非偶然的孤立弧菌菌株携带霍乱毒素基因从环境在印度尼西亚水域

文摘

我们最初试图隔离霍乱弧菌埃尔托型O1群霍乱毒素的,携带一本小说变体基因(ctxAB从印度尼西亚环境水域),第七次霍乱大流行霍乱弧菌埃尔托型O1群开始了。嵌套PCR目标基因显示,总共8菌株被发现携带ctxAB。然而,16 s rRNA基因的测序这些隔离表明他们不是霍乱弧菌但是都是克雷伯氏菌,肠杆菌属,Pantoea,或气单胞菌属。随后的嵌套PCR检测针对所有已知的基因编码在CTX噬菌体(例如,zot,王牌,orfU,cep,rstB,办公室,rstR)表明,一个隔离属于肠杆菌属属进行所有的基因测试,另一个隔离缺乏2、3或5的基因。这方面的证据表明,这些噬菌体ctxAB基因多样性和不仅可以感染吗霍乱弧菌和诉mimicus还有其他物种和属pseudolysogen的形式。

1。介绍

霍乱弧菌是一种胃肠道病原体引起霍乱、一个臭名昭著的肠道疾病,严重的全球发病率和死亡率。临床菌株属于负责所有主要血清型O1和O139霍乱流行和大流行。导致疾病的主要毒力因子,霍乱毒素(CTX),编码ctxA和ctxB(ctxA和ctxB;统称为ctxAB)[1]。的ctxAB丝状噬菌体基因存在,叫做CTX噬菌体,它已被证明lysogenize霍乱弧菌,诉mimicus和其他弧菌物种(2]。到目前为止,世界经历了七个主要的大流行霍乱自19世纪早期。第五和第六大流行是由于产毒素的菌株属于古典生物型的血清组O1群具有古典类型的ctxB,而正在进行的第七大流行,始于1961年在印度尼西亚苏拉威西岛(1埃尔托型),是由的El Tor类型ctxB的氨基酸序列不同于经典的类型(3]。

在过去的二十年里,一些霍乱弧菌于不同的菌株ctxB与氨基酸序列不同的彼此已经出现。截至2009年,共有9个基因的变异ctxB包括古典类型已报告(4]。因此,我们试图隔离霍乱弧菌埃尔托型O1群,把小说ctxB印度尼西亚的变种基因从环境水域。在这个尝试的过程中,我们分离菌株进行ctxB但没有分类学上属于属弧菌。本文报道这些隔离的表型和基因型的特征。

2。材料和方法

2.1。隔离霍乱弧菌O1 El Tor菌株

水从各种来源收集的样本,如河流、河口和海洋在印度尼西亚(即。从泗水,沿海地区到巴厘岛)。大约20毫升的每个样本与相同体积的混合双强碱性蛋白胨水(英国贝辛斯托克APW Oxoid Ltd .)和孵化48小时在室温下(ca。24°C)。浓缩后,10μL整除多粘菌素B的文化是有甘露糖亚碲酸盐(PMT)琼脂板(Nissui制药有限公司,东京,日本)优惠的隔离霍乱弧菌O1 El Tor,其次是在室温下孵化(ca。24°C) 48 h。孵化后,well-isolated黄色殖民地类似的参考霍乱弧菌O1 El Tor菌株5 h332 18 h24(大阪地方公共卫生研究所的礼物,日本)在PMT盘子被选为“El Tor变体”候选人隔离。

2.2。筛查ctxA和ctxB隔离

候选人隔离然后拥有筛查ctxA和ctxB通过常规PCR检测。引物序列表中列出的设置1。戴维斯和沃德(5)表明,CTX噬菌体可以呈现为单链DNA, DNA双链DNA plasmid-like额外染色体,或线性DNA双链染色体在溶原性状态的一部分。在此基础上,基因和质粒DNA的分离提取使用商用全基因组DNA提取工具包(illustra genomicPrep迷你旋转设备,通用电气医疗集团)和质粒DNA提取工具包(illustra plasmidPrep迷你旋转设备,通用电气医疗集团,小都,英国),分别。增加基因检测的灵敏度,我们执行嵌套PCR检测使用稀释1 st-pcr产品模板DNA。嵌套PCR使用高纯产品获得纯化PCR产物纯化工具包(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)和测序使用BigDye终结者v3.1循环测序工具包(应用生物系统公司、沃灵顿、英国),根据制造商的指示。测序产品阅读ABI棱镜3100基因分析仪(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)。

2.3。遗传和生化鉴定

隔离的完好无损ctxA和ctxB然后进行分类识别,基于基因测序的16 s rRNA使用商业套装(细菌16 s rDNA PCR装备,豆类生物公司,京都,日本)及其生化特性使用商业识别工具包(API 20 e, Biomerieux Inc . Marcy-l 'Etoile,法国)。

2.4。检测其他CTX噬菌体编码的基因和基因编码噬菌体受体

除了ctxAB,CTX噬菌体的基因组还包括噬菌体形态发生所需的基因,复制,噬菌体基因表达调控,噬菌体集成(例如,zot,王牌,orfU,cep,rstB,办公室,rstR)[6]。因此,我们组进行PCR和嵌套PCR检测针对这些基因的质粒dna八隔离。

戴维斯和沃德(5]表明,CTX噬菌体感染细菌细胞可以通过toxin-coregulated纤毛(TCP)和TolQRA复杂,充当噬菌体受体和主持人的噬菌体宿主细胞的细胞周质间隙的导线,分别。因此,我们使用分离株的基因组DNA进行PCR检测目标与TCP相关的基因(例如,tcpA)和复杂的(例如,tolQ,tolR,托拉,统称为tolQRA)霍乱弧菌N16961 [7]。

2.5。S1核酸酶治疗

描述,CTX噬菌体可以呈现为单链DNA, DNA双链DNA plasmid-like额外染色体,或线性DNA双链染色体的一部分在溶原性状态5]。在此基础上,我们把质粒DNA的赔率GCDV的基因组DNA霍乱弧菌N16961(控制)有或没有S1核酸酶(豆类Bio)专门降低单链核酸。然后我们进行了PCR的目标ctxA。

2.6。CT生产

CT检查生产,我们执行一个反向,被动乳胶凝集(RPLA)测试(VET-RPLA;Denka Seiken有限公司在东京,日本)ctxAB艾滋病患者隔离根据制造商推荐的方法。

3所示。结果与讨论

通过我们的隔离,共有54候选人隔离显示霍乱弧菌O1 El Tor像殖民地外观。候选人隔离然后拥有筛查ctxA和ctxB通过常规PCR检测。PCR分离株的基因组DNA凝胶上隐约可见的扩增子,而质粒DNA制备的八个隔离显示清晰可见扩增子的预期大小(图1)。嵌套PCR基因和质粒DNA准备显示清晰可见扩增子的预期大小(图1)。然后我们嵌套PCR产物测序以确定核苷酸和推导的氨基酸序列,发现他们与埃尔托型的序列CT (8)(100%相似,数据未显示)。

然后我们进行了pcr进行识别的方法霍乱弧菌(9]或诉mimicus(10]。然而,所有八隔离- pcr(数据未显示)。因此我们确定的分类标识隔离的测序16 s rRNA基因和生化特征(API 20 e)。测序结果表明,一个隔离,GCDV 50-6,相似性水平> 99%诉parahaemolyticus(表2)。其他隔离被分配给属克雷伯氏菌,肠杆菌属,Pantoea,或气单胞菌属(表2)。分类单元确定的API 20 e表明没有一个隔离属于霍乱弧菌,六个克雷伯氏菌,肠杆菌属,气单胞菌属,或诉fluvialis物种高度(> 97%)的确定性(表2)。这些发现表明,CTX噬菌体不仅可以感染霍乱弧菌和诉mimicus而且其他物种,属pseudolysogen的形式。在pseudolysogeny,噬菌体DNA复制与细胞周期不同步,而不是发生在溶原性的同步。这将导致不稳定共存的噬菌体细胞,导致高比例的治愈细胞在几代(11]。这种情况被描述的鳗,相对于宿主DNA噬菌体DNA的比例迅速下降后串行亚文化在Mueller-Hinton肉汤12]。我们因此亚文化隔离在APW 37°C在大约三天的时间间隔四个连续的文化。PCR和嵌套PCR检测目标ctxA进行利用质粒DNA准备从最初的和最后的亚文化。我们发现连续接种导致的消失有针对性的PCR扩增子(数据未显示)。

如果CTX phage-like遗传元素pseudolysogeny的形式存在,它们可能是单链DNA或双链DNA plasmid-like额外染色体(5]。PCR的质粒DNA的赔率GCDV S1核酸酶处理未能产生任何扩增子(图2)。这表明,噬菌体在宿主染色体不是lysogenized但存在单链DNA在很少的宿主细胞。然而,轻微的DNA扩增子的乐队出现在基因组DNA提取的凝胶样品(图1(A1))。建议有质粒DNA的污染过程中基因组DNA提取基因组DNA提取。

如果CTX噬菌体感染这八隔离,还携带CTX噬菌体编码的基因以外ctxAB(例如,zot,王牌,orfU,cep,rstB,办公室,rstR)和基因编码CTX噬菌体受体(即,tolQ,tolR,托拉和tcpA)。嵌套PCR的结果针对CTX噬菌体编码的基因显示只有一个隔离,GCDV 28-2,是积极的基因测试,而另一个隔离缺乏2、3或5的基因(表2)。这表明CTX噬菌体的遗传成分并不完全同基因的已知CTX噬菌体的但有明显的基因的变化内容。PCR结果针对噬菌体受体基因编码显示,所有隔离都为阴性tcpA,tolQ,tolR,托拉。研究结果表明,隔离了通过TCP-independent CTX-like噬菌体,或可能TolQRA-independent机制,类似于证明在体外博伊德和沃德(13]。然而,我们无法验证的缺失tcpA和tolQRA仅仅用PCR基因。截至2011年,Kumar et al。14)报道,有几个的变体tcpA基因可以分为10个遗传学上截然不同的集群霍乱弧菌和诉mimicus。因此,它还有待确定这些隔离tcpA和tolQRA由PCR但南方印迹分析。

CT检查生产的结果表明,所有的八个隔离是负的,说明没有人生产的CT。毒性基因的表达调控的转录监管机构ToxR,绑定到一个重复heptanucleotide主题(TTTTGAT),本地化之间zot和ctxA基因的转录激活ctxAB基因(15,16]。流行血清型菌株O1和O139 heptanucleotide拥有三个或更多的副本,但那些没有产生CT只拥有两份(17]。在此基础上,这些8ctxAB艾滋病患者隔离可能没有见过这种需求产生可检测CT。

人们长期以来一直认为,几乎只CTX噬菌体感染霍乱弧菌和诉mimicus(18]。然而,Sechi et al。19)报道,霍乱弧菌毒力基因广泛分布在不同弧菌物种。最近,Snoussi et al。20.]报道CTX phage-encoded基因包括分散分布ctxA在许多的诉防治等孤立的从海水和软体动物。因此本研究第一个报告菌株携带ctxAB存在不仅属弧菌而且在其他属水生环境。研究还表明,嵌套PCR是一种有用的方法,推进研究pseudolysogeny在环境样品。非的机制弧菌菌株获得ctxAB还有待确定。

确认

这项工作支持,部分由财政补贴项目的资金对新兴和重现传染病研究中心,教育部,文化,体育,科学和技术(下边了),日本,并从卫生和劳动科学研究基金资助研究全球卫生问题和日本健康科学的基础。德弗里斯博士在研究过程中,加里岩心,这篇论文的合著者,去世了,和作者致以诚挚的慰问他的家人,朋友,同事。作者真诚地欣赏他献身于我们整个研究活动,希望他的灵魂在于和平。没有商业或其他协会关于提交可能构成利益冲突。

引用

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