文摘
thermoalkalophilic新物种芽孢杆菌,类似于芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340,产生胞外木聚糖酶在固态发酵麦麸作为碳源。胞外木聚糖酶被隔离的硫酸铵(80%)降水并使用离子交换层析纯化。木聚糖酶的分子量是~ 29.8 kDa。酶活性的最佳温度和pH值是50°C和pH值8.0。酶是活跃在birchwood木聚糖和小活动p-nitrophenyl xylopyranoside但Avicel、CMC、纤维二糖和淀粉,其绝对的底物特异性。对于birchwood木聚糖酶对公里5.26毫克/毫升,Vmax 277.7μ分别摩尔/分钟/毫克。此外,木聚糖酶也能产生高质量的xylo-oligosaccharides,这表明其应用潜力不仅在纸浆技术流程,而且在营养食品行业。
1。介绍
木聚糖是最丰富的noncellulosic多糖存在于硬木和一年生植物,占20 - 35%的总在热带植物生物量(干重1- - - - - -3]。在温带软木,木聚糖不太丰富,可能占总干重的8%左右(4]。木聚糖是发现主要在二级细胞壁和被认为是形成木质素和其他多糖之间的间期。很可能木聚糖分子共价与木质素酚残留也与多糖相互作用,果胶和葡聚糖等。在最简单的形式,木聚糖是线性均聚物包含D-xylose单体通过有关β1、4-glycosyl债券(5,6]。木聚糖酶(E。C 3.2.1.8)降解β1、4木聚糖裂开β1,4糖苷随机联系,和产品木糖xylo-oligosaccharides像xylobiose7,8]。木聚糖酶工业的重要性,可以用于造纸漂白纸浆,提高纸浆的亮度,提高饲料的消化率和果汁的澄清。木聚糖酶的应用避免使用昂贵的化学物质,造成污染9]。微生物木聚糖酶的丰富来源,由不同的属和种细菌、放线菌和真菌。几个种类的芽孢杆菌和丝状真菌分泌大量的细胞外的木聚糖酶(10]。木聚糖酶分泌通常较低的同事或多种纤维素酶量高。利用木聚糖酶对纸浆治疗,最好使用cellulose-free木聚糖酶,纤维素酶以来可能影响纸浆的质量(11- - - - - -15]。最实用的方法是天然微生物菌株的筛选能够分泌cellulose-free下木聚糖酶发酵条件进行了优化。使用木聚糖酶在漂白过程应该是稳定在高温碱性pH值(16,17]。
在大规模工业生产的酶主要与底物相关联。农业残留物的使用低成本的基板生产的工业酶是一个重要的方法来降低生产成本。使用固体基质发酵技术有很大的优势在深层发酵由于缺乏或附近没有水相,为微生物生长提供了自然栖息地,经济的空间,简单的媒体,没有复杂的机械、设备和控制系统,更大的发酵容器的密实度由于较低的水量,提高产品产量,降低能源需求,降低工业资本和经常性支出,更容易扩大的过程,体积较小的产品所需的溶剂复苏,优越的收益率,没有泡沫堆积,污染和容易控制系统中由于低湿度(10,18]。在考虑这些事实本研究旨在描述细胞外alkalothermophilic木聚糖酶产生的芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340年生长在固态发酵。据我们所知,这是第一个报告描述的生产thermoalkalophilic cellulase-free木聚糖酶芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340。此外,该木聚糖酶被发现能够降解木聚糖xylo-oligosaccharides。
2。材料和方法
2.1。木聚糖菌株的筛选
收集土壤样本从Mandovi沿海地区,印度果阿。浓缩了使用birchwood木聚糖(σ化学品、德国)作为唯一的碳源。25细菌培养筛选木聚糖能力通过添加dye-labelled衬底,例如,xylan-brilliant红3 ba在木聚糖琼脂培养基(19]。
2.2。表型特征
突出选择孤立被确定形态的基础上,文化、生化特性(20.)和16 s rRNA测序。文化是沉积在国立细胞科学中心(国立),印度浦那。
2.3。系统发生的分析
部分16 s rRNA序列检索在NCBI服务器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)使用防爆工具。十大相似序列FASTA格式的下载。多个序列对齐和水平的序列相似度的计算是通过使用ClustalW2程序来执行。系统发育树分析获得的微生物密切相关。进化历史推断使用neighbor-joining方法(14]。
2.4。生长条件的文化
细菌分离是保持在液体培养基和固体培养基基盐溶液(BSS)包含0.5%木聚糖pH值8.0 45°C和储存在4°C。
2.5。木聚糖酶生产固态发酵(SSF)
所选菌株进一步测试他们的能力产生胞外木聚糖酶在固态发酵。麦麸作为底物。这个压力是厄伦美厄烧瓶培养(250毫升)含10 g的麦麸滋润18毫升基底的盐溶液(BSS: substrate-to-moisture比1:1。8)。48 h后发酵时间;固体基质被悬浮在50 mM磷酸盐缓冲剂(pH值8.0),漩涡彻底提取木聚糖酶。样品在5000×g离心10分钟4°C。离心去除木聚糖酶的底物。上层清液是通过绘画纸1号滤纸过滤,滤液作为粗木聚糖酶制剂。离心之前,确定可行的细胞的数量的样本撤回标准可行的平皿计数技术。
2.6。木聚糖酶测定
木聚糖酶活性测定根据贝利et al。21]。一个900μL 1%的水溶性birchwood木聚糖溶液与100年了μL在试管中酶解。1.5毫升DNS试剂添加和孵化50°C水浴(5分钟的22]。吸光度测量540海里。的反应是在零时间终止控制管。准备使用0 - 500标准的图μg木糖。一组autozero是在紫外可见分光光度计使用缓冲溶液(日立、日本)。被定义为一个单位的木聚糖酶活动释放的酶量每分钟1微摩尔的还原糖相当于木糖试验条件下描述。水溶性木聚糖是由搅拌birchwood木聚糖和1 M氢氧化钠为六个小时在室温下离心和冷冻干燥后上层清液中和碱与盐酸1米。
2.7。纤维素酶测定
据Ghose用纤维素酶活性测定和必要的修改(23]。一个900μL羧甲基纤维素1%解决方案增加了100人μL酶在试管中。1.5毫升DNS试剂添加和孵化50°C水浴的5分钟。吸光度测量540海里。反应是在零时间终止控制管。准备使用0 - 500标准的图μ克葡萄糖。一个autozero分光光度计使用缓冲溶液。被定义为一个单位的纤维素酶活动释放的酶量每分钟1微摩尔葡萄糖当量试验条件下。
2.8。1,4 -β木糖苷酶测定
1,4 -β据Lachke木糖苷酶活性测定(24]。一个900μlp-nitrophenylβ木糖甙(ρ-NPX)解决方案增加了100μL在试管中适当稀释酶解决方案。混合是在50°C的环境中30分钟。然后1毫升的2 M添加碳酸钠溶液。吸光度测量410海里。反应是在零时间终止控制管。一个单位的1、4- - - - - -β木糖苷酶活动被定义为催化的酶量1微克分子的形成ρ硝基酚在试验条件下每分钟。
2.9。总蛋白质含量的测定
根据洛瑞总可溶性蛋白测定et al。25]。蛋白质浓度测定使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。色谱洗提液的蛋白质含量是衡量监测光密度在280海里。
2.10。硫酸铵沉淀
蛋白质沉淀使用硫酸铵盐析法(NH4(所以4)2)进行了持续温和搅拌(26]。这是左一夜之间和沉淀离心收集的10000 g×10分钟。获得的沉淀溶解在磷酸盐缓冲剂(50毫米,pH值8.0)和透析同一个缓冲区24 h。使用纤维素油管进行了透析(分子量截止13000 kDa, Himedia LA393-10 MT)。
2.11。离子交换色谱法
透析酶(2毫升)加载到阴离子交换DEAE纤维素(Sigma-Aldrich有限公司美国)列。列挤满了激活deae纤维素平衡与50 mM磷酸盐缓冲剂(pH值8.0)。列的高度是2.5厘米直径20厘米。0.0到0.5米的蛋白质筛选了氯化钠梯度。收集50分数在5毫升的每个分数1毫升/分钟的流量。所有的步骤都在4到8°C。
2.12。通过sds - page分子质量测定
sds - page部分纯化的木聚糖酶进行12.5%的丙烯酰胺凝胶Laemmli [27]。考马斯亮蓝r - 250用于染色的凝胶。分子量的蛋白质标记使用含有14.4 kDa的中程94.0 kDa来自班加罗尔GeNei,印度。
2.13。底物特异性
木聚糖酶的底物特异性被发现通过使用木聚糖1%,纤维二糖,淀粉、羧甲基纤维素(CMC)和p-nitrophenyl xylopyranoside和Avicel作为底物。
2.14。动力学参数
初始反应速率使用birchwood和燕麦拼木聚糖为底物测定底物浓度的0.5 -10毫克/毫升50 mM磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)在45°C。公里,Vmax动力学常数,使用线性回归方法估计莱恩威弗和伯克(28]。
2.15。水解产品的识别
50毫升birchwood木聚糖悬挂(1%的birchwood木聚糖在50 mM磷酸盐缓冲剂pH值7.0),40岁μ克木聚糖酶酶添加和孵化45°C。水解产品检测到薄层色谱法(TLC) [29日]。薄层色谱(TLC板、0.25毫米层硅胶F 254年,默克公司印度)进行使用的混合n丁醇:乙醇:H2O(5: 3: 2卷)作为溶剂系统。化合物被喷洒50%的硫酸乙醇紧随其后在150°C加热5分钟。D-xylose (X1),xylobiose (X2),xylotriose (X3)和xylotetraose (X4)应用作为标准。
2.16。温度对活动的效果和稳定性
最大的木聚糖酶活动的最适温度是由不同的反应温度30到80°C。评价热稳定性,0.5毫升的酶解决方案是在30 - 80°C的环境温度4 h。相对酶活性被记录在1 h间隔期间4 h。
2.17。pH值对活性和稳定性的影响
pH值对酶活性的影响是由孵化木聚糖酶在不同pH值从6.0到11.0不等。各种缓冲区使用50 mM磷酸钠(pH值6、7),50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液(pH值8、9),50 mM碳酸盐碳酸氢盐缓冲(pH值10),和50 mM glycine-NaOH缓冲区(pH值11)。评估酶的稳定性在每个pH值,纯化酶是孵化到各自的缓冲区的pH值范围6.0 - -11.0 4 h在最佳温度。相对酶活性测定1 h间隔4 h孵化期间。
3所示。结果与讨论
3.1。细菌的分离和鉴定
大约25菌株,形成清晰的光环在殖民地木聚糖平皿上,拿起了进一步的研究,从土壤分离收集在指定网站学习。压力显示33毫米间隙区在殖民地证明木聚糖能力(图1)。它被确认的基础上各种形态和生化特征如表所示1。
隔离是确认的芽孢杆菌arseniciselenatis与部分16 s rRNA应变dsm - 15340 bp核苷酸序列长度为1499。基因序列存入银行(加入。AJ865469)。这个孤立的系统发育关系如图2。它是密切相关的芽孢杆菌sp。AMnr。也是从土壤分离样品收集在Mandovi沿海地区,果阿。Shivaji等人孤立芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340和芽孢杆菌arsenicus从钻井chakdah地区位于西孟加拉邦,印度(30.]。
3.2。木聚糖酶生产的社保基金
菌株生长时对麦麸3天的孵化pH值8.0和45°C,最大的木聚糖酶生产观察,也就是说,910.49 U /克干物质,这是完全免费的纤维素酶。一些工人报道麦麸是否适合生产木聚糖酶在社保基金(31日,32]。商业麦麸由纤维素30%、27%半纤维素,木质素21%,8%灰(33]。因此有纤维素酶污染的可能性增加,种植在麦麸。Haltrich等人也报告说,木聚糖酶总是与纤维素酶(34]。从二十所选菌株,五个能够产生纤维素酶和木聚糖酶在社保基金。这是由于纤维素的存在在衬底麦麸用于社保基金。
3.3。木聚糖酶的纯化
文化沉淀了滤液部分(35 - 80%)硫酸铵饱和度。蛋白质沉淀在这个范围最大的木聚糖酶的活动,用于净化。木聚糖酶是由DEAE纤维素离子交换柱进一步纯化。从DEAE纤维素酶是筛选了列的氯化钠浓度0.25(图3)。分数(没有。集中19-25)拥有最大的特定活动。木聚糖酶纯化与特定活动的3.06倍299.25 U /毫克(表2)。
木聚糖酶的特定活动所产生的杆菌、以前曾有报道称298 U /毫克Panbangred et al。35]。
3.4。分子量测定
sds - page显示单一蛋白纯化酶带。变性木聚糖酶的分子质量,估计从蛋白质sds - page的相对流动,是~ 29.8 kDa如图4。目前的结果是由以前的工作。真菌的酶Plectosphaerella cucumerina的分子量19 kDa报道Zhang et al。36]。木聚糖酶产生的芽孢杆菌sp。应变BP-23 32 kDa [37)而得到的第二个木聚糖酶芽孢杆菌firmus45 kDa的分子量38]。
3.5。底物特异性
纯化木聚糖酶对不同底物的作用进行了研究。birchwood木聚糖酶活跃,活跃p-nitrophenyl xylopyranoside但Avicel、CMC、纤维二糖和淀粉(表3)。Avicel纯化木聚糖酶不活跃,CMC、纤维二糖,淀粉,即使使用的酶浓度大于5倍正常试验和潜伏期20分钟,而不是5分钟。同样,木聚糖酶与绝对的底物特异性纯化木霉由Ujiie et al。39]。神田等人的两种不同的木聚糖酶,名叫xyl我三世对聚糖都没有活动,除了木聚糖,如淀粉、pachyman,和Avicel(微晶纤维素),除了xyl三世的近二十分之一的活动对羧甲基纤维素(CMC) [40]。
3.6。动力学参数
公里,动能参数酶测定的Lineweaver-Burk双重相反的木聚糖酶活性在45°C使用各种浓度的birchwood木聚糖为底物(图5)。公里,木聚糖酶的值是5.26毫克/毫升,277.7μ分别摩尔/分钟/毫克。王等人报道,公里,木聚糖酶隔绝的价值观芽孢杆菌sp。NTU-06 3.45毫克/毫升,387.3μ摩尔/分钟/毫克,分别41]。Bansod等人也报告说,公里的木聚糖酶值躺在范围从0.5至19.6毫克/毫升(42]。木聚糖酶与气单胞菌属cavie171我1芽孢杆菌sp。应变41 m - 1显示相似的价值观260年到350年μ摩尔/分钟/毫克蛋白(43,44]。
3.7。水解产物的分析
1 h孵化后birchwood木聚糖和木聚糖酶芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340年xylotriose和xylotetraose水解混合物中的主要产品连同小xylobiose数量。(图6)。目前的结果表明,木聚糖酶裂解底物主要xylooligosaccharides解放,但不能行动产生的低聚糖形成木糖,表明它是endoxylanase。
的木聚糖酶水解木聚糖的产品分析Thermoascus aurantiacus表明,木聚糖降解各种xylo-oligosaccharides没有显著积累木糖(45]。Xylobiose和xylotriose是主要的水解木聚糖酶的产品芽孢杆菌stearothermophilus反应与燕麦拼木聚糖和导致低聚糖被裂解形成的木糖β木糖苷酶作用[46]。最终产品xylobiose, xylotriose xylotetraose,和更高的低聚糖在木聚糖水解endoxylanase alkalophilic芽孢杆菌sp。不。c - 125。没有发现木糖水解产品分析,高效液相色谱法(47]。
3.8。温度对活动的效果和稳定性
木聚糖酶的芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340年活动逐渐被发现随着温度的增加而增加,发现显著下降在80°C(图7)。50°C被发现是最有利于酶活性。酶的稳定性是最重要的因素研究的特点。木聚糖酶的纯化芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340,它是更稳定的温度30°C和40°C 4 h的孵化和保留近93%的活动。在更高的温度下值木聚糖酶稳定性逐渐下降(图8)。伯尼尔等人报道了多种形式的木聚糖酶纯化气单胞菌属sp。由Ohkoshi等人,三个木聚糖酶的属性特征(2,48]。发现这些木聚糖酶是最活跃在50°C到60°C。康等人纯化两种木聚糖酶在50°C给最高的活动。他们表现出相对较高的稳定性在50°C温度(49]。
3.9。pH值对活性和稳定性的影响
pH值”来形容这种酶是最重要的因素。木聚糖酶的芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340显示,100%活动(图8.0 pH值9)。在更高的pH值,活动为95%。在所有测试pH值对稳定性、木聚糖酶活动100%活动1 h。pH值10.0是最有利于稳定和留存60%活动4 h(孵化(图10)。
同样,本田等人的两个木聚糖酶即N木聚糖酶和木聚糖酶芽孢杆菌sp。不。c - 125 (47]。在这些木聚糖酶N显示最大活动pH值从6.0到7.0,而木聚糖酶活性在pH值从6.0到10.0,在pH值12.0还显示一些活动。在目前的研究中,保留了100%的活动芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340木聚糖酶2小时孵化的pH值10.0。在极端稳定pH值可能是由于带电氨基酸残基。酶稳定在碱性条件下的特点是数量减少的数量的增加酸性残留物和精氨酸(50]。
4所示。结论
芽孢杆菌arseniciselenatisDSM 15340生产thermoalkalophilic cellulose-free木聚糖酶在更高的数量增长在固态条件下使用agroresidual廉价衬底麦麸。因此它可以用于大规模生产木聚糖酶的使用这种agroresidual基质。纯化木聚糖酶也有能力生产高质量的xylo-oligosaccharides,表明其应用潜力不仅在纸浆技术流程,而且在营养食品行业。
承认
作者感谢诉诉Kajinnii博士,本金,Tatyasaheb科莱工程技术研究所Warananagar,印度为金融支持。