直接定量探测和识别Lactococcal噬菌体从牛奶和乳清实时PCR:申请检测Lactococcal噬菌体在山羊的生牛奶乳清在法国

文摘

的存在Lactococcus噬菌体在牛奶可以部分或完全抑制牛奶发酵。防止问题噬菌体、实时PCR是在这项研究中开发的直接检测从乳清和牛奶的三类Lactococcus噬菌体c2, 936年,P335。优化的DNA提取协议从复杂的矩阵如乳清和牛奶是优化允许PCR的扩增没有任何矩阵和不属预定目标的污染物的干扰。实时PCR程序具体的检出限10²空斑形成单位/毫升。曲线斜率−3.49−3.69,和3.45−放大效率约为94%,94%,98%,相关系数(),0.999,0.999,0.998,c2,分别为936人和P335集团。这种方法被用来检测噬菌体在乳清和山羊的原料奶来自三个农场位于阿尔卑斯大区区域(法国)。

1。介绍

原料奶是一个复杂的微生物生态系统包含不同的微生物,破坏细菌、病原体和技术植物如乳酸菌。最后一个细菌参与奶酪生产过程和成熟1]。原料奶也可能含有的乳酸菌噬菌体可能存在的风险在乳制品加工。乳酸菌可能由噬菌体感染导致较慢的酸化过程或终点(2]。一些植物的消失可能修改成熟过程。噬菌体可以造成环境的污染,原料奶,机器,空气中的细菌。此外,一些噬菌体的菌株对巴氏灭菌法(3]。

第一次发酵后的乳清分离可用于下一个发酵奶酪制作,(老酵)。这种做法允许大量的微生物菌群的繁殖技术(4]。但这种做法可能繁殖噬菌体的污染也怀疑是酸化事件的一个原因,尤其是奶酪加工使用原料奶(1,3]。似乎必须确定噬菌体的生物多样性在生牛奶和乳清了解事件相关酸化。

在最重要的乳制品株噬菌体的多样性(乳酸链球菌,乳酸菌,Lactococcus)研究了在几个国家:加拿大5),在西班牙6在阿根廷),(7在白俄罗斯],[8]。在这些研究中,lactococcal噬菌体主要是学习了Lactococcus lactis应用在许多过程。三个主要裂解lactococcal噬菌体组确认:c2, P335, 9365]。

lactococcal噬菌体的存在在牛奶和乳清被各种方法:检测到直到现在,双层,通量血细胞计数(8- - - - - -10]。这些噬菌体的识别可以通过PCR和多重PCR。噬菌体是第一个从牛奶和乳清分离的双层琼脂板的方法。然后接种M17星云和噬菌体传播可能集中聚甘油的PCR分析或电子显微镜。

实时PCR作为快速和敏感技术直接检测和识别微生物。最近发明的这项技术就是从空中探测c2和936噬菌体组。实时PCR尚未被开发使用直接识别和量化lactococcal噬菌体从牛奶和乳清样本。实时PCR的一个挑战是DNA提取的优化复杂的矩阵如牛奶和乳清。提取步骤应该最大化的病毒基因组和消除压抑PCR反应。引物PCR条件的选择也很重要。在目前的工作,我们开发了一个实时PCR直接检测和量化的三组lactococcal噬菌体在牛奶和乳清样品使用非特异性荧光染料SYBR绿色。这项技术应用于检测噬菌体在山羊的生牛奶和乳清收集在法国。到目前为止,应该注意的是,检测噬菌体尚未研究乳清和山羊牛奶在文学。

2。材料和方法

2.1。细菌菌株和噬菌体

在这项研究中使用的噬菌体和细菌菌株是列在表中1。细菌菌株Lactococcus lactis在M17汤补充0.5%乳糖培养30°C。

2.2。噬菌体乘法和滴定法

文化添加了噬菌体的宿主细菌在早期固定相()。的文化感染噬菌体悬浮液被孵化30°C 5 h。复制后,噬菌体暂停接种在4°C一夜之间被离心机之前15分钟(5000克)。上层清液的净化的细菌通过无菌过滤膜过滤器(0.22μ米,微孔)。噬菌体的浓度由双层琼脂层空斑实验量化方法(8]。初始浓度噬菌体股票约10⁹空斑形成单位/毫升(PFU:空斑形成单位)被储存在4°C。

2.3。开发噬菌体DNA的提取协议从牛奶或牛奶乳清

噬菌体的DNA的提取协议是基于QIAamp DNA凳子迷你工具包(Quiagen 51504)以下修改:一毫升的样品(牛奶或乳清或纯培养)孵化于5毫升的缓冲美国手语(Quiagen)在70°C 10分钟。样品是由涡前1分钟离心均质(5000克,5分钟)。上层孵化的InhibitEX 1分钟25°C是在5000 g离心5分钟。上层清液混合1体积的异丙醇(−20°C)。样品在5000 g离心5分钟。上层清液被丢弃,颗粒在200年暂停了一次μ美国手语和200 L的缓冲区μ缓冲AL L (Quiagen)和蛋白酶K 70°C的10分钟。绝对乙醇添加(卷/期)。的样本继续步骤13日协议的隔离QIAamp DNA凳子迷你工具包。双洗脱使用DNA提取μL缓冲AE。

2.4。实时聚合酶链反应

2.4.1。优化引物浓度

引物选择根据克鲁兹马丁et al。11)(表2)提供从σ(法国)。来确定最优的浓度在PCR引物,初步测试是由结合在决赛三引物浓度:200年,400年和800海里不同杂交温度:55岁,58和62°C。

2.4.2。实时PCR条件

放大和检测进行Minicon系统(Bio-Rad、法国)。PCR反应混合物包含12.5μL SYBR绿色PCR反应混合液(Quiagen、法国),9日,5μL的水,1μ每个引物(0.4 LμM作为最终的浓度),1μ在25 L的DNAμL最后的体积。下列条件下的反应是:98°C 30秒和40 95°C的周期15秒,30秒62°C。

所有样本自动处理熔化曲线放大DNA分析使用软件排名经理,1.5版本(Bio-Rad)。标准曲线是由策划的Ct(周期阈值)值实时PCR进行稀释系列的DNA。积极的和消极的控制被添加在每个试验。斜率(年代)的标准曲线是用来确定PCR效率(E)符合(12]。传统PCR扩增的DNA被[6]。

PCR产物分离在TAE缓冲2%琼脂糖(40毫米Tris-acetate 1毫米EDTA),在紫外光照射下与溴化乙锭染色和可视化。

2.4.3。实时PCR在纯文化

噬菌体的股票10⁹空斑形成单位/毫升稀释10点⁰到10⁸空斑形成单位/毫升。1毫升每个浓度的提取是通过使用上述协议,和实时PCR协议使用。

实验重复了一式三份。

2.4.4。特定PCR

提取和PCR是用1毫升的噬菌体针对10⁵空斑形成单位/毫升和10⁷空斑形成单位/毫升的噬菌体。放大,Ct值和琼脂糖凝胶混合噬菌体和股票之间的比较一个噬菌体在同一浓度。

实时PCR的检测验证了与其他噬菌体,P2和c2集团bIL67 sk1和P270 P335集团和P008 bIL170 936组。

2.4.5。实时PCR在人为污染乳清样本

噬菌体的存在从乳清收集的一个农场被点检测方法。乳清没有噬菌体是人为污染的三种噬菌体c2, P335, 936后。噬菌体的纯培养10⁹空斑形成单位/毫升稀释10点¹到10⁸空斑形成单位/毫升M17星云。100年μ每个稀释于900年添加的LμL的乳清乳清人为污染的噬菌体在不同浓度:10⁰到10⁷空斑形成单位/毫升。提取1毫升的乳清人为污染和1毫升的纯文化在同一浓度的噬菌体是使用上述协议完成。评价矩阵的干扰,获得的Ct值的检测不同浓度的噬菌体在纯文化比较与价值观获得乳清中的相同浓度的检测。评估提取协议的性能,获得的Ct值提取系列稀释10倍的纯培养10点⁸空斑形成单位/毫升与Ct值获得十倍的稀释系列股票的DNA提取10⁸空斑形成单位/毫升。

实验重复了一式三份。

2.4.6。检测Lactococcus噬菌体在乳清和羊奶

实时PCR应用于检测噬菌体的存在在乳清和山羊的鲜奶收集三个农场阿尔卑斯大区区域(法国)。牛奶收集来自不同天用于乳酸发酵奶酪生产。收集的乳清发酵后与原料奶混合发酵(老酵)。

受到污染的牛奶或乳清样本最多的噬菌体被用来分离噬菌体。噬菌体感染是由现场测试方法通过使用宿主细菌在表1和Lactococcus lactis菌株分离生牛奶收集以上细菌隔离(数据没有显示在这个研究机密的存在)。噬菌体的隔离是由双层根据Quiberoni et al。7]。孤立的噬菌体的识别验证了复合pcr (6]。

3所示。结果

3.1。实时聚合酶链反应

测试进行的噬菌体c2与牛奶中的集团主要产业。噬菌体的类似的数据获得936和P335没有显示。

3.1.1。实时PCR条件

聚合酶链反应的最优条件的第一次测试是在连续10倍稀释的DNA噬菌体c2在不同的杂交温度:55岁,58岁,62°C和200年通过使用不同浓度的引物,400和800海里。斜率的结果(年代),功效放大(E),方相关系数(每个温度有表3。杂交温度为62°C和400 nM扩增的引物给最好的结果。平方相关系数估计与斜率接近0997−3475和94%的放大效果。测试被执行936年和P335噬菌体的DNA。这个程序应用于检测噬菌体在纯文化。

3.1.2。检测噬菌体在纯文化

每组的标准曲线建立了噬菌体。Ct值之间的线性关系是观察和噬菌体的起始量测量与双琼脂层空斑实验方法。为每个组的噬菌体,提取和实时PCR进行一系列的稀释10⁸到10⁰空斑形成单位/毫升的纯文化。这些结果被用于校准曲线的实时PCR允许噬菌体量化。放大的概要文件和融化曲线获得的噬菌体c2Tm81.5°C(图1)。融化曲线显示的特异性引物使用SYBR绿色(图1(一))。的放大才发现噬菌体c2。当没有噬菌体被加入到反应管,没有获得的Ct值(图1 (b))。Ct值之间的线性关系是观察和噬菌体的数量测量双琼脂层空斑实验方法(图2)。10的量化是有限的²噬菌体/毫升。这些结果证实了琼脂糖凝胶(图3)。

曲线的斜坡,分别−3.49−3.69,−3.45相关系数(0.999)c2, P335 936和0.998。PCR扩增效率(E)被估计为93、93和95%,分别。

3.1.3。特异性qPCR

特异性PCR方法测量的能力到底是给定的噬菌体在样本不干扰矩阵不属预定目标的污染物。检测(放大和琼脂糖凝胶结果)的目标从混合物中噬菌体的三个噬菌体(c2, 936年,P335)与噬菌体的检测在纯文化在同一浓度。对于每一个实验,数量10⁵空斑形成单位/毫升的有针对性的噬菌体与其他更为集中噬菌体(10不一⁷空斑形成单位/毫升)。观察一个放大反应只有在反应管包含预期的噬菌体。图4仅显示放大曲线的叠加的c2和c2在混合三个噬菌体在同一浓度。其他噬菌体的存在并不影响放大反应。这个观察证实了凝胶电泳(图5)。这些结果证实,没有观察到干涉检测一个噬菌体时执行其他噬菌体的存在。实时PCR上面开发测试与其他噬菌体P2和c2集团bIL67 sk1 P335集团和P270 P008和bIL170 936组。相似的结果;只有目标噬菌体检测在纯文化或与其他混合噬菌体。实时PCR获得的浓度相同,通过双层方法(表4)。

3.2。检测噬菌体的人为污染乳清

评估提取的效率,一个纯粹的文化10⁸空斑形成单位/毫升稀释10倍(从10⁸空斑形成单位/毫升10⁰空斑形成单位/毫升)。Ct值获得每个噬菌体的提取浓度与Ct获得10倍稀释的DNA提取纯文化10⁸空斑形成单位/毫升。获得的相同的曲线(数据没有显示)。评价矩阵对提取协议和PCR反应的影响,获得的Ct值提取的人为污染乳清和纯粹的文化在同一浓度的噬菌体进行比较。获得的相同的曲线与人为污染乳清和纯文化没有干扰矩阵在PCR扩增(图6)。这些曲线可以用于校准。三系列稀释的纯培养和三连环乳清含有不同浓度的噬菌体,检测上限约为10²空斑形成单位/毫升噬菌体组。乳酸菌的存在在乳清验证了M17板块(结果不显示)。没有观察到细菌的影响在噬菌体的Ct值。这种表示方法的能力来衡量准确给定样本内的噬菌体不干扰矩阵不属预定目标的污染物。乳清的组成似乎并没有影响到的噬菌体扩增实时PCR作为观察牛奶(结果未显示)。

方法的重现性进行了测试在山羊的原料奶和其他乳清的牛奶样品。类似的结果(数据未显示)。

标准曲线的建立是用来检测和量化的三个噬菌体组的噬菌体Lactococcusc2、936和P335各种山羊的生牛奶和乳清。

3.3。检测的Lactococcal噬菌体在乳清和山羊的原料奶

上面的实时PCR系统开发应用于检测噬菌体在乳清和三个农场提供的原料奶阿尔卑斯大区区域。在每个农场,牛奶样品(L)编码和乳清样本收集(LS)编码在不同的日子。从1毫升的样品DNA提取,然后通过实时PCR扩增。在所有情况下,我们获得了81.5°C,融化曲线对应于噬菌体。非特异性扩增,即细菌的DNA。每个噬菌体组的浓度决定了Ct值对应于标准曲线(数据7和8)。所有样品的乳清和牛奶,除了牛奶从农场L14 B6和牛奶课时,戏,B7和L24农场,被P335噬菌体污染。发现不同浓度从10⁷到10⁹噬菌体/毫升的乳清农场B2和B6和从10⁷到10⁸噬菌体B7 /毫升的农场。乳清的pH值约为4.5。P335在牛奶的浓度低于乳清。只有噬菌体/毫升,噬菌体/毫升,噬菌体/毫升的牛奶中发现了农场B2、B6和B7。

六乳清样本和1牛奶样本共有19个样本污染弱936噬菌体的数量。只有10²噬菌体/ 936 mL的乳清中发现LS2, LS7,和农场的LS9 B2和LS3 LS16农场B6和农场的牛奶L3 B7。农场的乳清LS8 B6 936噬菌体污染(10⁵噬菌体/毫升)。噬菌体的c2组在三个样品检测:农场的乳清LS2 B2和LS15农场B7 10点²噬菌体的乳清LS8 /毫升和农场B8噬菌体/毫升。

P335集团的噬菌体主要被发现在样品与乳清更为集中。噬菌体的乳清样本LS2 LS7 B2的农场,农场的LS8 B6和孤立。c2和936年被常规PCR孤立和验证。936 c2和裂解性噬菌体与浓度检测到双层类似于实时PCR检测浓度。P335没有检测到宿主细菌之间的点方法使用。(数据没有显示)。

4所示。讨论

噬菌体的检测牛奶和乳清是必要的在发酵过程中乳酸菌的预防感染。的噬菌体Lactococcus可以通过PCR检测复合PCR和[6,13,14]。根据这些作者,噬菌体第一次被孤立的双层琼脂板的方法。噬菌体被孵化的M17 PCR和集中。这些分析的时间框架是24小时至48 h。然而,牛奶行业不能固定在整个期间的分析。实时PCR技术称为快速检测具体灵敏度比常规PCR的微生物。该方法开发的检测c2和936噬菌体集团从空中奶酪工厂15),但没有对噬菌体Lactococcus在牛奶和乳清。在这项研究中,我们优化实时PCR方法直接从乳清或牛奶使检测三组噬菌体主要发现在牛奶行业c2, 936年,P335。

引物的选择对PCR扩增至关重要。del Rio et al。6)先后进行的设计引物检测噬菌体c2的主要团体,936年,P335多重PCR。在这项研究中,我们使用这些引物PCR的验证程序实时SYBR绿色优化杂交温度和引物的浓度。提取协议当时发达的直接检测生牛奶和乳清的噬菌体。相关系数(),山坡上的曲线和PCR扩增效率获得了噬菌体的三组是类似于其他研究微生物的检测实时PCR (11,12,16]。标准曲线的斜率−3.33对应的反应放大效率值为100%。实时PCR的扩增效率检测的是可以接受的(根据Biorad)从84%到110%。

类似的标准曲线从噬菌体从人为污染的乳清中提取DNA噬菌体和来自纯文化允许估计提取的性能。事实上,牛奶和乳清是复杂的矩阵含有抑制性物质,如钙、蛋白质和脂肪导致失败的PCR扩增。因此,DNA提取的质量和纯度是主要需求pcr检测分析。提取方法是一个决定性因素对于一个成功和有效的PCR分析(17]。在这项研究中,没有观察到干涉矩阵和DNA的污染物。根据del Rio et al。6),样品在PCR反应混合物体积是至关重要的。DNA样本体积的增加可能会降低检测灵敏度,因为抑制剂浓度的增加。我们测试了增加DNA样本卷(2μL或5μL)而不是1μL在相同的最终体积反应(25μL)。没有观察到抑制PCR反应。的提取方法在这项研究中允许增加检测通过增加样本数量限制。

我们分析了Ct值从牛奶和乳清示例包含最低10²空斑形成单位/毫升在完成最后一个25的体积反应μL包含1μL的DNA样本。这个DNA样本是100年完成的μL缓冲后提取1毫升的牛奶或乳清。理论上,检出限是一个基因组复制/反应。Verreault et al。15)发现了机载c2和936种噬菌体在奶酪工厂实时PCR。这些作者发现从1到50基因组拷贝/反应(25μL) 936年从5到50基因组拷贝c2。这意味着探测范围不同空斑形成单位/毫升10⁴空斑形成单位/ 936和10毫升³空斑形成单位/毫升10⁴空斑形成单位/毫升c2。del Rio et al。6有类似的检出限。这些作者发现了Lactococcus噬菌体等复杂的矩阵的多重PCR的牛奶。检出限是10⁴噬菌体/毫升P335 c2和10³噬菌体936 /毫升。马丁et al。11开发实时PCR检测乳酸菌delbrueckii噬菌体在牛奶的检测极限10张/反应即相当于10⁵空斑形成单位/毫升牛奶中。我们研究的提取方法和实时PCR程序比先前的研究提供更好的检出限。

在样本收集来自不同农场在阿尔卑斯大区区域在不同天,P335群噬菌体主要发现。这种噬菌体组的浓度在乳清比鲜奶更重要。乳制品行业的研究噬菌体生物多样性表明,c2和936组代表最常在牛奶中发现(10,18]。有几个因素可能影响这种差异。牛奶和乳清的样本来自不同的地理区域。气候与温度的变化可以影响噬菌体的发展。乳清自然起动器的利用率可能保持噬菌体污染。另一方面,工作和卫生条件可能导致新的噬菌体的外观。对于P335,基因组组织在一个马赛克的形式。测序的数据显示,噬菌体P335共享只有10 - 33%的同源性(19]。这种遗传多样性的可能后果起细胞内基因组细菌与前噬菌体(20.]。基因组可塑性可能使P335适应一个新的环境,包括噬菌体抗性机制的5]。

乳清的pH值约为4.5,表明酸化不是存在P335摄动的高浓度。这个结果可以解释为两个假设。可能P335前噬菌体或牛奶酸酸化的乳酸细菌不被P335感染。它建议使用起动器的几个乳酸细菌的混合物可以掩盖噬菌体在酸化的影响。在这种情况下,尽管pH值不是摄动,一种或几种细菌种群可能消失在奶酪的成熟。

5。结论

总结、实时PCR使用非特异性荧光染料SYBR绿色提供了一个敏感的,具体的,可再生的,和快速的直接检测的方法Lactococcus噬菌体在乳清和牛奶。其中一个重要的步骤在我们的研究中提取出的DNA噬菌体等复杂的矩阵乳清和牛奶。允许提取的DNA噬菌体扩增消除PCR抑制剂的代理人。实时PCR检测的时间框架的研究大约2 h。

下一步将研究噬菌体的特点发现山羊生奶的感染能力和DNA资料。这也将是有趣的研究目前其他噬菌体在乳清和山羊的原料奶。

确认

作者感谢CASDA项目提供乳制品样品。作者还要感谢Sylvain Moineau拉瓦尔大学()有益的讨论。

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