文摘
暴露的风险单核细胞增多性李斯特氏菌(l . monocytogenes)在吃即食海产品(RTE)评估在威尼托地区(意大利)。38个样本进行分析,每个示例包括三个子单元属于同一批次。第一的三个单位立即检查,第二次是储存在+ 4°C(对于所有的保质期)和第三+ 10°C(后者的三分之一保质期在分析之前)。同时Chemical-physical和微生物参数进行了测试。结果显示存在可行的文化l . monocytogenes9(23日68%)的38个样本分析,3(33岁,33%)的浓度> 100 cfu / g。PCR检测了12l . monocytogenes积极的样本。Semipreserves aw(水活动)和pH值l . monocytogenes增长是唯一积极的微生物和PCR测试结果。温度是一个重要因素,因为它限制了增长l . monocytogenes,包括与潜在的高竞争力产品微生物的指控。四种不同血清型是恢复和ribotyping有助于突出的基因变异l . monocytogenes紧张的食物。这种支持的假设l . monocytogenes继续进化基因表型保护不利。
1。介绍
l . monocytogenes是一种细胞内病原体尤其是食源性,可能引起所谓的李氏杆菌病。一旦摄入,l . monocytogenes可以穿透肠内皮屏障,胎盘或hematoencephalic障碍(1,2]。组在感染疾病的风险较高,年轻人,老人,(超过65),孕妇,和免疫妥协的人,YOPI创造的缩写De凯撒et al。3,4]。在健康受试者,l . monocytogenes会导致肠胃炎发作和发烧5,6]。
李氏杆菌病是一种罕见的疾病,其发病率在人类范围在0.1和11.3之间情况下/百万[7),具有高死亡率,高达30%的最危险类别(YOPI) [8]。根据欧洲食品安全署2010年的报告,欧洲的发生率3例/百万居民的9]。因为潜伏期可以跨越从3到60天,这种疾病通常很难跟踪,因为它是不容易隔离负责感染的食物。欧洲有一些证据确凿的事件尤其是在法国(10)、芬兰(11)、瑞士(12),英国(11)、比利时(13)和爱尔兰(14]。独特的耐寒的特性允许l . monocytogenes适应酸性条件和低水分活度环境,这使得一个阴险的威胁,一些种类的食物为即食食品(RTE)的特点是温和的治疗和中长期保质期通过今天的消费者——高度受欢迎的质量(15- - - - - -22]。鱼产品构成潜在风险主要包括寒冷的熏鱼,生的生牛肉片,和腌制的鱼。熏鱼产品特别是据报道引起人类感染(23- - - - - -25]。在欧洲,烟熏三文鱼,超过其他所有产品,据报道超过了允许的最大阈值限制l . monocytogenes污染(9]。
消费的风险RTE海鲜不需要原始产品的污染,经常有l . monocytogenes一样,但在低浓度时,产品的特点,及时鼓励经济增长[26- - - - - -28]。
消费者知识不足如何存储RTE食物在家里,在适当的冷藏温度,导致更高的风险l . monocytogenes增长(29日,30.]。
本研究的目的是确定的分布l . monocytogenes设立在RTE鱼semipreserves EC规定2073/2005这一类有关区分有利的食物l . monocytogenes从那些不增长。不同类型的repfed产品检查,其中包括腌海鲜沙拉(头足类动物,鱼肉酱、甲壳类、双壳类),腌虾、头足类动物和三文鱼生牛肉片,腌制鲭鱼、熏鲱鱼,和冷熏鲑鱼。
威尼托地区的包装产品销售(意大利)采样来确定的水平l . monocytogenes。产品检查包括内在的有利特性,因此适合l . monocytogenes增长,那些不利的特征( ,; 和)。测试是进行这两种类型的存储产品,在4°C和10°C,后者是一个更现实的模拟家庭条件可能会经历热滥用。每个样本单位,除了检查l . monocytogenes(定性和定量测试)也分析如下:有氧嗜中温总数,它们有着总数、总它们H2年代生产商、霉菌、酵母、乳酸细菌建立是否存在关联关系的存在l . monocytogenes此外,浓缩的培养基配方还测试了l . monocytogenes用聚合酶链反应和分离的菌株血清型和ribotyping和文化测试。
2。材料和方法
3组成的样品,每个样品单位来自生产批量,到达实验室后,在其原包装储存在冰箱里的温度4°C和10°C,直到他们保质期到期(存储在10°C的最后三分之一保质期到期)。产品保质期范围从8天(生三文鱼生牛肉片)70天(海鲜沙拉)。在不同的交易员在收集阶段,只有样品,没有超过有效期限的一半被认为是。所选择的产品都是国家和国际产品从9不同的商店。到达实验室,一个样本单位立即检查,另外两个是到期的最后一天。总共38样本分析,总共114个样本单位。
2.1。微生物分析
(我)有氧嗜中温总数在琼脂板孵化在好氧生活30°C 72小时(ISO 4833:2003)。(2)铁平皿上耐寒的总数(Lyngby)孵化在好氧生活15°C为7天。(3)它们产生硫化氢总数在铁盘子(Lyngby)孵化在好氧生活15°C为7天。(iv)算上霉菌和酵母的玫瑰红氯霉素琼脂板与孵化在好氧生活25°C 5天。(v)乳酸细菌依靠夫人琼脂板与孵化(最后的pH值6.4)好氧生活在30°C 72小时。(vi)l . monocytogenes指望ALOA琼脂在37°C 48小时(ISO 11290 - 2:1998 / Amd 1 2004)。(七)检测l . monocytogenesALOA琼脂和PALCAM琼脂板上37°C 48小时后选择性浓缩一半弗雷泽和弗雷泽肉汤(ISO 11290 - 1:1996 / Amd 1 2004)。
定量和定性的方法进行同时,相同的一天。
2.2。化学和物理分析
(我)pH值测量使用梅特勒-托利多议员220仪器,温度自动补偿。(2)水活动使用Rotronic 29539 (ISO 21807:2004)工具。
2.3。基因组DNA提取
检测l . monocytogenes包括服用1毫升的浓缩肉汤(弗雷泽一半),孵化24小时后,提取DNA,进行后续的PCR检测Listeriaspp和l . monocytogenes。DNA进行提取颗粒,离心后获得浓缩肉汤(2000 g 2分钟,其次是12000 g surnatant 5分钟)。一旦surnatant删除,添加了PBS和16000克接受了另一个离心2分钟。GenElute细菌基因组DNA迷你包(σ),按照制造商的说明,方案对革兰氏阳性细菌。
2.4。Listerial属PCR的检测
嵌套PCR的方法被用于目标的编纂16 s rRNA基因放大产品的第一反应成为了随后的嵌套的模板反应。中使用的引物的第一反应是正向引物5′LI1 ctc猫AAA GGT广汽CCT-3′和反向引物5′U1 cag发生在20 CGG TAA TWC-3′(31日]。反应发生在最后一个25的体积μL浓度1 x GeneAmp PCR缓冲II(应用生物系统公司),MgCl 1.5毫米2,每个核苷酸的0.2毫米,0.2μ两引物,1.25 U Ampli Taq DNA聚合酶(应用生物系统公司),和5μL中提取DNA。放大,热圆柱体GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统)使用温度设置在初始变性在95°C 3分钟,其次是25周期,每一个都有变性阶段在95°C 90秒,和一个退火阶段50°C 90秒和一个扩展阶段为2分钟72°C,紧随其后的是最后一个在72°C扩展阶段10分钟。嵌套使用的引物反应是正向引物5′LS1 acg ACC GCA ADG TTG AAA CT-3′和反向引物5′LS2广汽GTC ATC CCC ACC TTC CT-3′制造核酸技术实验室应用于食品史Zooprofilattico Sperimentale布雷西亚。的反应是准备在最后一卷25μL浓度1 x GeneAmp PCR缓冲II(应用生物系统公司),MgCl 1.5毫米2,每个核苷酸的0.2毫米,0.2μM的底漆,0.75 U Ampli Taq DNA聚合酶(应用生物系统公司)和2.5μL中提取DNA。热循环仪的放大GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统)是用于首次变性温度设定在95°C 3分钟,其次是35周期,每个包括变性阶段在95°C,持续30秒,30秒的退火阶段在59°C,一个扩展阶段在72°C,持续30秒,紧随其后的是最后一个在72°C扩展阶段5分钟。预见放大的分析,进行了301个基点,在琼脂糖凝胶电泳后沾2.5%溴化乙锭(最终浓度凝胶:0.5μg / mL),通过暴露于紫外线辐射。
2.5。l . monocytogenesPCR的检测
一个方法来检测他的基因目标(溶血性致病因素或分泌溶血素)使用了引物5′LIS1 cgg gg TTC公司治理文化AAA AGA TG-3′和反向引物5′LIS2有条件现金援助CCA GAG TGA TCG ATG TT-3′(32]。反应是准备使用结束25的体积μL浓度1 x GeneAmp PCR缓冲II(应用生物系统公司),MgCl 1.5毫米2为每个核苷酸,0.2毫米,0.2μ两引物,0.75 U Ampli Taq DNA聚合酶(应用生物系统公司)和5μL中提取DNA。放大进行了热循环仪在GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统),首次变性温度曲线设定在95°C 3分钟,其次是35周期,每个包括变性阶段在95°C,持续30秒,30秒的退火阶段在58°C和一个扩展阶段在72°C,持续30秒,紧随其后的是最后一个在72°C扩展阶段5分钟。预见放大,234个基点的分析,然后进行琼脂糖凝胶电泳后沾2.5%溴化乙锭(最终浓度凝胶:0 5μg / mL),通过暴露于紫外线辐射。
2.6。l . monocytogenes血清学分型的复合PCR (M-PCR)
血清学分型通过使用引物作为描述执行M-PCR Doumith et al。33]。引物使识别李斯特菌和菌株属于唯一的细分l . monocytogenes种类分为四个不同的血清型。
血清组1包括1/2a血清型和3;血清组的血清型2 1/2c和3 c;血清组3种血清型1/2b和3 b;血清型4 b和血清组4日,4 d和e。
PCR组合包括PCR大师混合1 x(试剂盒、米兰、意大利),混合引物(lmo0737、ORF2819 ORF2110, lmo1118和prs),无菌蒸馏penta-H2O和DNA提取。PCR反应条件包括变性在94°C的初始步骤3分钟,35周期在94°C 0.40分钟,1.15分钟53°C, 72°C 1.15分钟和7分钟最后一步在72°C。
PCR产品进行2%琼脂糖凝胶电泳分离的90 V 90分钟。然后,与溴化乙锭染色后(10 ng / ml),他们的视觉紫外线透照器。
2.7。l . monocytogenes血清学分型与Seroagglutination
血清学分型与抗血清产生了12种不同血清型的l . monocytogenes在细胞表面,和体细胞“O”和鞭毛抗原“H”。
Seroagglutination进行确认使用分子方法获得的血清型和血清型。“SEIKEN”李斯特菌抗血清工具包(Denka SEIKEN有限公司,东京,日本)使用根据Hohne Seeliger和修改方法概述了(34]。
2.8。l . monocytogenesRibotyping
积极的l . monocytogenes殖民地特征检测和使用杜邦Qualicon有限公司RiboPrinter Q系统(3,4]。殖民地从琼脂板使用塑料棒。他们悬浮在一个示例缓冲区。解决方案在85°C细胞溶解了20分钟,和两个特定的溶解剂被添加。随后,一批包含8个容器来保存8个样品是自动插入ribotyping乐器。总之,RiboPrinter生成一个酶消化使用的解决方案生态RI限制性内切酶和DNA片段的电泳被转移到膜。杂化膜就是使用一个特定的化学发光探针。最后,仪器检测发出的信号在ribotyping CCD相机和软件将图像模式。Ribotyping(物种)是一个自动化的过程如果有超过85%的样本模式类似的参考模式的数据库工具。后者取自各种国际集合(例如,写明ATCC、DSMZ或江铃汽车)和确定DUP-ID代码(杜邦公司标识)。基因型鉴定的菌株包括比较的批处理,分配给他们所谓ribogroup代码(RG)。每个ribotyped应变与数据库中的配置文件包含的所有模式。一般来说,如果有一个相似点93%的应变之间的调查和数据库,应变被分配到相应的ribogroup的概要文件。Ribogroup归因只可能如果菌株进行同步分析或分析是进行了几天后,因为数据库已更新在一个正在进行的基础上,访问国际互联网上可用的数据库。
获取系统发育树结果提取皮尔逊相关性(UPGMA方法)与BioNumerics软件6.1版。
3所示。结果
分析进行了一系列38个不同商业产品28(73例,68%)和pH值有利于增长的l . monocytogenes32%,而10(26日)不利的值(表1)。
有利的特色的28个样本病原体的生长条件下,九个是积极的l . monocytogenes(32岁,14%),根据标准的文化方法(ISO 11290 - 1:1996 / Amd 1 2004);其中,3(10 71%)值超过了限制(100 cfu / g)由欧共体注册成立。不。2073/2005。没有发现样品与不利的特点积极可行的l . monocytogenes在微生物检测。
表2说明了相应的值l . monocytogenes定性测试,定量测试和PCR结果。Listerial属存在于所有38样品分析根据放大属特定PCR反应的结果。尽管如此,该物种特定PCR证实的存在l . monocytogenes在12只样品浓缩后,其中9也发现含有病原体的古典文化测试。微生物参数表3。一般来说他们玫瑰当热虐待发生在10°C。在3样本负责> 100 cfu / g,l monocytogenes尽管增长竞争菌群的存在,乳酸和交替。尽管增加了微生物的值保质期,没有明显的产品pH值的变化值。三个样品中的证据表明,高于100 cfu / g(样本没有价值。2、8、10),两人分析热滥用后10°C(去年的第三保质期),一个被证明是不被。值得注意的是,样品的容器没有。2,结束的时候保质期膨胀,但没有不愉快的气味。其他的样品,在打开时,没有明显的感官变化。
血清学分型15孤立l . monocytogenes压力来自RTE鱼semipreserves进行了使用多重PCR分离4主要血清型(1/2a, 1/2b 1/2c和4 b)分成4个不同的组。确认单种血清型的实现与seroagglutination方法(表4和图1)。
的15株l . monocytogenes分析了来自4个不同血清型:与血清型比例最高的1/2a(73 33%),其次是血清型4 b(13日33%),1/2b(6 67%)和4 d (6 67%)。
Ribotyping的L.monocytogenes殖民地微生物测试(见表4)取得了孤立的广泛变异菌株,确定15特定菌株的基础上的物种。最弥漫型是dup - 1042,发现9个样品中(60%)。dup dup - 20243 - 1043, -DUP1052特征的菌株检查,3例(20%),2(13.33%)和1(6.66%)样品,分别。
ribogroup分布而言,rg - 568是最分散,发现9的15个样品(60%),和其他ribogroups都只有一个样本中发现,除了rg - 1296也被发现在2样本。数据从系统发育分析限制模式(图2)产生一个分类的三种主要应变组织认同ribogroup 568,是高度相关的系统,又遥远,尽管过去的4株相关分组在系统树图的上半部分。第三和最后一组包含只有一个样品,没有。3所示。这是后分析保质期4°C的温度非常不同于其他l . monocytogenes为特征。
4所示。讨论
数据表明,有一个相当低的概率L.monocytogenes超过100 cfu / g RTE海鲜分布在威尼托地区的限制,这将至少与不当存储有关的产品或热滥用。事实上,3阳性样本的38岁的2被储存在10°C在最后三分之一的生命周期内,只有一个当时有缺陷的收集。
分析结束时进行保质期提供了额外的上述数据的确认。
它们的总电荷和乳酸细菌中发现的三个阳性样品高,不同于詹姆逊的理论肯定乳酸收费应该开发一种微生物的竞争l . monocytogenes(35]。
值得注意的是,9 semi-preserves导致积极的定性的微生物测试的l . monocytogenes(在25 g)。
如果结束时保质期上述9个样本有一个< 5 cfu水平,生产者仍必须证明,用适当的测试研究和挑战,l . monocytogenes不会生长和繁殖。
我们的报告重申,烟熏和新鲜的三文鱼特别危险的产品。
在腌制产品,就三个样本的可行性l . monocytogenes。结束的时候保质期但是没有l . monocytogenes经济增长。不同于大马哈鱼,这些产品有低得多和pH值,毫无疑问会影响经济增长的因素l . monocytogenes(36]。此外,生产会有烟熏鲑鱼l . monocytogenes在原料在决赛阶段导致无法消除包装但只能包含(37]。海鲜沙拉相反,因为它们是由预煮的原材料,没有l . monocytogenes。如果有任何l . monocytogenes出现在最终产品中,这意味着污染发生后的处理阶段,经过腌制。
更多的积极分子生物学测试样品,不能孤立文化强调不存在可行的可耕种的生物体(VNC)或不再可行的细胞(38]。
PCR检测相比,文化是大大有针对性、更敏感。用于第一次浓缩汤它可能是有用的在常规实验室工作,因为至少在PCR-negative情况下它不需要微生物测试。
样品检查,所有积极的PCR检测李斯特菌,确认这些产品经常被污染的李斯特菌,但这样的情况很少演变成危险l . monocytogenes浓度。
所有的样品在不利的和pH值l . monocytogenes增长,PCR检测l . monocytogenes是负数,证实,即使在生产阶段,产品被污染l . monocytogenes会被产品的不利的环境。
M-PCR方法采用快速、可再生的和具有成本效益的。因此可以用在任何装备实验室进行分子分析。使用它但是不建议识别罕见的血清型。对分离的菌株serotype-specific分析传统sero-agglutination方法建议。后者无疑是可再生的,更加昂贵,并且需要受过专门训练的员工,但它使稀有种血清型的检测在未来几年可能会更频繁地与李氏杆菌病的病例。
引人注目的是,10的11个l . monocytogenes从鲑鱼属于1/2a血清型菌株分离,已经证实了其他科学来源(39- - - - - -41]。
凝集方法确认于单一的血清型检测与M-PCR凸显了一种罕见的属于4 d血清型的菌株之间的隔离。
罕见的血清型与流行病的爆发,在芬兰的一项研究证实Maijala等人(2000年11]。流行病的李氏杆菌病造成的压力l . monocytogenes血清型3,隔离在包装黄油,描述了。疫情爆发影响25人,造成6人死亡。
图2显示压力的变化环境中突显出需要开发方法,可以评估致病性的描述,因为相同的菌株可能对应于不同的致病性。
事实上,文学文档l . monocytogenes,把它看作是一个无处不在的微生物能够适应不同的环境条件42]。然而,尽管各种基因型和鉴定报告(43,44),仍然有很少的经验证据的相关性在食品和随后的病态消费产生的人类。这应该鼓励更充足的分子鉴定提供信息的使用,甚至在流行病学级别,分配l . monocytogenes环境中,虽然维持表型同质性,经历了持续的克隆进化现象小,但意义重大,基因组变异。
此外,有趣的是,4株分组在系统树图的上半部分确认为1296年RG, RG 1369, RG 1533 0都隔离在样品分析时间。而ribogroups 564、568和1340都不是孤立的样本分析的开始以及结束的时候保质期期间,这表明,后者可能更耐时间不同的储存条件。
因为测试样品的数量相对较少,这项工作应该被视为一个初步研究。结果应该确认方面作进一步研究不同类型的产品和增加样本的数量。
5。结论
温度在预防的发展中扮演着重要角色l . monocytogenes。事实上,冷藏链并不总是受人尊敬的特别是在几周的产品保质期这个报告的产品,这可能是受到温度变化不带来任何明显的感官变化。生产企业必须牢记这一点证明他们的产品时,使用挑战测试建立安全的产品是如何的l . monocytogenes。他们还必须预见温度测试,特别是熏鲑鱼等产品,传统上来自北欧国家平均气温低于国家像意大利冷链管理也有更少的困难。
产品和pH值的特征l . monocytogenes增长是唯一导致积极的微生物和PCR测试工作,支持这些产品的潜在危险。
比例最高的相关血清型1/2a确认类似的调查海鲜产品和使用ribotyping展示了基因变异的遗传特性l . monocytogenes压力也在这样的食物。这种特色可以有趣的有关l . monocytogenes在不同的存储条件下生存的能力。
近30年以来已经过去了加拿大Schelch [45)表明,l monocytogenes通过受污染的食物可以感染人类。此后大量的研究提供了数据在这个病原体。目前很多了解发病机制在人类和抵抗能力和生长在不同类型的食物。
正当定义为一个“进化的病原体”布莱恩(46],它改变其表型和基因型特征outside-induced压力条件下,酸性物质,新的添加剂,食品行业的食品技术创新应用。后者,当生产所有最新的食品,必须不断监视他们多才多艺的病原体。在串联教育运动的消费者可能会接触到l . monocytogenes必须提供一般规则和指导方针为适当的储存食物和准备食物在国内环境。