多态放大输入序列和Pulsed-Field凝胶电泳产生类似的结果的应变类型多样化的牛大肠杆菌O157: H7隔离

文摘

多态放大输入序列(拍),pcr大肠杆菌O157: H7 (O157)应变输入系统,目标insertions-deletions和单核苷酸多态性Xba我和Avr的第二限制性内切酶网站,分别和毒力基因(stx1,stx2,运算单元,hlyA)O157基因组。在这项研究中,拍的歧视O157隔离与牛相关的评估。25牛O157隔离的深入比较,从不同的地理位置在美国西北部,显示,大约85%的这些隔离共享相同的dendogram进化枝拍和pulsed-field凝胶电泳(但是脉冲场凝胶电泳的出现),无论限制性内切酶的目标网站。皮尔森相关系数,r,估计大约0.4,0.3和0.4Xba我,Avr的分别II-based和combined-enzymes拍,但是脉冲场凝胶电泳的出现相似,表明这些概要文件共享一个好但不是高度相关,预期推理的两种技术区分不同。隔离,不同分组使用拍更好地匹配他们的位置。总的来说,拍歧视牛O157隔离没有解释偏见或复杂的分析软件,和有效的补充而不是复制但是脉冲场凝胶电泳的出现。以其快速的周转时间,拍很有可能作为一个方便的工具,早期的流行病学或食品安全调查,使快速通知/实施检疫措施。

1。介绍

大肠杆菌O157: H7 (O157)原因估计有63153国内获得食源性疾病,在美国每年2138人因病住院,20人死亡(1- - - - - -7]。虽然O157下降44%病例被报道的2010年,在过去的六年里至少有13个不同的多态O157疫情发生,其中有许多有直接联系牛肉或可能产生污染的肥料6,7]。实际上,牛是人类病原体的主要储层(2- - - - - -4),通过食物来源大多数人类感染发生,牛派生(未煮熟的汉堡)或被牲畜粪便污染,如沙拉蔬菜,水,苹果酒,未经高温消毒的牛奶。与当前机械化和全球化趋势在食品生产和分配,需要监控生产等食源性病原体O157继续保持广泛的预防暴发的关键,是快速流行病学监测识别和消除潜在来源的食物链。

Pulsed-field凝胶电泳(但是脉冲场凝胶电泳的出现)的菌株类型方法的选择,经常使用的诊断和流行病学实验室O157菌株类型。为了克服标准但是脉冲场凝胶电泳的出现方法的缺点,已经实现了一些修改,试图解决的问题,限制酶抑制作用,DNA降解,在凝胶电泳模式变化,不当解决消化DNA,主观的解释这些模式即使有复杂的模式识别计算机软件,最重要的是减少周转时间从3到4天的时间在24 h,所以及时提供数据(8- - - - - -12]。即使所有的修改,指出单项限制酶但是脉冲场凝胶电泳的出现给了一个可怜的遗传相似度的度量它不解决整个曲目限制消化后产生的DNA片段(13]。

因此,这导致其他genome-sequence-based技术的整合,如茎茎序列类型(MLST)和/或可变数目串联重复序列分析(MLVA),结合但是脉冲场凝胶电泳的出现或者本身类型O157隔离。然而,即使这些方法不能加快这一进程,因为它们主要依靠一代的DNA测序质量,分析多个基因或串联重复序列之间的距离,这需要复杂的仪器,和解释软件(14,15]。因此,所有这些技术都是有用的在详细,全面的分析跟踪交叉引用,和银行的目的,而不是“第一反应”工具来快速解决连接和分离的情况下/在爆发的情况。

在先前的研究中,降落pcr O157菌株类型系统的多态性Xba我和Avr的II-restriction网站,放大四毒力基因O157基因组标准化对46 O157来自不同来源的隔离和爆发16- - - - - -18]。这个系统被称为多态放大输入序列(拍)不仅能够提供一个DNA指纹,也提供毒性资料检查O157隔离。拍不歧视只有限制性内切酶位点是目标之一,但在上面的组合表示中,块匹配相关隔离比但是脉冲场凝胶电泳的出现而区分隔离无关(16- - - - - -18]。

在这项研究中,我们决定对一组不同的评估拍牛O157隔离和比较生成的配置文件,但是脉冲场凝胶电泳的出现相同的模式,在长度。为此,我们针对相同的限制性内切酶组合网站。虽然直接拍各种限制性内切酶的多态性网站,但是脉冲场凝胶电泳的出现和分析这些多态性的DNA片段生成的结果,我们想确定两种技术之间的相似程度,并确定如果拍将继续保持联系的能力/歧视牛人力隔离隔离就像早期的研究(18]。

2。材料和方法

2.1。细菌

25 O157牛隔离各农场在美国西北地区(爱达荷州、华盛顿和俄勒冈州)从集合维持在这个领域获得疾病调查单位,兽医学院,华盛顿州立大学普尔曼,佤邦。识别代码用于每一个隔离是显示在表1。

2.2。拍

使用条件和引物PCR是如前所述[16- - - - - -18]。简而言之,殖民地的溶解产物O157菌株进行了测试与个别引物对,使用热启动PCR技术(19)结合降落PCR概要文件(20.]。创建这个概要文件,一个放大的20周期设置退火温度开始在73°C到着陆在53°C这些周期的结束。然后,另一个放大10段周期设置,使用最后的退火温度53°C。每个反应是一式三份完成确认配置文件生成的。引物对针对8多态XbaI -和7个多态Avr的II-restriction酶网站,和四个毒力基因编码志贺毒素1 (),志贺毒素2 (),Intimin -γ(运算单元)和hemolysin-A (hlyA),使用[16- - - - - -18]。PCR反应是使用QIAquick纯化PCR净化设备(试剂盒,瓦伦西亚,Ca),和所有的反应,除了那些放大毒性基因,与合适的限制性内切酶消化(新英格兰生物学实验室,贝弗利,Ma)确认的存在限制网站内扩增子决议之前4%的琼脂糖凝胶。

之前存在与否的扩增子记录(17,18]。短暂,毒性基因扩增子的存在被记录为“1”(作为限制性内切酶的这些缺少的网站正在测试)和“0”的扩增子的缺席。PCR针对多态Xba我限制网站,存在的扩增子被记录为“2”(所有的扩增子可以被消化成2酶裂解后的碎片Xba我限制性内切酶)和“0”在缺乏一个扩增子。同样,对PCR瞄准Avr的II限制网站存在的扩增子被记录为“1”,如果扩增子没有Avr的二,如果扩增子有一个“2”Avr的二世的网站,导致它被消化成2酶裂解后的碎片Avr的II限制性内切酶和“0”缺席的扩增子(18]。

2.3。但是脉冲场凝胶电泳的出现

标准但是脉冲场凝胶电泳的出现方法被用来分析25牛隔离(如前所述)(13,18]。短暂,每个孤立的基因组DNA嵌入在单独的琼脂糖插头和消化在37°C与30 U (2 hXba我或左右我(Avr的(二)(Gibco BRL、大岛,纽约)插头。插头被加载到1% agarose-tris缓冲凝胶(SeaKem黄金琼脂糖;缅因州BioWhittaker分子应用,罗克兰),但是脉冲场凝胶电泳的出现表现了一个厨师Mapper XA装置(Bio-Rad实验室、大力神、加州)。DNA电泳18 h的恒定电压200 V (6 V /厘米)、脉冲时间的2.2到54.2年代,电场120°角和温度14°C,之前与溴化乙锭染色。凝胶图像分析了使用Bionumerics(应用数学、Saint-Martens-Latem、比利时)。

2.4。数据分析

(我)拍dendograms: dendograms由编码分子数据如前所述16- - - - - -18]。简单地说,每15个扩增子的存在与否(代表8多态Xba我和7多态Avr的II网站)是一个二分变量编码为。角色代表网站被限制的收益或损失Avr的二是加权,以反映失去比得到一个网站的概率增加;然而,这样的权重结果dendogram没有影响。树构造使用未加权的pair-group与算术方法意味着(UPGMA)选项在系统发育分析使用吝啬(PAUP;Sinauer Associates Inc .,出版商,桑德兰,Ma)。(2)但是脉冲场凝胶电泳的出现dendograms: dendograms用UPGMA聚类分析建立了基于骰子系数Bionumerics进行,Xba我和Avr的II-based但是脉冲场凝胶电泳的出现模式(21]。结合骰子系数被用于生成Xba我和Avr的II-combined-PFGE dendogram。(3)相似之处:Bionumerics是用来确定骰子相似性系数但是脉冲场凝胶电泳的出现条带模式如前所述,使用公式,,在那里匹配的乐队和a + b =乐队(匹配和nonmatching)总数相比O157两两之间的隔离(13,21]。对拍,这个系数是手动为每一对分离提取使用修改后的公式,。标记的总数相比O157两两之间的隔离是12Xba我拍,11Avr的II-based拍,包括毒性基因。骰子相似性系数但是脉冲场凝胶电泳的出现和拍被用来计算皮尔逊相关系数的散点图如图所示。

3所示。结果

3.1。拍25牛O157分离株的筛选

所有O157隔离多态进行了分析Xba我和Avr的II-restriction网站以及毒力基因。相互独立的,Xba我拍了10个不同的配置文件,而Avr的II-based拍6个不同的配置文件(表生成2(一)和2(b))。然而,随着四毒性基因组合,拍分析导致15个不同的概要文件证明歧视正如前面观察到的增加(表3)[18]。这些不同的概要文件被聚集成更小的,相关的演化支在PAUP dendograms生成。如数据所示1(一),2(一个),3(一个),Xba我,Avr的II-based,结合生成拍5 3和7演化支,分别。有趣的是,五拍资料,1、2、3、4、11(表3),2,拍资料一样19日18日,16日和8日分别观察前面分析46无关O157隔离与人类疾病相关的18),这可能是反光的单克隆O157隔离尽管其分化为多个应变类型(22]。

3.2。但是脉冲场凝胶电泳的出现分析25牛O157隔离

如数据所示1 (b),2 (b),3 (b),但是脉冲场凝胶电泳的出现分析25牛O157隔离产生了复杂的基因组DNA电泳模式。隔离是传统上基于分组的乐队是否差异(相同,与1 - 3波段差异密切相关,与4 - 6乐队更远亲差异)(数据未显示),或根据骰子分组相似系数,生成的dendograms Bionumerics表示相似度很高的隔离。使用后者配置,Xba我但是脉冲场凝胶电泳的出现产生6演化支来自23个不同的DNA条带模式,Avr的II-based但是脉冲场凝胶电泳的出现产生7演化支从22个不同的DNA条带模式,并结合但是脉冲场凝胶电泳的出现产生9演化支。

3.3。拍有很好的相关性,但是脉冲场凝胶电泳的出现,同时保持其独特的识别功能

dendograms生成的比较显示,大约85%的牛O157隔离形成类似的组拍,但是脉冲场凝胶电泳的出现,而不管Xba我(84%相似的组),Avr的II-based(84%相似的组),或基于酶的结合(88%相似的组)。然而,两种方法之间的内在差异反映当骰子相似性系数受到皮尔逊相关系数分析。皮尔森相关系数,r,估计大约0.4,0.3和0.4Xba我,Avr的分别II-based和组合拍,但是脉冲场凝胶电泳的出现相似(图4)。这显然表明这些概要文件共享一个好如果没有高度的相关性。这可能是反射的两种技术不同的方式评估同样的限制酶位点多态性;拍直接确定存在/没有/其他变化在这些网站,但是脉冲场凝胶电泳的出现时评估结果的数量和尺寸变化产生的基因组DNA片段post-digestion相同的限制性内切酶。

更积极的相关性的观察Xba我,Xba我和Avr的比的II-combined-PFGE和拍配置文件Avr的II-based概要文件,表明后者也许是更多的歧视。事实上,多态性Avr的II限制性位点和毒力基因的存在/没有拍的歧视性的能力增加。虽然我们不能排除无法解决模糊模式由于comigrating乐队或半消化状态的虚假的乐队,但是脉冲场凝胶电泳的出现,这个观察拍贷款支持的一些歧视看到与但是脉冲场凝胶电泳的出现(17,18]。因此,两种类型的技术似乎是相辅相成的同时保持自己的区别的特征。

4所示。讨论

本研究的目的是比较的结果Xba我,Avr的II-based和combined-PATS相似分析使用但是脉冲场凝胶电泳的出现,牛O157 25日收集来自不同地理位置来确定这两个菌株打字技术联系和区别牛隔离以类似的方式与之前报道人类隔离。Xba我,Avr的II-based,结合生成拍5 3和7演化支,分别反映了单克隆O157(数字1(一)和2(一个))。观察一个类似的趋势Xba我(6演化支),Avr的II-based(7演化支),结合(9演化支)但是脉冲场凝胶电泳的出现资料根据骰子的相似性系数(数字1 (b)和2 (b))。生成演化支与华盛顿州combined-PATS分组大部分分离单独的集群和爱达荷州穿插隔离来自俄勒冈州(图3(一个))。虽然combined-PFGE-generated演化支没有确切的方式分发隔离combined-PATS,大约85%的隔离保持类似的分布(图3 (b))。作为隔离的这是一个随机研究,我们无法确定是否有转移的动物,饲料或其他农场相关货物在俄勒冈州和其他2个,可能造成O157隔离是密切相关的21]。然而,在一个流行病学情况,这将是一个合理的原因来验证这样的交换。

但是脉冲场凝胶电泳的出现是目前所使用的标准菌株打字技术不同的流行病学,诊断实验室估计爆发的亲缘或院内O157和其他细菌隔离(12,23]。与其他菌株相比打字方法被使用,但是脉冲场凝胶电泳的出现确实提供了相对独特的概要文件在多个血清型菌株成为一个受欢迎的应变输入工具。然而,挑战尤其是在使用但是脉冲场凝胶电泳的出现是众所周知的,不适当的消化和解决DNA乐队,comigration类似大小的DNA片段和nonhomologous DNA,电泳条件的变化或分析软件,导致“untypeable”或不正确的配置文件无法解释或[相比8- - - - - -11,13,24]。这些缺点导致了若干措施使但是脉冲场凝胶电泳的出现在实验室协议更加统一,建议使用附加的限制性内切酶,加速周转时间(13,23,25- - - - - -29日),和使用其他DNA序列并行输入系统确认的有效性观察但是脉冲场凝胶电泳的出现。然而,这些变化继续阻碍简化这个过程。及时评估遗传相似度是至关重要的任何流行病学调查。但是脉冲场凝胶电泳的出现和DNA-sequence-based打字系统依赖于昂贵的仪器和软件解释数据,这使他们更有用,在详细分析和银行业的病原体。,然而,一个快速和简单的技术有足够的权力来区分隔离没有技术和主观偏见将有助于追踪来源和加速的过程整理连接和分离的情况下/在爆发的情况。这种技术需要补充但是脉冲场凝胶电泳的出现,而不是重复或呈现过程变得更加繁琐。

在这项研究中,但是脉冲场凝胶电泳的出现和combined-PATS可比歧视性的能力,和两个限制性内切酶的使用可能增加了观察到的相似之处。O157隔离,共享同一块组也陷入了同样的进化枝,但是脉冲场凝胶电泳的出现。一些O157隔离,落入不同群体/演化支使用两种技术更好的与他们的位置拍支持可能过度歧视但是脉冲场凝胶电泳的出现。正如前面看到的(18),拍是可靠、简单、用户友好的和容易执行和解释在这个实例中。因为拍pcr技术,直接地址在限制性内切酶多态性(Indels或单核苷酸多态性)网站,它消除了需要广泛的电泳、序列分析、解释结果和软件,从而使其成本效益。拍继续保持其作为观察typeability高、重现性好之前(18]。基于这些观察,似乎拍将是一个理想的“第一反应”的流行病学工具。我们在评估的过程中拍的可靠性在“盲研究”的细节O157类型将被扣留,直到研究结束时,以确保一个典型领域的情况。我们也拍其他应用的不断深入,牛血统的人类病原体如志贺毒素的产生大肠杆菌(stec),而寻求选项自动化过程,从而进一步减少周转时间小于6 - 8小时。

确认

本研究支持部分由格兰特合作协议数量U60-CCU303019-15疾病控制协会中心的公共卫生实验室和i t·s . b . Calderwood这项工作的部分也支持由医学中心的集成和创新技术(得到),通过美国陆军医学研究和装备司令部合作协议号码damd17 - 02 - 2 - 0006,奖:s . b . Calderwood i t·库和m .约翰美国实用专利未决PATS-a菌株打字技术(11月1日,2001)。m·a·戴维斯和c . j . Hovde工作的支持,在一定程度上,由爱达荷州农业实验台,美国农业部授予04 - 04562,和公共卫生服务国家卫生研究院的基金P20-RR16454 (NCRR)和P20-GM103408(美国)。本文提到的贸易名称或商业产品是专为提供具体信息,并不意味着美国农业部推荐或认可。美国农业部是一个平等机会提供者和雇主。

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