本质上( 1]。通常,每个鸟都有125通用的羽毛和每周有超过4亿只鸡正在处理在世界范围内,羽毛的日常积累浪费达五百万吨( 2]。羽毛的大部分浪费在本质上是不回收和效用有限角蛋白的化学不起化学反应的本质。一般来说,这种浪费已经转化为饲料添加剂,导致饲料的质量差是不能存活的经济 3]。因此,这个副产品的回收是既不盈利也不环保。这个垃圾的处理是一个全球性的环境问题导致的污染空气和地下水资源( 4]。

近年来,羽毛微生物处理角蛋白酶与多个应用程序吸引了广泛关注。Keratinase-treated羽毛越来越被视为一个可行的膳食补充食品和饲料中蛋白质的来源,随着enzyme-treated最终产品保留营养价值高。角蛋白酶预计将产生潜在的全球市场类似于其他蛋白酶。据报道,不同的微生物群体产生角蛋白酶如真菌( Doratomyces microsporus, 链格孢属radicina, Trichurus spiralis, 曲霉属真菌sp。 Rhizomucorsp。 Absidiasp。 葡萄穗霉属阿尔巴等。),放线菌( 链霉菌属合约,s . alv (s . thermoviolaceus s fradiae高温放线菌属等candidus演变来的。),和一些细菌物种( Fervidobacterium islandicum,铜绿假单胞菌, 小细菌属sp 。,和许多种类的 芽孢杆菌包括 地衣芽孢杆菌和 b、)早些时候 2, 5- - - - - - 8]。在细菌, 芽孢杆菌仕达屋优先计划 。似乎有前途的商业规模的角蛋白酶生产( 4, 5, 9- - - - - - 11]。然而,角蛋白酶的全部商业潜力尚未实现。rDNA技术的应用,提高角蛋白酶的产量取得了有限的成功。依然基因 地衣芽孢杆菌PWD-1负责角蛋白酶生产虽然克隆和表达 枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,和 毕赤酵母属pastoris的溶解度的问题表达了产品和/或克隆基因的稳定性有待解决的( 12]。目前主要集中在这一领域仍然掌握在识别小说隔离高角蛋白酶活性,提高使用传统和r-DNA收益率方法,除了优化物理和营养参数角蛋白酶产量最大化。本研究报告使用这些方法的特点和提高角蛋白酶生产由两个 芽孢杆菌sp.隔离来自家禽农场和羽毛转储Tirupati附近,印度。

样本收集羽毛转储,家禽粪便和新鲜家禽垃圾从当地家禽农场Tirupati及其周边地区,印度安得拉邦。丰富的孢子生殖隔离细菌,样品在80°C热处理20分钟。角蛋白酶生产生物被孤立的羽毛引诱技术在营养琼脂板( 13]。潜在keratinolytic隔离被分离为纯文化和确认角蛋白酶生产在基础培养基和完整的媒体 14]。角蛋白酶酶被azokeratin化验测定林采用的方法等。 4]。Azokeratin衬底制备采用的方法Riffel et al。 15]。

共80个样本进行分析潜在的角蛋白酶生产生物。400 keratinophilic微生物被孤立,其中120隔离keratinolytic展出活动。其中,55分离显示重要的(> 50%)的降解羽毛衬底,而27隔离表现出温和的活动(25 - 50%退化)。38隔离降解羽毛差不到25%下降。隔离显示中度到高keratinolytic活动检测在媒体基底角蛋白酶酶的生产。两个隔离BF11 BF21展示选择最大角蛋白酶和角蛋白酶生产比较三种液体媒体。仅有两个隔离显示低角蛋白酶生产肉汤和营养肉汤测试(最高为10.2 KU /毫升)与基底媒体活动达到12.8 -14.7 KU /毫升。没有显著变化在生物质生产三个媒体。因此,结果表明,基础培养基支持更好的角蛋白酶产量。描述的两个隔离是由确定形态,文化和生化特征。 BF11 and BF21 isolates were aerobic, motile, and sporulating rods which were unable to grow below 10°C. The organisms were moderately thermo-tolerant (with growth up to 55°C) and halotolerant (tolerating up to 7% salt concentration). The BF isolates showed good growth between pH ranges of 5.5 to 9.5, with optimum at 8.5. In biochemical characters, both organisms were catalase positive and produced H₂美国BF11没有利用乳糖,甘油,阿拉伯糖和半乳糖,乳糖、木糖、半乳糖不利用BF21(表 1)。基于生化特征,属下的两个隔离分组 芽孢杆菌。在(图16 s rDNA打字和系统发育分析 1),BF11被指定为 枯草芽孢杆菌和BF21 蜡样芽胞杆菌。

发酵的优化参数进行了使用基底媒体MBF11 MBF21株来自BF11 BF21,分别由逐步突变。提高菌株的最大角蛋白酶产量达到75 - 90 KU /毫升(数据 2(一个)和 2 (b))。九个不同碳源对发酵的影响这两个角蛋白酶的生产MBF隔离相比,结果如图所示 3(一个)。淀粉和半乳糖(228 - 240年KU /毫升)支持角蛋白酶的产量最高,其次为果糖,麦芽糖、蔗糖(187 - 210年KU /毫升)BF11。甘油和淀粉(365 - 299年KU /毫升)中是最好的9个碳源检测MBF21其次是葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖,收益率介于245和280 KU /毫升。补充碳源的基底媒体导致显著增强角蛋白酶的生产与控制基底媒体隔离。有1.5 - 2倍增加,角蛋白酶活动增加淀粉浓度在1%和0.5之间。进一步增加淀粉浓度高达2.5%没有产生任何显著增强角蛋白酶生产。我们的结果确定了淀粉、半乳糖和甘油碳源所提到的顺序。淀粉不观察角蛋白酶生产理想的碳源( 1]虽然据报道是碱性蛋白酶生产的良好来源 地衣芽。和 b . polymyxa( 9]。葡萄糖也支持更高级别的角蛋白酶相比控制基底媒体虽然低于淀粉。观察葡萄糖抑制角蛋白酶生产在一些细菌等 地衣芽孢杆菌,芽孢杆菌sp。46颗和部分 高温放线菌属candidus( 11, 12, 28]。葡萄糖没有与角蛋白降解的影响 芽孢杆菌sp 。FK46 [ 10]。然而,葡萄糖为碳源的存在被发现刺激角蛋白酶生产 链霉菌属sp。 Stenotrophomonassp。 小细菌属sp。等等,以及在真菌 8, 29日]。因此,淀粉是最便宜和最可行的碳源出现了适用于设计的媒体测试生物体。

氮源对角蛋白酶产量的影响结果如图所示 3 (b)。在氮源测试,大豆被发现的最佳氮源MBF11 (212 KU /毫升),而最高产量为MBF21 (207 KU /毫升)获得了花生蛋糕补充。酶的生产增加了2倍,有机氮源的浓度的增加从0.2到1%,之后观察高原的隔离。酵母提取物是其他氮源支持酶生产。无机氮源以NH的形式₄Cl没有显著影响生产的角蛋白酶兆隔离、收益率低于或与控制。补充的豆粕是观察到增强碱性蛋白酶的生产以及角蛋白酶 芽孢杆菌sp。 12]。然而,它并没有发现支持好角蛋白酶产量 地衣芽。( 4]。优化的C / N比导致设计发酵媒体在基础培养基补充1%浓度的相对廉价的原料,淀粉和座/ GNC。这种媒介支持最佳角蛋白酶的生产,也适用于降低总体成本,扩大生产。

观察角蛋白酶生产只有在羽毛基质的存在,表明它主要是诱导。增加底物浓度10毫克/毫升发现增强角蛋白酶生产与兆隔离。进一步增加底物浓度高达20毫克/毫升角蛋白酶产量没有表现出任何显著的影响。角蛋白酶的生产发生在对数生长期后期或固定相的微生物生长与相应的降解羽毛衬底的时期。观察3-4-fold不同酶产量之间的搅拌条件(380年和464年KU /毫升)和静态条件(120年和124年KU /毫升)。一般而言,角蛋白酶的生产需要高曝气和淹没条件除了角蛋白酶报道从嗜热厌氧细菌酶生产的静态厌氧条件( 7, 30.]。MBF11的最适温度为45 - 55°C表示酶的耐热的特性而对MBF21 37°C(图 3 (c))。pH值的结果影响生产的角蛋白酶的范围5.5 - -9.5(图 3 (d))表明,pH值从5.5到8.5的增加导致了角蛋白酶产量逐渐增加两个菌株的最佳是8.5。在增长方面,生物显示更少的增长pH值4.5和8.5以上但pH值5.5和8.5之间的增长相当表明影响不是由于总生物量的差异。碱性pH值已经观察到增强角蛋白酶酶的生产也在早些时候报道( 12]。酶的产生与使用媒体和设计优化的条件下增加到518 - 524 KU /毫升单位MBF生物,因此导致50倍增强相比,本机隔离。这个收益率显著高于几角蛋白酶的生产菌种早些时候报道,但可比 地衣芽孢杆菌PWD1 [ 12, 31日]。

降解羽毛的底物被发现与碱性介质的pH值显著增加,因此作为一个指标的效率下降。良好的相关性之间观察到浓度的增加使下降的产品和降解的底物的水平。媒介的趋势将碱性归因于脱氨基作用反应导致生产氨的蛋白质,多肽,在角蛋白降解和氨基酸。进一步提高有利于碱度也被观察到的快速酶攻击角蛋白导致更高水平的keratinolysis [ 15]。羽毛降解的模式在不同退化阶段的显微镜下观察(图 4)。退化的羽轴通过第五天,底物完全退化成白色粉末质量的第七天。退化了细菌的粘附羽毛。生物被发现穿透套管的羽毛先分解成粉状的分离barb凝胶状的质量。其次是扩散到轴区域导致其破裂和解体的轴针像第六天导致结构的完全降解羽毛(图 4)。

培养滤液的分析显示,半胱氨酸的含量显著增加,胱氨酸、蛋氨酸、总游离氨基酸发酵期间(图 5)。有逐渐增加的浓度从2.5半胱氨酸 μ克/毫升于-14年第一天,至12.5 μ第五天的g / mL MBF11和MBF21。胱氨酸的水平达到峰值18.1,5 - 6天 μMBF21隔离和12.8 g / mL μg / mL MBF11,之后观察下降。可溶性氨基酸半胱氨酸和胱氨酸的水平发布的男朋友隔离高于先前的报告在5 μg到16 μg / mL观察在不同的研究 6, 8]。尽管35 μ据报道,g / mL胱氨酸在退化的头发被释放 Microsporum gypseum由Malviya et al。 32),孵化期是50天。无机硫的比例,肽/氨基酸或其他含巯基的化合物从退化被认为是解放keratinolytic有机体的活性度指数( 33]。兆隔离公布的硫化合物的比例显示,无机硫酸盐浓度明显低于有机硫的培养滤液中隔离。sulphitolysis的存在的产品如多肽、半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸盐的培养滤液MBF隔离证实了二硫化物崩溃。

角蛋白酶的耐热的特性与最佳活动在碱性pH值从而增加了通用性方面有明显的优势和应用潜力。总数的70%有机降解产物释放96至120小时构成含硫氨基酸,这表明一个好的潜在应用这些生物以及便宜意味着生产商业上重要的副产品。因此,本研究在生产过程中是一个一步土著角蛋白酶的酶。