原料奶是一个复杂的微生物生态系统包含不同的微生物,破坏细菌、病原体和技术植物如乳酸菌。最后一个细菌参与奶酪生产过程和成熟 1]。原料奶也可能含有的乳酸菌噬菌体可能存在的风险在乳制品加工。乳酸菌可能由噬菌体感染导致较慢的酸化过程或终点( 2]。一些植物的消失可能修改成熟过程。噬菌体可以造成环境的污染,原料奶,机器,空气中的细菌。此外,一些噬菌体的菌株对巴氏灭菌法( 3]。

第一次发酵后的乳清分离可用于下一个发酵奶酪制作,(老酵)。这种做法允许大量的微生物菌群的繁殖技术( 4]。但这种做法可能繁殖噬菌体的污染也怀疑是酸化事件的一个原因,尤其是奶酪加工使用原料奶( 1, 3]。似乎必须确定噬菌体的生物多样性在生牛奶和乳清了解事件相关酸化。

在最重要的乳制品株噬菌体的多样性( 乳酸链球菌, 乳酸菌, Lactococcus)研究了在几个国家:加拿大 5),在西班牙 6在阿根廷),( 7在白俄罗斯],[ 8]。在这些研究中,lactococcal噬菌体主要是学习了 Lactococcus lactis应用在许多过程。三个主要裂解lactococcal噬菌体组确认:c2, P335, 936 5]。

lactococcal噬菌体的存在在牛奶和乳清被各种方法:检测到直到现在,双层,通量血细胞计数( 8- - - - - - 10]。这些噬菌体的识别可以通过PCR和多重PCR。噬菌体是第一个从牛奶和乳清分离的双层琼脂板的方法。然后接种M17星云和噬菌体传播可能集中聚甘油的PCR分析或电子显微镜。

实时PCR作为快速和敏感技术直接检测和识别微生物。最近发明的这项技术就是从空中探测c2和936噬菌体组。实时PCR尚未被开发使用直接识别和量化lactococcal噬菌体从牛奶和乳清样本。实时PCR的一个挑战是DNA提取的优化复杂的矩阵如牛奶和乳清。提取步骤应该最大化的病毒基因组和消除压抑PCR反应。引物PCR条件的选择也很重要。在目前的工作,我们开发了一个实时PCR直接检测和量化的三组lactococcal噬菌体在牛奶和乳清样品使用非特异性荧光染料SYBR绿色。这项技术应用于检测噬菌体在山羊的生牛奶和乳清收集在法国。到目前为止,应该注意的是,检测噬菌体尚未研究乳清和山羊牛奶在文学。

噬菌体的检测牛奶和乳清是必要的在发酵过程中乳酸菌的预防感染。的噬菌体 Lactococcus可以通过PCR检测复合PCR和[ 6, 13, 14]。根据这些作者,噬菌体第一次被孤立的双层琼脂板的方法。噬菌体被孵化的M17 PCR和集中。这些分析的时间框架是24小时至48 h。然而,牛奶行业不能固定在整个期间的分析。实时PCR技术称为快速检测具体灵敏度比常规PCR的微生物。该方法开发的检测c2和936噬菌体集团从空中奶酪工厂 15),但没有对噬菌体 Lactococcus在牛奶和乳清。在这项研究中,我们优化实时PCR方法直接从乳清或牛奶使检测三组噬菌体主要发现在牛奶行业c2, 936年,P335。

引物的选择对PCR扩增至关重要。del Rio et al。 6)先后进行的设计引物检测噬菌体c2的主要团体,936年,P335多重PCR。在这项研究中,我们使用这些引物PCR的验证程序实时SYBR绿色优化杂交温度和引物的浓度。提取协议当时发达的直接检测生牛奶和乳清的噬菌体。相关系数( R 2 ),山坡上的曲线和PCR扩增效率获得了噬菌体的三组是类似于其他研究微生物的检测实时PCR ( 11, 12, 16]。标准曲线的斜率−3.33对应的反应放大效率值为100%。实时PCR的扩增效率检测的是可以接受的(根据Biorad)从84%到110%。

类似的标准曲线从噬菌体从人为污染的乳清中提取DNA噬菌体和来自纯文化允许估计提取的性能。事实上,牛奶和乳清是复杂的矩阵含有抑制性物质,如钙、蛋白质和脂肪导致失败的PCR扩增。因此,DNA提取的质量和纯度是主要需求pcr检测分析。提取方法是一个决定性因素对于一个成功和有效的PCR分析( 17]。在这项研究中,没有观察到干涉矩阵和DNA的污染物。根据del Rio et al。 6),样品在PCR反应混合物体积是至关重要的。DNA样本体积的增加可能会降低检测灵敏度,因为抑制剂浓度的增加。我们测试了增加DNA样本卷(2 μL或5 μL)而不是1 μL在相同的最终体积反应(25 μL)。没有观察到抑制PCR反应。的提取方法在这项研究中允许增加检测通过增加样本数量限制。

我们分析了Ct值从牛奶和乳清示例包含最低10²空斑形成单位/毫升在完成最后一个25的体积反应 μL包含1 μL的DNA样本。这个DNA样本是100年完成的 μL缓冲后提取1毫升的牛奶或乳清。理论上,检出限是一个基因组复制/反应。Verreault et al。 15)发现了机载c2和936种噬菌体在奶酪工厂实时PCR。这些作者发现从1到50基因组拷贝/反应(25 μL) 936年从5到50基因组拷贝c2。这意味着探测范围不同 2 · 10 2 空斑形成单位/毫升10⁴空斑形成单位/ 936和10毫升³空斑形成单位/毫升10⁴空斑形成单位/毫升c2。del Rio et al。 6有类似的检出限。这些作者发现了 Lactococcus噬菌体等复杂的矩阵的多重PCR的牛奶。检出限是10⁴噬菌体/毫升P335 c2和10³噬菌体936 /毫升。马丁et al。 11开发实时PCR检测 乳酸菌delbrueckii噬菌体在牛奶的检测极限10张/反应即相当于10⁵空斑形成单位/毫升牛奶中。我们研究的提取方法和实时PCR程序比先前的研究提供更好的检出限。

在样本收集来自不同农场在阿尔卑斯大区区域在不同天,P335群噬菌体主要发现。这种噬菌体组的浓度在乳清比鲜奶更重要。乳制品行业的研究噬菌体生物多样性表明,c2和936组代表最常在牛奶中发现( 10, 18]。有几个因素可能影响这种差异。牛奶和乳清的样本来自不同的地理区域。气候与温度的变化可以影响噬菌体的发展。乳清自然起动器的利用率可能保持噬菌体污染。另一方面,工作和卫生条件可能导致新的噬菌体的外观。对于P335,基因组组织在一个马赛克的形式。测序的数据显示,噬菌体P335共享只有10 - 33%的同源性( 19]。这种遗传多样性的可能后果起细胞内基因组细菌与前噬菌体( 20.]。基因组可塑性可能使P335适应一个新的环境,包括噬菌体抗性机制的 5]。

乳清的pH值约为4.5,表明酸化不是存在P335摄动的高浓度。这个结果可以解释为两个假设。可能P335前噬菌体或牛奶酸酸化的乳酸细菌不被P335感染。它建议使用起动器的几个乳酸细菌的混合物可以掩盖噬菌体在酸化的影响。在这种情况下,尽管pH值不是摄动,一种或几种细菌种群可能消失在奶酪的成熟。

总结、实时PCR使用非特异性荧光染料SYBR绿色提供了一个敏感的,具体的,可再生的,和快速的直接检测的方法 Lactococcus噬菌体在乳清和牛奶。其中一个重要的步骤在我们的研究中提取出的DNA噬菌体等复杂的矩阵乳清和牛奶。允许提取的DNA噬菌体扩增消除PCR抑制剂的代理人。实时PCR检测的时间框架的研究大约2 h。

下一步将研究噬菌体的特点发现山羊生奶的感染能力和DNA资料。这也将是有趣的研究目前其他噬菌体在乳清和山羊的原料奶。